本发明涉及医药
技术领域：
，尤其涉及烟管头草提取物的新应用，具体为烟管头草提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：中药防御肿瘤在我国具有悠久的历史，随着现代技术的发展，对大量中药复方、中药的抗肿瘤研究越来越多。中药抗肿瘤的作用机理主要分为六大类型：细胞毒作用、抑制肿瘤细胞增殖(包括阻滞细胞周期)、促进肿瘤细胞凋亡、逆转肿瘤耐药性、抑制肿瘤细胞转移，以及免疫增强作用。在临床上，恶性肿瘤的转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因，肿瘤细胞的转移能力是肿瘤细胞侵入周围组织和扩散的重要条件，因此，开发具有显著抑制抗肿瘤转移的中药药物，对于恶性肿瘤的治疗和临床应用具有重要意义。烟管头草(carpesiumcernuum)，为菊科天名精属植物，分布在日本、朝鲜、欧洲以及中国大陆，生长于海拔60米至3300米的山坡、路边。民族用药中有报道其具有发汗、解毒、散瘀的功能，但临床上用于抗肿瘤尚未有报道。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了烟管头草提取物的新应用，具体为烟管头草提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明通过cck8实验，检测烟管头草提取物(简称cce)对乳腺癌mda-mb-231和mcf7细胞、肝癌hepg2细胞、肺癌a549细胞增殖的影响。结果显示，烟管头草提取物作用24h后，对乳腺癌mda-mb-231和mcf7细胞、肝癌hepg2细胞、肺癌a549细胞ic50值分别为2.21、6.55、4.70、4.49μg/ml。由此可见，本发明提供的烟管头草提取物对上述4种肿瘤细胞的生长具有显著的抑制作用。本发明以mda-mb-231细胞作为受试细胞，通过细胞转移试验考察烟管头草提取物抑制肿瘤细胞转移的作用。结果显示，作用24h后，1μg/ml本发明提供的烟管头草提取物对肿瘤细胞转移的抑制率为34.5％。由此可见，本发明提供的烟管头草提取物对肿瘤细胞转移具有显著的抑制作用。本发明以mda-mb-231细胞为受试细胞，利用流式细胞术考察烟管头草提取物对肿瘤细胞周期g0/g1期、s期、g2/m期的影响。结果显示，1μg/ml的烟管头草提取物在作用24h后，能够抑制肿瘤细胞进入m期，阻滞在s期。由此可见，本发明提供的烟管头草提取物能够阻滞肿瘤细胞周期分裂。因此，本发明提供了烟管头草提取物在制备抑制肿瘤细胞转移、阻滞细胞周期分裂的药物中的应用。本发明采用实时定量pcr检测烟管头草提取物对调控肿瘤转移相关基因表达的影响，结果显示，烟管头草提取物可以显著下调细胞表面糖蛋白cd44基因、细胞iv型胶原蛋白col4a2基因。因此，本发明还提供了烟管头草提取物在抑制cd44基因和col4a2基因的表达中的应用。由以上实验结果，本发明提供的烟管头草提取物对乳腺癌mda-mb-231和mcf7细胞、肝癌hepg2细胞、肺癌a549细胞的增殖具有显著的抑制作用；对肿瘤细胞的转移具有明显抑制作用，能够抑制肿瘤细胞进入m期，阻滞在s期，并显著下调细胞表面糖蛋白cd44基因、细胞iv型胶原蛋白col4a2基因，达到抗肿瘤的目的。因此，本发明提供了烟管头草提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。作为优选，所述肿瘤为乳腺癌、肝癌或肺癌。作为优选，所述肿瘤具体为乳腺癌mda-mb-231、乳腺癌mcf7细胞、肝癌hepg2细胞、肺癌a549细胞。作为优选，烟管头草提取物为烟管头草乙醇提取物，更优选为烟管头草花序的乙醇提取物。在本发明的一些实施例中，烟管头草乙醇提取物的制备方法为：取烟管头草花序，加入90％乙醇加热回流萃取3小时，提取液过滤后45℃浓缩为浸膏，获得所述烟管头草提取物。作为优选，本发明所述应用中，烟管头草乙醇提取物的作用终浓度为0.5～100μg/ml。本发明还提供了一种抗肿瘤药物，包括有效剂量的烟管头草提取物和药学上可接受的辅料。本领域技术人员可将所述烟管头草提取物直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，如崩解剂、润滑剂、乳化剂、粘合剂等，以常规药物制剂方法，制成散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、注射液、粉针剂或喷雾剂等。本发明提供了烟管头草提取物的新应用，具体为烟管头草提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。实验表明，烟管头草提取物对乳腺癌mda-mb-231和mcf7细胞、肝癌hepg2细胞、肺癌a549细胞的增殖具有显著的抑制作用；对肿瘤细胞的转移具有明显抑制作用，能够抑制肿瘤细胞进入m期，阻滞在s期，并显著下调细胞表面糖蛋白cd44基因、细胞iv型胶原蛋白col4a2基因的表达，表明本发明所述的烟管头草提取物具有显著的抗肿瘤作用，可用于制备抗肿瘤药物。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示cce对肿瘤细胞增殖的影响，其中图a为cce对乳腺癌mda-mb-231细胞增殖的影响，图b为cce对乳腺癌mcf7细胞增殖的影响，图c为cce对肝癌hepg2细胞增殖的影响，图d为cce对肺癌a549细胞增殖的影响；图2示cce对乳腺癌mda-mb-231细胞迁移能力影响的染色图；图3示cce对乳腺癌mda-mb-231细胞迁移能力的细胞统计图；图4示cce对乳腺癌mda-mb-231细胞的细胞周期调控作用的细胞统计图；图5示cce处理乳腺癌mda-mb-231细胞后凋亡蛋白cleaved-parp表达水平的westernblotting结果图；图6示烟管头草提取物对cd44、col4a2基因的实时定量pcr分析图。具体实施方式本发明公开了烟管头草提取物的新应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1烟管头草提取物的制备取烟管头草花序10g，加入150ml90％乙醇加热回流萃取2h，提取液过滤后45℃浓缩为浸膏，获得所述烟管头草提取物。实施例2烟管头草提取物的制备取烟管头草花序10g，加入80％乙醇加热回流萃取3h，提取液过滤后40℃浓缩为浸膏，获得所述烟管头草提取物。实施例3体外细胞试验本实施例利用cck8实验，检测烟管头草提取物对乳腺癌mda-mb-231和mcf7细胞、肝癌hepg2细胞、肺癌a549细胞增殖的影响。将实施例1制备的烟管头草提取物稀释成不同浓度，分别处理乳腺癌mda-mb-231和mcf7细胞、肝癌hepg2细胞、肺癌a549细胞，24h后，采用cck8试剂盒测定细胞活力，计算细胞增殖率和ic50，结果见表1和图1a～图1d。表1不同浓度烟管头草提取物处理后的细胞存活率结果由表1结果可以看出，本发明提供的烟管头草提取物对乳腺癌mda-mb-231和mcf7细胞、肝癌hepg2细胞、肺癌a549细胞作用24h后的ic50值分别为2.21、6.55、4.70、4.49μg/ml，结果表明，本发明提供的烟管头草提取物对上述4种肿瘤细胞的生长具有显著的抑制作用。实施例2烟管头草提取物对肿瘤细胞转移的抑制作用将mda-mb-231细胞铺于transwell小室中，分为实验组和对照组，实验组用1μg/ml实施例1制备的烟管头草提取物处理细胞，对照组用等体积的dmso处理细胞，24h后，实验组和对照组用甲醛固定下层转移细胞，然后用结晶紫染色，于显微镜下拍照，结果见图2，并对染色细胞进行计数，取平均值，结果见图3。如图2和图3所示，可以看出1μg/ml烟管头草提取物处理组细胞迁移数较少，将实验组和对照组各拍的三张照片取平均值后，得到对照组细胞迁移数平均值为394个，1μg/ml烟管头草提取物处理的实验组细胞迁移数平均值为258个。以对照组细胞迁移率为100％计算，1μg/ml烟管头草提取物对细胞转移的抑制率为34.5％。实施例3烟管头草提取物对细胞周期g0/g1期、s期、g2/m期的影响以mda-mb-231细胞为受试细胞，实验分为实验组和对照组，实验组细胞加入1μg/ml实施例1制备的烟管头草提取物，对照组加入烟管头草提取物等体积的dmso。处理24h，用乙醇固定后加入pi染色液，对细胞和进行染色，g0/g1期细胞染色体数目为2n、g2/m期染色体数目为4n，其余为s期、通过荧光强度不同区分细胞周期。利用流式细胞仪检测1万个细胞，分析不同周期细胞数量百分比，结果见图4。如图4所示，细胞周期s期中，烟管头草提取物处理后的实验组细胞数百分比略高于对照组，在g2/m期，实验组细胞数百分比明显低于对照组，且具有显著差异(p<0.05)，结果表明，烟管头草提取物能够抑制肿瘤细胞进入m期，阻滞在s期。实施例4以mda-mb-231细胞为受试细胞，实验分为四组：(1)空白对照组(negativecontrol，nc)：生理盐水、(2)阳性对照组：喜树碱(positivecontrol，pc)、(3)烟管头草提取物低剂量组(0.5μg/ml)、(4)烟管头草提取物中剂量组(1μg/ml)、(4)烟管头草提取物高剂量组(2μg/ml)，按上述各处理组处理受试细胞24h，裂解细胞，收集蛋白上清，用凋亡蛋白parp抗体孵育，显影后用多功能成像仪扫描结果，结果见5。如图5所示，阳性对照组能够促进剪切形式凋亡蛋白cleaved-parp表达，烟管头草提取物的高、中、低剂量组对凋亡蛋白无影响，结果表明，烟管头草提取物未促进细胞凋亡的发生。实施例5烟管头草提取物对cd44、col4a2基因的表达影响，本实施例采用qpcr技术，检测烟管头草提取物对cd44、col4a2基因的表达影响，具体实验过程为：以mda-mb-231细胞为受试细胞，分为实验组和对照组，实验组细胞用1μg/ml实施例1制备的烟管头草提取物处理，对照组细胞加入烟管头草提取物等体积的dmso进行处理，24h后，利用试剂盒提取rna并反转为cdna，采用反转录的从dna为模板进行实时定量pcr反应。其中，qpcr反应程序为：95℃，3min；(95℃，3s；60℃，30s)40个循环，引物序列见表2。表2引物序列数据处理：以空白对照组的基因表达量为1，药物处理组基因表达量大于1为基因表达上调，小于1为下调。具体结果见表3和图6，*p<0.05示与对照组相比具有统计学意义，**p＜0.01示与对照组相比差异极显著。表3qpcr结果基因cd44col4a2均值(n＝4)0.850.74sd0.040.17p0.010.03结果显示，烟管头草提取物对细胞表面糖蛋白cd44基因、细胞iv型胶原蛋白col4a2基因的表达具有明显的下调作用。以上结果显示，烟管头草提取物能够抑制肿瘤细胞增殖，并抑制细胞进入m期，阻滞在s期，但未促进细胞凋亡；并显著下调细胞表面糖蛋白cd44基因、细胞iv型胶原蛋白col4a2基因的表达。以上结果表明，烟管头草提取物能够明显抑制肿瘤细胞的生长及转移，可用于制备抗肿瘤药物。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12