本发明涉及兽药盐酸阿替美唑的新应用，具体为盐酸阿替美唑作为第二代非特异性p450酶抑制剂的应用。
背景技术：
药物在体内的清除方式主要包括代谢和排泄两种途径，其中代谢转化主要依靠药物代谢酶催化。药物代谢酶包括i相和ii相代谢酶，其中i相代谢酶是主要的代谢酶，而p450酶(cyp酶)是主要的i相代谢酶，p450酶是一个超家族，其中又包含多个负责药物代谢的同工酶。药物是否经p450酶代谢清除是非常关键的adme性质之一，决定其能否成药以及潜在的临床应用前景。因此在药物发现早期阶段，应用非特异性的p450酶抑制剂作为工具药物可确定p450酶介导的代谢清除化合物在体内总清除率中的贡献，根据结果可判断化合物是否会发生基于p450酶的相互作用、是否容易出现人群代谢变异以及是否需要进一步评价和开发。作为工具药的非特异性p450酶抑制剂的先决条件是其能够非特异性地抑制所有的p450同工酶，起到化学方法敲除p450基因的作用。
1-氨基苯并三唑(1-aminobenzotriazole，1-abt)是经典的非特异性基于机制的p450酶抑制剂。1-abt本身被p450酶代谢激活后，产物能够与p450酶的血红素辅基共价结合，导致p450酶活性非特异性降低。大量的研究表明，1-abt可应用于体外和体内研究中，对人以及常用实验动物(大鼠、家兔、豚鼠等)的p450酶都具有非特异的抑制作用。常规的体外实验方法为在肝微粒体或肝细胞体系中，先加入高浓度(1mm)的1-abt及nadph预孵育15-30min后，再加入各p450同工酶的探针底物。大量体外实验证明，1-abt(1mm)预孵育后对cyp酶中多个同工酶都有较明显的抑制作用，特别是对cyp2a6和3a4，几乎能够完全抑制其作用；但对其他几个同工酶的抑制能力强弱不等(19-58％)，除了对cyp2c19和cyp2e1的抑制作用明显强于其特异性抑制剂以外，对其他几个同工酶包括cyp1a2、cyp2b6、cyp2c8、cyp2c9和cyp2d6的抑制作用都低于各自的特异性抑制剂，特别是对cyp2c9的抑制作用很弱，例如在大鼠肝微粒体体系中，50μm的1-abt仅能60％抑制cyp2c依赖的cyclophosphamide的4-羟基化反应，在人肝微粒体中1mm的1-abt仅能抑制40％左右的双氯芬酸羟基化反应。由于cyp2c9的底物大都含有羧酸基团，而1-abt缺乏羧酸阴电荷解释了部分原因，因此1-abt对cyp2c9介导的s-华法令羟基化反应的抑制能力明显高于双氯芬酸。由于很多临床药物都是cyp2c9的底物，1-abt的这种缺陷可能会明显低估cyp2c9的作用，从而造成结果的偏差。1-abt作为经典的p450酶非特异抑制剂，存在对各同工酶的抑制作用强度明显不等，特别是对cyp2c9的抑制能力较弱的问题，在实际应用时常常需要慎重考虑实验结果，必要时与其他抑制剂联合应用，为药物代谢机制研究及化合物代谢清除性质的早期评价带来极大的不确定性。
为解决这个关键问题，如能发现作用更强的非特异性p450酶抑制剂替代1-abt将是非常有意义的。
盐酸阿替美唑是具有咪唑结构的a2-肾上腺素受体拮抗剂，能迅速而有效地恢复动物的麻醉和镇静，减轻异氟烷或氯胺酮麻醉引起的不良反应。临床上常用盐酸阿替美唑拮抗美托咪定麻醉猫、犬、猪等动物引起的镇静或心动过缓，同时盐酸阿替美唑能有效地缓解右美托咪定-咪达唑仑-氯胺酮联合麻醉引起的不良反应。
技术实现要素：
本发明要解决的问题是通过筛查，寻找对p450各同工酶抑制作用均较好的p450酶非特异抑制剂作为第二代工具药，为药物筛选及药物代谢机制研究提供更好的工具药。
本发明在筛查药物相互作用潜能中发现，盐酸阿替美唑对p450酶各主要同工酶都具有明显的抑制作用，且抑制强度较高，其效果明显优于经典同类工具药1-abt，可以作为新一代p450酶非特异性抑制剂。
本发明通过在体外对三个种属(大鼠、犬和人)的肝微粒体孵育体系中，研究盐酸阿替美唑对p450主要同工酶的抑制作用，发现盐酸阿替美唑作为p450酶非特异性抑制剂明显优于经典同类工具药1-abt，表现在：
1、盐酸阿替美唑对p450酶各主要同工酶的抑制作用无明显差异，非特异性好；所述p450同工酶包括cyp1a2，cyp2b6，cyp2c8，cyp2c9，cyp2c19，cyp2d6及cyp3a4；
2、盐酸阿替美唑对p450酶的抑制作用无明显种属差异，可进行种属外推；
3、盐酸阿替美唑对p450酶抑制作用的ic50值明显低于1-abt，抑制能力强，应用剂量(浓度)小；
4、盐酸阿替美唑的理化性质好、溶解度好，稳定性好，无明显毒副作用，体外体内应用安全可靠；
5、盐酸阿替美唑对代谢酶的抑制作用是非时间依赖的，在预孵育过程中加入和不加入nadph启动反应后，盐酸阿替美唑对各cyp同工酶的抑制作用没有明显改变，提示主要是药物原型盐酸阿替美唑发挥抑制作用。体外研究时不必进行预孵育，大大简化实验操作流程。
本发明将兽药盐酸阿替美唑作为新一代p450酶非特异性抑制剂，既可用于动物体外、体内研究，也可用于人体体外系统研究，其抑制作用明显优于现有的经典工具药1-abt。
本发明还提供了一种利用盐酸阿替美唑筛选研究p450酶对药物化合物体外清除作用的方法，在肝微粒体孵育体系中加入待测药物化合物及盐酸阿替美唑，以不加盐酸阿替美唑作为阴性对照，比较待测药物化合物体外清除率(clint)的比值，根据公式贡献度(fm)＝[1-clint+阿替美唑/clint-阿替美唑]×100％判断p450酶对药物化合物体外代谢清除的贡献。其中，盐酸阿替美唑在肝微粒体孵育体系中的浓度优选为10～50μm，更优选为20～30μm。
一种利用盐酸阿替美唑筛选研究p450酶对药物化合物体内清除作用的方法，同时口服待测药物化合物与盐酸阿替美唑，以不服用盐酸阿替美唑作为阴性对照，比较待测药物化合物体内药物原型暴露量(auc)变化比值，根据公式贡献度(fm)＝[1-auc-阿替美唑/auc+阿替美唑]×100％判断p450酶对药物化合物体内代谢清除的贡献。其中，盐酸阿替美唑给大鼠的口服剂量优选为2～4mg/kg，更优选为3mg/kg。
上述技术方案中，盐酸阿替美唑作为非特异性的p450酶抑制剂的工具药物确定p450酶介导的代谢清除在药物化合物总清除率中的贡献，为药物筛选及药物代谢机制提供方法和依据。
附图说明
图1为盐酸阿替美唑对cyp1a2时间依赖的抑制作用；
图2为盐酸阿替美唑对cyp2b6时间依赖的抑制作用；
图3为盐酸阿替美唑对cyp2c8时间依赖的抑制作用；
图4为盐酸阿替美唑对cyp2c9时间依赖的抑制作用；
图5为盐酸阿替美唑对cyp2c19时间依赖的抑制作用；
图6为盐酸阿替美唑对cyp2d6时间依赖的抑制作用；
图7为盐酸阿替美唑对cyp3a4时间依赖的抑制作用。
具体实施方式
本发明通过在体外对三个种属(大鼠、犬和人)的肝微粒体孵育体系中，应用p450同工酶探针底物法研究盐酸阿替美唑对p450主要同工酶的抑制作用，发现盐酸阿替美唑对三个种属p450主要同工酶介导的底物代谢反应均有明显的抑制作用。结果显示，盐酸阿替美唑对cyp1a2、cyp2b6、cyp2c8、cyp2c9、cyp2c19、cyp2d6及cyp3a4介导的探针底物代谢作用均有抑制作用，特别是对cyp2c9的抑制作用明显强于1-abt，并且没有明显的种属差异。
本发明应用时间依赖的体外药物相互作用模型研究还发现，盐酸阿替美唑对代谢酶的抑制作用是非时间依赖的，在预孵育过程中加入和不加入nadph启动反应后，盐酸阿替美唑对各cyp同工酶的抑制作用没有明显改变，提示主要是药物原型盐酸阿替美唑发挥抑制作用。
由于盐酸阿替美唑对各同工酶的抑制能力没有明显差别，特别是对cyp2c9的抑制作用明显强于1-abt，种属差异小，既可用于动物体外、体内研究，也可用于人体体外系统研究；而且由于盐酸阿替美唑的抑制作用是药物原型不是代谢产物，在进行体外研究时不必进行预孵育，体内研究时不必提前给药，具有替代现有的经典工具药1-abt的明显优势。因此，盐酸阿替美唑能够作为新一代p450酶非特异性抑制剂。
盐酸阿替美唑作为非特异性的p450酶抑制剂的工具药物，能够用于测定p450酶介导的代谢清除在药物化合物总清除率中的贡献，为药物筛选及药物代谢机制提供方法和依据。
本发明利用盐酸阿替美唑筛选研究p450酶对药物化合物体外清除作用的方法包括，在肝微粒体孵育体系中加入待测药物化合物及盐酸阿替美唑，以不加盐酸阿替美唑作为阴性对照。比较待测药物化合物体外清除率(clint)的比值，根据公式贡献度(fm)＝[1-clint+阿替美唑/clint-阿替美唑]×100％判断p450酶对药物化合物体外代谢清除的贡献。本发明中，对待测小分子药物化合物的种类没有特殊限制，任何类型的化合物均能用于本发明的小分子药物化合物筛选中。
其中，肝微粒体孵育体系中，蛋白浓度优选为0.1～1mg/ml，更优选为0.5mg/ml；待测药物化合物在肝微粒体孵育体系中的浓度优选为1～2μm；盐酸阿替美唑在肝微粒体孵育体系中的浓度优选为10～50μm，更优选为20～30μm。本发明优选用nadph启动反应，所述nadph的浓度优选为1～2mm。本发明优选在所述孵育体系中加入冰乙腈终止反应。本发明孵育反应的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述孵育反应的时间优选为10～60min，更优选为20～40min。反应终止时，测定药物化合物的体外清除率。
本发明所述体外清除率计算方法优选为：
将各待测药物化合物的零时浓度设为100％，不同孵育时间点的药物化合物浓度与零时浓度相比得到药物化合物在各时间点的剩余百分比，将药物化合物各时间点剩余百分比的自然对数与孵育时间经线性回归得到斜率(-k)，由公式(1)得到盐酸阿替美唑在微粒体中代谢的t1/2(min)；
t1/2＝-0.693/k(1)
由wellstierredmodel对肝微粒体数据进行外推法得药物化合物在不同种属肝微粒体中的固有清除率clint(ml·min-1·kg-1)(公式2)
其中，式(2)中，x为不同种属常用的比例因子(g肝重/kg体重)，如人＝20；比格犬＝25；大鼠＝45。
计算待评价药物化合物在加和不加盐酸阿替美唑后体外代谢清除率的比值变化，根据公式贡献度(fm)＝[1-clint+阿替美唑/clint-阿替美唑]×100％判断p450酶对药物化合物体外代谢清除的贡献。
本发明中，在肝微粒体孵育体系中加入p450各同工酶的探针底物，以加入盐酸阿替美唑作为阳性对照，以不加盐酸阿替美唑作为阴性对照，用nadph启动反应进行孵育，孵育结束后，计算各探针底物在加和不加盐酸阿替美唑后体外固有清除率(clint)比值，如，clint+阿替美唑/clint-阿替美唑<0.2，则证明盐酸阿替美唑已基本抑制了p450酶活性，该体系可靠。
本发明利用盐酸阿替美唑筛选研究p450酶对药物化合物体内清除作用的方法，包括：同时口服待测药物化合物与盐酸阿替美唑，以不服用盐酸阿替美唑作为阴性对照，比较待测药物化合物体内药物暴露量变化比值，判断p450酶对药物化合物体内代谢清除的贡献。
本发明优选应用药代动力学研究方法测定不同时间段内的待测药物化合物体内药物暴露量(auc)。根据公式贡献度(fm)＝[1-auc-阿替美唑/auc+阿替美唑]×100％判断p450酶对药物化合物体内代谢清除的贡献。
本发明中，口服对象可以为如大鼠或犬等动物，也可以为人。本发明根据待测药物化合物的口服推荐剂量设置适应的口服剂量。本发明所述盐酸阿替美唑给大鼠的口服剂量优选为2～4mg/kg，更优选为3mg/kg。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
盐酸阿替美唑对cyp各同工酶的抑制作用
分别在大鼠、犬和人肝微粒体溶液(蛋白浓度0.5mg/ml)中加入表1所示cyp各同工酶的探针底物、及0～100μm系列浓度(0,0.091,0.412,1.23,3.7,11.1,33.3,100μm)的盐酸阿替美唑预孵育5min后，加入nadph(终浓度为1mm)启动反应，37℃共同孵育，孵育时间见表1。孵育完成后，加入冰乙腈终止反应，涡旋后高速离心，取上清用lc-ms/ms测定各探针底物代谢产物的生成量。将在不同浓度盐酸阿替美唑换算成对数，各浓度下代谢产物生成量与空白对照组相比得到比值，应用prism软件进行拟合，进而得到盐酸阿替美唑对各种属p450主要同工酶的半数抑制浓度(ic50)。
表1cyp酶各亚型的探针底物在肝微粒体孵育液中的浓度及孵育时间
对比例1
1-abt对cyp各同工酶的抑制作用
分别在大鼠肝微粒体溶液(蛋白浓度0.5mg/ml)中加入实施例1中表1所示cyp各同工酶的探针底物，及0～10mm系列浓度(0,0.91,4.12,12.3,71.111,333,1000μm)的1-abt预孵育5min后，加入nadph(终浓度为1mm)启动反应，37℃共同孵育，孵育时间见表1。孵育完成后，加入冰乙腈终止反应，涡旋后高速离心，取上清用lc-ms/ms测定各探针底物代谢产物的生成量。将在不同浓度1-abt换算成对数，各浓度下代谢产物生成量与空白对照组相比的比值，应用prism软件进行拟合，进而得到1-abt对各种属p450主要同工酶的半数抑制浓度(ic50)。
表2盐酸阿替美唑及1-abt对各种属p450主要同工酶的抑制作用
由表2可以看出，盐酸阿替美唑对三个种属p450主要同工酶介导的底物代谢反应均有明显的抑制作用，ic50值明显低于1-abt；特别是对cyp2c9的抑制作用明显强于1-abt，并且没有明显的种属差异。
实施例2
盐酸阿替美唑对cyp酶基于时间依赖的抑制作用
孵育分为两组，一组为加入nadph启动反应组，另一组为不加入nadph不启动反应组。
大鼠肝微粒体溶液(蛋白浓度0.5mg/ml)中加入及0～100μm系列浓度(0,0.091,0.412,1.23,3.7,11.1,33.3,100μm)的盐酸阿替美唑，加入或不加入nadph(终浓度为1mm)孵育30min，之后按照表1所示浓度加入各同工酶探针底物，在37℃下共同孵育，除cyp2c19的探针底物(s)-美芬妥的孵育时间为30min外，其余探针底物的孵育时间为10min。孵育完成后加入冰乙腈终止反应，涡旋后高速离心，取上清用lc-ms/ms测定各探针底物代谢产物生成量，将在不同浓度盐酸阿替美唑换算成对数，各浓度下代谢产物生成量与空白对照组相比的比值，应用prism软件进行拟合，进而得到盐酸阿替美唑对各种属p450主要同工酶的半数抑制浓度(ic50)。
图1～7为盐酸阿替美唑对cyp主要同工酶时间依赖的抑制作用。由图1～7可以看出，在预孵育过程中加入和不加入nadph启动反应后，盐酸阿替美唑对各cyp同工酶的抑制曲线基本重合，nadph的加入对盐酸阿替美唑抑制cyp酶的作用没有明显改变，说明盐酸阿替美唑对代谢酶的抑制作用是非时间依赖的，提示主要是药物原型盐酸阿替美唑发挥抑制作用。
实施例3
在大鼠的肝微粒体溶液(蛋白浓度0.5mg/ml)中加入1μmzc56待评价药物化合物、盐酸阿替美唑20μm，并以不加入盐酸阿替美唑作为阴性对照，37℃预孵育5min后，加入nadph1mm启动反应，分别于5,15,30,60min加入冰乙腈终止反应。计算药物化合物在大鼠肝微粒体中的固有清除率clint，计算方法如下：
将待测药物化合物的零时浓度设为100％，不同孵育时间点浓度与零时浓度相比得到药物化合物的剩余百分比，将药物化合物各时间点剩余百分比的自然对数与孵育时间经线性回归得到斜率(-k)，由公式(1)得到阿替美唑在微粒体中代谢的t1/2(min)，再由wellstierredmodel对肝微粒体数据进行外推法得药物在大鼠肝微粒体中的固有清除率clint(ml·min-1·kg-1)(公式2)
t1/2＝-0.693/k(1)
其中，大鼠肝微粒体中比放因子x为45，肝微粒体蛋白浓度为0.5mg/ml，肝微粒体mg/肝重g为经验值45；zc56在加和不加盐酸阿替美唑后体外各时间点剩余百分比的自然对数与孵育时间经线性回归得到斜率(-k)分别为0.0042和0.0236，t1/2分别为165min和26.5min。根据实验结果按照公式2计算zc56在加和不加盐酸阿替美唑后体外代谢清除分别为17.0和106.7ml·min-1·kg-1，根据公式贡献度(fm)＝[1-clint+阿替美唑/clint-阿替美唑]×100％判断p450酶参与该化合物代谢清除贡献为84％。
实施例4
在评价筛选化合物时同时进行研究体系可靠性的阳性对照研究
在大鼠的肝微粒体溶液(蛋白浓度0.5mg/ml)中加入1μm混合探针底物(非那西丁、双氯芬酸、(s)-美芬妥因、右美沙芬、咪达唑仑)及盐酸阿替美唑20μm，并以不加入盐酸阿替美唑作为阴性对照，37℃预孵育5min后，加入nadph1mm启动反应，分别于5,15,30,60min加入冰乙腈终止反应。计算混合探针底物在大鼠肝微粒体中的固有清除率clint，按照公式贡献度(fm)＝[1-clint+阿替美唑/clint-阿替美唑]×100％计算p450酶对各探针底物的贡献度，结果显示盐酸阿替美唑能明显抑制各探针底物在大鼠肝微粒体的体外代谢，贡献度fm均大于80％(表3)，认为该体系可靠。
表3混合探针底物作为阳性对照加和不加盐酸阿替美唑后在大鼠肝微粒体中代谢稳定性
实施例5
大鼠10只，随机分为两组，每组5只，其中第一组同时灌胃待测药物化合物zc56(2mg/kg)与盐酸阿替美唑(3mg/kg)，第二组仅灌胃zc56(2mg/kg)。不同时间点(5,15,30,60min,2,4,6,8,12h)采血，分离血浆，应用lc-ms/ms测定血浆药物浓度，根据不同时间点药物浓度分别计算两组中zc56的血浆暴露量(auc)。
灌胃12h后，第一组和第二组中zc56的血浆暴露量(auc)分别为158396±99512和469937±175113ng/ml*min，根据公式贡献度(fm)＝[1-auc-阿替美唑/auc+阿替美唑]×100％，判断p450酶对药物化合物体内代谢清除的贡献为67％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。