本发明属于生物材料制备领域，具体涉及一种载基因多孔磁性微球的制备方法。
背景技术：
在肿瘤的治疗中，虽然药物治疗已经取得了很大的进展，但是固有的后天获得的耐药性仍然需要攻克，不然很难取得成功的治疗最终会导致患者死亡。此外，耐药性通常发生在化疗工程中或置于后复发的化疗中，肿瘤细胞对不同结构、类型的药物产生抗体，造成了很高的复发率，使得肿瘤更加难以治愈。许多因素参与了固有或获得多药耐药性的发生，阻碍了药物递送至靶向的肿瘤组织并且降低其对肿瘤细胞的杀伤作用，使得肿瘤细胞对药物不敏感。然而，这些耐药性最主要都是与细胞内部分基因的过表达或者不表达有着密切关联。因此为了得到更好的肿瘤治疗，发展针对不同类型肿瘤细胞的基因治疗是十分必要的策略。然而基因治疗最关键的是针对特定的靶点寻求的合适治疗基因，因为不同类型亦或不同个体形成的相同类型的的肿瘤细胞中的蛋白表达都不一定相同。
sirna是短的双链rna，只有21-23个碱基对组成，能够沉默多药耐药机制相关的基因，受到越来越多的关注。此外，sirna能够通过在体外合成并且直接转入靶细胞，或者由基因修饰的靶细胞产生，当其进入靶肿瘤细胞后，sirna可以和核酶化合物结合形成rna-介导沉默复合体(riscs)，进而与靶向的mrna互补结合，介导mrna的降解进而达到沉默特定基因治疗肿瘤的目的。而氨基改性的四氧化三铁可以通过静电吸附基因，同时使分离过程简单，有利于保护基因结构不被破坏。
肺癌成为了恶性肿瘤中最主要的致死原因。对于大多数患者而言，治疗肺癌的方式通常是化疗和放疗。然而当前肺癌治疗面临着主要的问题就是，通过常规的全身给药方式药物真正递送到肺部的效率很低，还会带来很大的副作用。而直接通过吸入式给药不需要给很大剂量能够聚集很多药物在肺部进而达到有效的治疗浓度，这也极大减轻药物对正常组织产生的极大毒副作用。在吸入式给药体系中，多孔微球是最适合用于肺部的局部给药的微球。plga为基质所制备的微球具有很好的生物相容性以及生物降解性，经常被制备成混悬剂用于注射或口服。目前，越来越多的研究都采用多孔微球作为载体，装载质粒dna、蛋白质和小分子药物等，通过吸入的方式进行肺部的局部给药。
此外，多孔结构的存在可降低微球密度，从而利用可控的微球孔径获得理想的空气动力学性质，实现雾化给药，能够实现内含物的持续与稳定释放，增大药物在肺部的积累量，有效延长药物发挥作用的时间等。因此与其他类型肿瘤相比，多孔微球更适用于肺癌的治疗。
为了克服化疗的耐药性和静脉给药对正常组织极大的毒副作用，因此本研究选用plga为基质，sirna为模型药，司盘-80为乳化剂，并且在不使用致孔剂情况下，低成本，便捷地制备了装载基因的多孔微球制剂，经可吸入式给药用于治疗肺癌。而且多孔微球通过其常见骨架材料plga的降解作用实现缓释药物的目的，且plga聚合物可最终降解为水和co2，对人体没有毒性，也没有副作用，是fda批准的可安全使用的药用高分子材料，有希望用于可吸入式给药治疗肺癌。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于基因治疗肺癌具有多孔结构控缓释药物的载体材料的制备方法。根据局部给药进行抗肿瘤的局部治疗，可以使药物有利地沉积在病变部位长时间，实现不需要很高的给药剂量，就能提高药效的目的。采用乳化-蒸发溶剂制备技术，选用plga为基质，fe3o4/sirna纳米粒子为模型药和司盘-80为乳化剂的组合，制备具有磁热疗和基因治疗协同功效的多孔磁性微球。该制备方法简便，成本低，通用性强，制备所得的多孔磁性微球具有良好的生物相容性和生物可降解性，以及能够聚集很多药物在肺部进而达到有效的治疗浓度，从而开发出一种实用的经吸入式给药治疗肺癌的载体材料。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
采用乳化-蒸发溶剂制备技术，以plga为成球基质，以fe3o4/sirna纳米粒子为模型药，以司盘-80为乳化液，经由自组装制备一种多孔磁性微球用于治疗肺癌的药物载体材料。
一种用于治疗肺癌的多孔磁性微球的制备方法，包括以下步骤：
（1）在60℃水浴加热和n2保护下，将600-1000mgfe3o4置于装有80-150ml50wt%乙醇的三口烧瓶中，机械搅拌30min，加入1-5ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，用冰醋酸调节ph到4.0，机械搅拌反应6h；反应完毕产物通过磁分离，依次用无水乙醇和无水乙醚洗至无油状悬浮物放置于干燥箱，45℃抽真空干燥，即得氨基-质子化的fe3o4纳米粒子；
（2）取10-50mg步骤（1）制得的氨基-质子化的fe3o4纳米粒子分散于盛有去离子水的烧杯中，机械搅拌下逐滴加入含有50-100μgsirna的水溶液，继续搅拌6h，去离子水洗涤，多次磁分离/再溶解，即得fe3o4/sirna复合粒子；
（3）将50-300mg的plga溶解于5-30ml乙腈中，plga的质量浓度为10%；
（4）将步骤（2）制得的fe3o4/sirna复合粒子分散于步骤（3）所得溶液中，细胞破碎仪超声1min（超声功率为30w）得到均匀溶液，作为混悬水相；
（5）在超声条件下将步骤（4）所得溶液缓慢滴加入至30-300ml司盘-80中，并按6-8%（w/v）溶于花生油作为油相溶液，细胞破碎仪超声3min（超声功率为25w）得到均匀溶液，作为混悬油相；
（6）在机械搅拌（600r/min）条件下，将步骤（5）得到的混悬油相缓慢滴加到150-800ml水相（0.4wt%pva溶液）中；随后再提高转速到1200r/min搅拌2min；
（7）将步骤（6）所得溶液于25℃水浴减压旋蒸，除去有机溶剂，外置磁铁吸附得沉淀，pbs反复洗涤除去游离未成球组分，即得到所述的载基因多孔磁性微球。
本发明的显著优点在于：
（1）本发明选用plga为成球基质，利用其具有良好成球性、体内可降解和良好的生物相容性的特点，同时使用氨基-质子化fe3o4静电吸附基因，因具有较高的比表面积，进而具有较高的核酸装载量，可以实现磁热疗和基因治疗双协同功效；
（2）本发明采用复乳化-溶剂蒸发法易装载亲水性的fe3o4/sirna纳米复合物，同时在不采用致孔剂的情况下，制备一种比较有前景的载基因多孔微球，可以降低成本，操作简便、通用；
（3）选用plga为成球基质自组装包载基因药物，利用plga多孔微球制备技术的通用性、生物相容性以及生物降解性，得到具有协同功效的多孔磁性微球，通过吸入式给药治疗肺癌。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
实施例1
（1）在60℃水浴加热和n2保护下，将600mgfe3o4置于装有80ml50wt%乙醇的三口烧瓶中，机械搅拌30min，加入1ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，用冰醋酸调节ph到4.0，机械搅拌反应12h；反应完毕产物通过磁分离，依次用无水乙醇和无水乙醚洗至无油状悬浮物放置于干燥箱，45℃抽真空干燥，即得氨基-质子化的fe3o4纳米粒子；
（2）取10mg步骤（1）制得的氨基-质子化的fe3o4纳米粒子分散于盛有去离子水烧杯中，机械搅拌下逐滴加入含有50μgsirna水溶液，继续搅拌6h，去离子水洗涤，多次磁分离/再溶解，即得fe3o4/sirna复合粒子；
（3）将50mg的plga溶解于5ml乙腈中；
（4）将步骤（2）制得的fe3o4/sirna复合粒子分散于步骤（3）所得溶液中，细胞破碎仪超声1min（超声功率为30w）得到均匀溶液，作为混悬水相；
（5）在超声条件下将步骤（4）所得溶液缓慢滴加入至30ml司盘-80中，并按6%（w/v）溶于花生油作为油相溶液，细胞破碎仪超声3min（超声功率为25w）得到均匀溶液，作为混悬油相；
（6）在机械搅拌（600r/min）条件下，将步骤（5）得到的混悬油相缓慢滴加到150ml水相（0.4wt%pva溶液）中；随后再提高转速到1200r/min搅拌2min；
（7）将步骤（6）所得溶液于25℃水浴减压旋蒸，除去有机溶剂，外置磁铁吸附得沉淀，pbs反复洗涤除去游离未成球组分，即得到所述的载基因多孔磁性微球。
实施例2
（1）在60℃水浴加热和n2保护下，将1000mgfe3o4置于装有150ml50wt%乙醇的三口烧瓶中，机械搅拌30min，用冰醋酸调节ph到4.0，加入4ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，机械搅拌反应12h；反应完毕产物通过磁分离，依次用无水乙醇和无水乙醚洗至无油状悬浮物放置于干燥箱，45℃抽真空干燥，即得氨基-质子化的fe3o4纳米粒子；
（2）取50mg步骤（1）制得的氨基-质子化的fe3o4纳米粒子分散于盛有去离子水烧杯中，机械搅拌下逐滴加入含有100μgsirna水溶液，继续搅拌6h，去离子水洗涤，多次磁分离/再溶解，即得fe3o4/sirna复合粒子；
（3）将80mg的plga溶解于10ml乙腈中；
（4）将步骤（2）制得的fe3o4/sirna复合粒子分散于步骤（3）所得溶液中，细胞破碎仪超声1min（超声功率为30w）得到均匀溶液，作为混悬水相；
（5）在超声条件下将步骤（4）所得溶液缓慢滴加入至100ml司盘-80中，并按7%（w/v）溶于花生油作为油相溶液，细胞破碎仪超声3min（超声功率为25w）得到均匀溶液，作为混悬油相；
（6）在机械搅拌（600r/min）条件下，将步骤（5）得到的混悬油相缓慢滴加到400ml水相（0.4wt%pva溶液）中；随后再提高转速到1200r/min搅拌2min；
（7）将步骤（6）所得溶液于25℃水浴减压旋蒸，除去有机溶剂，外置磁铁吸附得沉淀，pbs反复洗涤除去游离未成球组分，即得到所述的载基因多孔磁性微球。
实施例3
（1）在60℃水浴加热和n2保护下，将800mgfe3o4置于装有100ml50wt%乙醇的三口烧瓶中，机械搅拌30min，加入1.5ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，用冰醋酸调节ph到4.0，机械搅拌反应12h；反应完毕产物通过磁分离，依次用无水乙醇和无水乙醚洗至无油状悬浮物放置于干燥箱，45℃抽真空干燥，即得氨基-质子化的fe3o4纳米粒子；
（2）取20mg步骤（1）制得的氨基-质子化的fe3o4纳米粒子分散于盛有去离子水烧杯中，机械搅拌下逐滴加入含有80μgsirna水溶液，继续搅拌6h，去离子水洗涤，多次磁分离/再溶解，即得fe3o4/sirna复合粒子；
（3）将200mg的plga溶解于20ml乙腈中；
（4）将步骤（2）制得的fe3o4/sirna复合粒子分散于步骤（3）所得溶液中，细胞破碎仪超声1min（超声功率为30w）得到均匀溶液，作为混悬水相；
（5）在超声条件下将步骤（4）所得溶液缓慢滴加入至160ml司盘-80中，并按8%（w/v）溶于花生油作为油相溶液，细胞破碎仪超声3min（超声功率25w）得到均匀溶液，作为混悬油相；
（6）在机械搅拌（600r/min）条件下，将步骤（5）得到的混悬油相缓慢滴加到600ml水相（0.4wt%pva溶液）中；随后再提高转速到1200r/min搅拌2min；
（7）将步骤（6）所得溶液于25℃水浴减压旋蒸，除去有机溶剂，外置磁铁吸附得沉淀，pbs反复洗涤除去游离未成球组分，即得到所述的载基因多孔磁性微球。
以mir-34a为模型药
（1）在60℃水浴加热和n2保护下，将800mgfe3o4置于装有100ml50wt%乙醇的三口烧瓶中，机械搅拌30min，加入1.5ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，用冰醋酸调节ph到4.0，机械搅拌反应12h；反应完毕产物通过磁分离，依次用无水乙醇和无水乙醚洗至无油状悬浮物放置于干燥箱，45℃抽真空干燥，即得氨基-质子化的fe3o4纳米粒子；
（2）取40mg步骤（1）制得的氨基-质子化的fe3o4纳米粒子分散于盛有去离子水烧杯中，机械搅拌下逐滴加入含有90μgmir-34a水溶液，继续搅拌6h，去离子水洗涤，多次磁分离/再溶解，即得fe3o4/mir-34a复合粒子；
（3）将150mg的plga溶解于15ml乙腈溶液中；
（4）将步骤（2）制得的fe3o4/mir-34a复合粒子分散于步骤（3）所得溶液，细胞破碎仪超声1min（超声功率为30w）得到均匀溶液，作为混悬水相；
（5）在超声条件下将步骤（4）所得溶液缓慢滴加入至160ml司盘-80中，并按8%（w/v）溶于花生油作为油相溶液，细胞破碎仪超声3min（超声功率为25w）得到均匀溶液，作为混悬油相；
（6）在机械搅拌（600r/min）条件下，将步骤（5）得到的混悬油相缓慢滴加到600ml水相（0.4wt%pva溶液）中；随后再提高转速到1200r/min搅拌2min；
（7）将步骤（6）所得溶液于25℃水浴减压旋蒸，除去有机溶剂，外置磁铁吸附得沉淀，pbs反复洗涤除去游离未成球组分，即得到所述的载基因多孔磁性微球。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。