本发明涉及用干扰素治疗克罗恩病的方法，尤其是涉及ifna4与ifna10基因在克罗恩病中的应用。
背景技术：
克罗恩病(crohn’sdisease,cd)是炎症性肠病(inflammatoryboweldisease,ibd)的一种，是一种反复发作的非特异性慢性肠道炎症性疾病，最常见于末段回肠和结肠，以腹痛、腹泻、腹块、瘘管形成及肠梗阻等为主要临床变现。胃肠道以外的器官如关节、皮肤、眼及肝胆胰等也可累及(mathewcg(2008)newlinkstothepathogenesisofcrohndiseaseprovidedbygenome-wideassociationscans.natrevgenet；9:9-14)。其病因尚未完全阐明，近年来的观点认为携带遗传易感基因的宿主在环境因素的参与下，由于慢性肠道感染、肠黏膜屏障缺陷和抗原免疫调节异常等，最终导致该疾病的发生(baμmgartdc,sandbornwj.crohn'sdisease.lancet2012；380:1590-605)。在过去40年中cd患病率呈全球性上升趋势，发病率在欧洲及北美地区较高，在中国等以往发病率较低的国家近年来也呈逐年上升趋势。有报道，我国cd的平均发病率和患病率分别由1950年至2002年的0.28/10万和1.38/10万，增长至为2003年至2007年的1.21/10万和2.29/10万(zhengjj,shixh,zhuxs,etal.acomparativestudyofincidenceandprevalenceofcrohn'sdiseaseinmainlandchinaindifferentperiods.zhonghuaneikezazhi2011；50:597-600)。
通过对家庭聚集、种族差异及双生子的一系列研究表明，遗传因素不仅决定着人群对cd的易感性，同时也决定着疾病的临床特征。在有cd家族史人群中的发病率比没有家族史的人群要高出13～36倍。同时研究表明，双生子及同一家族中多个cd患者在患病部位、临床表现，甚至包括肠外表现都存在着高度的一致性。此外，同卵双生子cd的发病一致率显著高于双卵双生子。上述现象从不同角度说明遗传因素在cd发病中发挥了重要的作用。
位于16号染色体上的nod2/card15基因是第一个被证实的cd遗传易感性基因，由2001年欧洲hugot研究小组(hugotjp,chamaillardm,zoualih,etal.associationofnod2leucine-richrepeatvariantswithsusceptibilitytocrohn'sdisease.nature2001；411:599-603)和美国ogura研究小组(oguray,bonendk,inoharan,etal.aframeshiftmutationinnod2associatedwithsusceptibilitytocrohn'sdisease.nature2001；411:603-6)先后发现。但在中国、日本以及韩国等亚洲人群以及欧洲的土耳其克罗恩病人群中却未发现与nod2关联(ngsc,tsoikk,kammma,etal.geneticsofinflammatoryboweldiseaseinasia:systematicreviewandmeta-analysis.inflammboweldis2012；18:1164-76)。
ifn广泛表达于人体脑、甲状腺、肺、肝脏、脾脏、胰腺、胃肠道、血液和胎盘等器官(wacka,terczynska-dylae,hartmannr.guardingthefrontiers:thebiologyoftypeiiiinterferons.natimmunol2015；16:802-9)。ifn具有很强的免疫调节活性，可以调节t、b淋巴细胞的功能。ifn-i和ifn-ii都可以提高mhc-i类分子的表达，从而促进cd8+t细胞反应的形成，促进杀伤感染病毒的靶细胞。ifn-i和ifn-ii都可以通过诱导stat1二聚体形成而进一步活化gas；但是ifn-ii不能诱导形成isgf3，从而不能介导启动子只含isre位点的相关炎症因子的转录(plataniaslc.mechanismsoftype-i-andtype-ii-interferon-mediatedsignalling.natrevimmunol2005；5:375-86)。
以往研究认为，ifn可以通过tlrs介导调节treg细胞功能，进而在肠道黏膜上皮防御中发挥作用。而ifnar1或ifn-λr缺失小鼠对抗肠道病原微生物引起肠道炎症的能力下降。提示ifn在肠道黏膜炎症免疫调节中起到重要作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于为解决临床防治炎症性肠病现有技术的缺陷和不足，确定ifna4和ifna10基因的表达与克罗恩病的关系，提供一种制备用于预防、缓解和/或治疗克罗恩病药物和/或生物制剂的ifna4和ifna10靶基因的应用。
所述用于预防、缓解和/或治疗克罗恩病药物和/或生物制剂，包括ifna4和ifna10激动剂。
本发明通过全基因组外显子高通量测序技术发现中国克罗恩病患者易感基因ifna4和ifna10。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明发现中国克罗恩病患者易感基因ifna4和ifna10。
2.基于ifna4和ifna10具有抑制克罗恩病发生发展的作用，为研制克罗恩病的药物提供靶标。
3.ifna4和ifna10的激动剂可用于制备预防、缓解和/或治疗克罗恩病的药物。
附图说明
图1为克罗恩病患者与正常对照组血清中ifna4的表达水平。在图1中，a为克罗恩病患者血清中的ifna4的分泌量与正常对照组相比明显升高；b为在正常人或克罗恩病患者中ifna4突变的个体其血清中的表达量均高于对应的野生型个体。
图2为克罗恩病患者与正常对照组血清中ifna10的表达水平。在图2中，a为克罗恩病患者血清中的ifna10的表达量比健康人明显降低；b为克罗恩病患者或健康人，携带ifna10杂合体突变型的个体的血清ifna10蛋白分泌量都会低于携带ifna10野生型的个体。
图3为克罗恩患者中ifna4和ifna10与其对应共同突变患者中两者的表达量。在图3中，a为克罗恩患者中ifna4和ifna10，b为对应共同突变患者。
图4为dss构建小鼠急性肠炎模式图。
图5为干扰素亚型治疗dss诱导肠炎模型中小鼠体重的变化。
图6为干扰素亚型治疗dss诱导肠炎模型中小鼠便血情况。
图7为模型小鼠肠道he染色。
图8为模型小鼠肠道炎症评分。
图9为模型小鼠肠道炎症相关因子表达情况。
图10为流式细胞分析模型小鼠肠道淋巴细胞表达情况。
图11为定量分析cd4+cd25+细胞及cd3+表达情况。在图11中，a为cd4+cd25+细胞，b为cd3+。
图12为流式细胞分析模型小鼠肠道淋巴细胞表达情况。
图13为定量分析cd4+及foxp3+细胞表达情况。在图13中，a为cd4+，b为foxp3+。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述。
本发明对诊断明确且症状典型的4例中国汉族cd病患者外周血dna标本进行了全基因组外显子高通量测序，通过seqcapezhμmanexomelibraryv2.0，进行全基因外显子组捕获，建立5个患者的外显子文库。通过双末端测序，利用生物信息学和基因多态性数据库进行了比对分析后，分别检测出snps62091,63581,58329,59449个，和indels5192,5112,4983,5025个(表1)，把上述位点过滤四个单核苷酸多态性的数据库dbsnp，1000genomesproject，hapmap8和yhdatabases，得到共有位点294个，通过shft软件预测得到99个有害位点，对基因功能的分析最后得到57个候选易感基因位点(表2)。对这些位点分别设计pcr引物，sanger测序验证，证实26个位点的高通量测序结果为正确测序。pcr扩增后采用sanger测序确定外显子测序的准确性，发现其中26个位点的sanger测序结果在突变类型、方式上与外显子测序的结果完全一致(表3)。
表1全基因组外显子测序注释的插入/缺失突变
表2生物信息学分析及过滤结果
表3全基因组外显子测序获得的57个共有候选易感基因位点及sanger测序验证结果
为了排除假阳性位点及验证是否为功能性突变，本发明扩大样本量，在更多的克罗恩病病例、健康对照中，通过常规sanger测序证实ifna10rs21197037(c.60t>a),ifna4rs21177471(c.60a>t)在cd和健康对照中的分布有显著性差异(表4、5)，而在uc和健康对照中的分布不存在显著性差异，初步确定ifna4，ifna10为中国人群cd的目标易感基因。随后的多中心验证，进一步证明ifna4，ifna10为中国人特异的易感基因(表6)。
表4突变位点ifna10(c.60t>a)、ifna4(c.60a>t)具体信息
chr:染色体；ref:参照；alt:变异；mt:突变类型；pfs:sift预测；mn:突变命名；sfs:sift分数；
codons:密码子；sub:替换
表5突变位点ifna4、ifna10在病例组与对照组的基因型频率分布
表6突变位点ifna4、ifna10在病例组与对照组的基因型频率分布
全基因外显子组测序的流程为，选取临床诊断明确的克罗恩病患者→基因组dna被打断至大小为150-200bp片段→打断的dna片段末端修复、加a尾和连接接头(adapter)的连接→dna模板延伸，桥式扩增→扩增文库的杂交→捕获杂交片段→洗脱→捕获文库扩增→检测捕获效率→clusterstation的桥式pcr扩增→测序接头的添加→测序文库的检测→hiseq2000平台上自动化测序→总结报告。确定ifna4，ifna10为中国人群cd的目标易感基因。
本发明确定易感基因ifna4和ifna10血清水平与临床特征的关系如下：
1.ifna4和ifna10的突变与克罗恩病临床特征无显著相关性
将ifna4和ifna10突变情况与患者的性别、年龄、发病部位(回肠末端、结肠、回结肠、上消化道)、并发症(狭窄、疼痛、肛周疾病)等进行相关性分析，结果发现，ifna4和ifna10的突变与患者的这些表型均无明显差异(表7、8)。
表7ifna4与克罗恩病患者表型的相关性分析
表8ifna10与克罗恩病患者表型的相关性分析
2.ifna4和ifna10的突变降低了类固醇激素治疗cd的敏感性
对151例克罗恩病患者ifna4和ifna10的突变情况与临床治疗药物(5-氨基水杨酸、类固醇激素、免疫抑制剂、英夫利昔)的疗效进行相关性分析，结果发现当克罗恩病患者的ifna10(c.60t>a)和ifna4(c.60a>t)发生突变时，其类固醇治疗和临床总体治疗有效率显著下降，说明突变位点ifna10(c.60t>a)、ifna4(c.60a>t)可明显降低类固醇治疗的敏感性(表9、10)。
表9克罗恩病患者ifna4的突变与临床疗效的关系
表10克罗恩病患者ifna10的突变与临床疗效的关系
3.ifna10和ifna4突变可降低ifna10或增加ifna4血清水平
我们收集了47例克罗恩病患者和95例正常对照组的血清标本，用elisa方法检测易感基因ifna4、ifna10血清的含量，探索杂合体突变型ifna亚型与野生型之间是否存在表达量的差异，并进一步明确具有相同杂合体突变型在克罗恩病患者和正常对照组(因对照组中亦存在具有统计学差异的低杂合体变异率)中是否存在蛋白质表达量的差异，进而从人类标本中获得功能学差异层面的疾病易感性依据。结果表明：克罗恩病患者血清中的ifna4的分泌量与正常对照组相比明显升高，并且不论在正常人或克罗恩病患者中ifna4突变的个体其血清中的表达量均高于对应的野生型个体，且差异具有统计学意义(图1)。而克罗恩病患者血清中的ifna10的表达量比健康人明显降低；并且无论克罗恩病患者或健康人，携带ifna10杂合体突变型的个体的血清ifna10蛋白分泌量都会低于携带ifna10野生型的个体(图2)，但是在克罗恩病患者中，ifna4和ifna10的表达与两者存在同时突变的表达量没有统计学差异(图3)。进一步证明了杂合体突变型可影响ifna4和ifna10蛋白质的表达，说明ifna4、ifna10突变与中国人群克罗恩病密切相关。
本发明确定易感基因ifna4和ifna10体内的功能如下：
1.ifna4和ifna10能显著改善dss诱导的小鼠急性结肠炎
本发明以ifna2(ifna2为主流亚型)为对照组，以注射ifna10、ifna4基因编码的鼠源重组ifna4、ifna10蛋白的小鼠为实验组，给予小鼠饮用dss溶液导致小鼠大肠粘膜破损，通过共生菌感染而引起小鼠急性肠炎模型(图4)。观察不同ifna亚型对肠道炎症反应及黏膜损伤的作用如小鼠的体重变化、腹泻、便血等情况。结果发现注射ifna4、ifna10蛋白组的小鼠与注射ifna2组和未注射干扰素组相比，体重下降的情况显著改善(图5)，便血情况明显改善(图6)。同时我们分离模型小鼠的肠道组织，通过he染色观察其炎症表现，并且通过炎症评分评价其炎症的严重程度，结果发现，注射重组蛋白组炎症明显比对照组轻(图7、8)。另外，提取模型小鼠的肠道组织mrna，通过定量pcr检测发现注射重组蛋白组抑制炎症相关的因子如ccl2、cd70、cxcl10等明显升高(图9)，表明ifna4、ifna10基因对肠道黏膜炎症有保护作用，其突变与克罗恩病密切相关。
2.ifna4和ifna10通过诱导treg细胞改善小鼠肠粘膜炎症
本发明以ifna2(ifna2为主流亚型)为对照组，以注射ifna10、ifna4基因编码的鼠源重组ifna4、ifna10蛋白的小鼠为实验组，给予小鼠饮用dss溶液导致小鼠大肠粘膜破损，通过共生菌感染而引起小鼠急性肠炎模型(图4)。本发明分离了模型小鼠的肠道淋巴细胞，通过流式细胞仪分析了t淋巴细胞的标志cd3，发现注射ifna4、ifna10重组蛋白小鼠的t淋巴细胞明显少于ifna2和对照组(图10)，说明ifna4和infa10能够抑制肠道t淋巴细胞的浸润；并对这些淋巴细胞进一步分析了treg细胞的标志物cd25及cd4，结果发现注射重组蛋白组cd25表达量明显高于对照组(图10、11)。另外，本发明又对cd4+t细胞及treg细胞标志物foxp3进行检测，发现注射重组蛋白组foxp3的表达量明显高于对照组(图12、13)。以上结果显示ifna4和infa10在体内也能够通过诱导调节性t细胞的成熟分化进而抑制炎症反应。
由以上结果可知中国人群克罗恩病易感基因为ifn4a和ifna10，它们的突变型与cd的临床表型和激素治疗应答相关。体内外实验证明，ifna4和ifna10可能是通过介导treg细胞的成熟分化进而抑制炎症反应。因此，ifna4和ifna10具有抑制克罗恩病发生发展的作用，为研究防止克罗恩病的新靶点和心策略提供了理论依据和临床基础。
因此，ifna4和ifna10基因可作为药物靶点，构建ifna4和ifna10基因突变的体外细胞模型或动物模型，用于筛选预防、缓解和/或治疗克罗恩病的药物；ifna4和ifna10基因也可以作为基因治疗中的靶基因，设计并制备预防、缓解和/或治疗克罗恩病的药物和/或生物制剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗克罗恩病的目的，例如以ifna4和ifna10为靶点设计小分子化合物激动剂，利用ifna4和ifna10基因低表达的体外细胞模型或动物模型，通过筛选，发现其中能够特异性促进ifna4和ifna10过表达的分子，从而为克罗恩病的治疗提供新的治疗性分子。
针对ifna4和ifna10的上述功能，提供ifna4和ifna10作为药物靶标在预防、缓解和/或治疗克罗恩病的药物中的作用。
针对ifna4和ifna10的上述功能，提供ifna4和ifna10的激活剂在预防、缓解和/或治疗克罗恩病的药物中的作用。一种预防、缓解和/或治疗克罗恩病的药物，包含ifna4和ifna10激动剂。
因此，本发明将通过全基因组外显子高通量测序技术筛选中国汉族人群cd的易感基因，探讨筛选到的候选易感基因ifna4和ifna10突变与cd患者临床表型的关系，并进一步探讨ifna4和ifna10突变对细胞功能的影响和其在结肠炎小鼠模型肠黏膜小鼠保护中的作用及其机制。
以下给出具体实施例。
克罗恩病患者病例及其血液标本和伦理申明
全基因组外显子测序研究对象选取由厦门大学附属中山医院消化内科临床诊断为克罗恩病的4个病例。其中3男，1女，均表现为腹痛、腹泻、脓血便、里急后重等克罗恩病典型症状，部分患者有有消化道梗阻、穿孔、脓肿、出血等并发症，和皮肤、眼部、口腔、骨骼关节、胆道等部位的肠外表现。
所涉及的208例克罗恩病患者和198例健康对照的血液标本和临床病理信息来源于厦门大学附属中山医院标本库、上海第十人民医院和西京消化病院所收集的标本，每例患者均经过副主任医师以上的医生进行诊断，诊断不明确者通过组织病理学检査被确诊，才可以纳入研究对象。
所有病例和健康对照均进行详细的病史采集与随访，如实记录患者的一般信息，如姓名、性别、年龄、籍贯、家庭住址、联系电话等，和疾病相关信息，如发病年龄、疾病部位、类型、严重程度等，随后收集外周血标本，分装冻存血清标本及提取基因组dna标本，验证dna质量、浓度及纯度。
所有研究对象均已签署书面的知情同意书，该研究已经过厦门大学伦理委员会批准，依照赫尔辛基宣言条例执行。
实验小鼠
实验所用的c57bl/6小鼠由厦门大学实验动物中心购买并饲养。
实施例1全基因组外显子测序
1.全基因组外显子捕获：
利用安捷伦的外显子捕获系统对克罗恩病4个样本进行全基因组外显子捕获。每份样本取3μg的基因组dna置于管中，使总体积稀释达120μl，转至covaris管中；用自适应高聚焦超声技术(covaris)，按在设置好的程序运行自适应高聚焦超声仪；将gdna随机打断为150～200bp大小的片段，随后转移至管中；应用ageneomtampurexpbeads试剂盒对样品进行纯化；检测核昔酸的长度；进行末端修复：用illμminapaired-endsamplepreparationkit试剂盒进行，然后在热循环仪上20℃孵育30min，纯化末端修复的样品；采用illμminapaired-endsamplepreparationkit试剂盒，对已修复dna片段的3’末端加a尾，室温孵育30min于热循环仪上，应用ageneourtampurexpbeads试剂盒对末端加a尾的样品进行纯化；采用illμminapaired-endsamplepreparationkit试剂盒，对已加a尾的dna片段进行paired-end链接接头(adapter)连接，以备agilent外显子捕获芯片捕获。20℃孵育15min；用bioananlyzerdna1000芯片系统，检测纯化后带paired-end链接接头的文库质量；paired-end链接接头文库进行pcr(lm-pcr)扩增，应用ageneourtampurexpbeads系统对pcr扩增产物进行纯化，应用bioananlyzerdna1000芯片系统对pcr扩增产物文库进行质量检测，制备杂交文库，顺次添加sureselectblock混合液，杂交buffer，捕获文库混合液，清洗重悬磁珠，文库与sureselcthμmanallexon芯片进行杂交，捕获杂交片段，具体步骤见试剂盒说明，应用ageneourtampurexpbeads试剂盒对杂交捕获后的dna进行纯化，对杂交纯化后dna进行pcr扩增；应用ageneourtampurexpbeads试剂盒对pcr扩增产物dna进行纯化；用bioananlyzerdna1000芯片系统对pcr扩增产物文库进行质量检测；捕获文库扩增前准备工作：用16μlebbuffer稀释306fmol的扩增文库，使总体积达9μl；加入1μl的hp3buffer；混匀后室温孵育5min,使dna变性，放置于冰上静置；用992μl的ht1buffer稀释8μl变性的dna样品，使最终为12pm；进行高通量的测序，每个样本至少需要50x的覆盖深度。
2.高通量测序
采用illμminahiseq2000测序仪对富集的外显子dna进行双末端测序。illμminahiseq2000测序系统，测序原理和illμminagenomeanalyzerⅱ测序系统相似，均用边合成边测序方法，将基因组dna的随机片断附着到光学透明的表面，再通过延长和桥梁扩增，形成了数以亿计cluster的flowcell，每个cluster具有约1000拷贝的相同dna模板，再用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序。这种新方法确保了高精确度和性，可以测序同聚物和重复序列。测序方法分为单向测序(single-readsequencing)、双向测序(paired-endsequencing)和混合样品测序(indexedsequencing)，采用双向测序方法。
hiseq2000测序流程如下：随机打断基因组dna→在其两端添加接头→dna片段杂交到flowcell上→dna模板延伸，桥式扩增→边合成边测序(synthesis-based-sequenceing，sbs)→hiseq2000上自动化测序→图片处理→“dna簇群”在solexa测序仪上进行序列分析→碱基识别→数据实时分析→变异分析→总结测序结果。
3.clusterstation的桥式pcr扩增
clusterstation(cs)将待测样品“种植”于芯片中并对其进行桥式pcr扩增成簇。具体分为杂交和扩增、线性化和末端阻断、测序引物杂交三个阶。杂交和扩增：指将样品加入芯片中，使样品与芯片上的接头互补结合，再经pcr反应后使单分子成簇。线性化处理和末端阻断：对桥式pcr后呈簇状pcr产物的双链进行变性解链，再加入ddntp阻断剩下单链的末端。
4.测序引物的杂交
添加特定的测序引物，和末端进行阻断的pcr产物进行杂交，杂交结束后送往hiseq2000进行测序。
5.hiseq2000测序
hiseq2000是一种基于边合成边测序技术(sequeneing-by-synthesis，sbs)的测序方法。主要通过以下步骤实现测序：先加入反应试剂合成第一个碱基→清除未反应的碱基和试剂→激发碱基荧光并收集荧光信号→去除阻断基团和荧光基团→反复重复前面的步骤。
hiseq2000上机测序操作前准备：对hiseq2000进行清洗和检查：清洗管道系统、排液测量等。安装芯片：确认hiseq2000机器正常后，将经cs制备好的芯片安放进hiseq2000内，进行梯形棱镜的擦拭清理、芯片的擦拭清理和添加浸镜油，棱镜与fc应洁净，避免灰尘污染。测序评估：测序前要先进行测序测试，了解样品的信息，如密度、亮度、均匀度等。
碱基的读取：带有荧光基团的碱基利用红光和绿光这两种不同波长的激光，使相应的荧光基团发光，通过不同的滤光片，被高精度相机捕获，每反应一次拍照四次(a、c、g、t)，在芯片中每一个基因簇就是信号收集照片上一个亮点，通过坐标定位荧光信号位点，从而获得同一坐标位置不同循环中的荧光信息。
6.全基因组外显子测序的生物信息学分析
经illμminahiseq2000或illμminagenomeanalyzerⅱ高通量双末端测序之后，得到的原始数据经illμminabasecallingsoftware1.7读取，可得到90bp的双末端序列(reads)。测序完成之后，对数据进行信息分析：
数据产出统计：将双末端序列reads通过soapaligner比对软件，将高质量的原始reads比对到参考基因组上，进而用于后续的snp标注等分析。基本数据分析统计结果包括：序列长度、序列数量、数据产量、序列序列与参考基因组序列比对结果、目标区域比对到参考基因组序列的覆盖度(coverage)和测序深度(depth)等。使之得到通过外显子捕获的样本基本信息，还可以判断捕获的数据是否符合要求。
snp检测和注释：通过soapaligner2.20比对软件比对的reads结果，通过soapsnp软件进行一致序列组装，获得每个位点的基因分型，从而进行snp分析。通过soapsnp软件组装可以得到组装后的一致性序列cns文件(*.cns)文件，包含位点的基因型等详细信息的*.snp文件和以下过滤标准(如深度、质量值等)过滤后得到的高可信度的snp即(*.snp.filter)文件。可信snp的过滤标准为：
(1)质量值≥20；
(2)相邻两个snps的距离≥5bp；
(3)测序深度4≤depth≤200；
(4)位点附近区域平均拷贝数≤2；
对最终检测出的*.snp.fllter结果，进行注释分类，包括snp类型、质量值、碱基位置、可信度等，最终得到包含snp详细信息的*.gff文件。
插入/缺失(insertionsanddeletions，indels)的检测和注释：通过bwa软件将reads与hg19参考基因组重比对，然后通过gatk软件对比对后的一致性序列进行识别汇，从而可发现外显子区的indels，再后续的indels进行注释。
氨基酸替换预测：在遗传学中，遗传变异对表型的影响具有很重要的意义。遗传变异包括同义突变(synonymousmutation)和非同义突变(nonsynonymouscsnp,ns)。非同义的snp很可能影响蛋白质的功能，从而影响表型。采用sift(sortingintolerantfromtolerant)软件对本发明中获得的所有非同义突变进行功能预测，以预测单氨基酸替换对蛋白质功能的影响。
实施例2sanger测序
sanger测序是目前应用最广泛的测序方法。它的基本原理是将双脱氧核苷酸(ddntp)参入到合成的dna链中，由于脱氧核糖的3’位碳原子上没有轻基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，dna合成反应即终止。在测定时，首先将模板分为四管，分别加入引物和dna聚合酶，将32p或35s标记的dntp(仅标记一种即可)作为底物参入到新合成的dna链中。反应一定时间后，每管内加入四种ddntp中的一种，就可获得一系列在不同部位终止的、大小不同的dna片段。经电泳分离这些片段，再通过放射自显影就可以读出dna片段序列。
将酶切后的pcr产物在自动测序仪上进行测序反应。采用chromas2.31软件对所测得的基因序列与col14a1基因序列进行对比分析，确定突变位点。
实施例3elisa法检测ifna4、ifna10血清含量
采集入组研究对象清晨空腹外周肘静脉血1ml，以3000r/min速度进行离心10min后，取分离血清于-20℃保存备用。所有样本和标准品检测均设双孔测定。
捕获抗体使用pbs稀释成工作浓度，随后使用稀释好的捕获抗体(浓度为2.0μg/ml)加入96孔微孔板，每孔100μl进行包被，覆上板贴室温过夜。弃去液体，使用washbuffer380μl/孔洗板3次。加入1％bsa(1％bsa溶于pbs，ph7.2～7.4)300μl/孔，室温孵育1h。弃去液体，使用washbuffer(洗涤工作液)380μl/孔洗板3次。每孔分别加入标准品或待测样本(浓度为1g/l)100μl，覆上板贴室温2h。标准品由s0(样本稀释液)到s6(未稀释的高浓度标准品100ng/ml)，使用双倍倍比稀释法，依次类推形成标准品浓度梯度(0ng/ml，1.56ng/ml,3.12ng/ml,6.25ng/ml,12.5ng/ml,25ng/ml,50ng/ml，100ng/ml)。弃液重复洗板3次后，加入发现抗体(浓度为100ng/ml)100μl每孔，覆上板贴室温2h。弃液重复洗板3次后，加入hrp抗体(浓度为100ng/ml)100μl每孔，覆上板贴室温避光20min。弃液重复洗板3次后，加入底物溶液100μl每孔，覆上板贴室温避光20min，随后加入50μl每孔终止溶液(2mmol/l，h2so4)终止反应。在反应终止后5min内用酶标仪在450nm波长依序测量每孔的光密度(od值)。
实施例4dss诱导小鼠急性肠炎模型
dss是一种由蔗糖合成的多糖体，给予小鼠饮用dss溶液后可导致小鼠大肠粘膜破损，共生菌感染而引起结肠炎急性和慢性炎症。选择19～21克体重6～8周龄左右的雌性c57bl/6小鼠作为建立小鼠模型的对象，将葡聚糖硫酸钠溶于消毒过的饮用水，配制成重量百分浓度为2.5％的葡聚糖硫酸钠溶液，置于水瓶避光保护，现配现用，将选择的c57bl/6小鼠饲养在spf级动物房，饮用2.5％的葡聚糖硫酸钠溶液五天，再饮用正常饮用水，则成为dss诱导急性肠炎小鼠模型。
实施例5小鼠肠道组织分离淋巴细胞
分离小鼠肠炎模型的肠道组织，剪为碎小片，消化组织于含100u/ml胶原酶iv型(sigma)和5％fcs/dmem，37℃，5％co2的潮湿培养箱内60min，滤过被消化的组织细胞于70μm的细胞过滤网。以optiprep比重ρ＝1.084g/ml的离心分离淋巴细胞。
实施例6流式细胞术
单细胞悬液的制备：将1×105～1×107的细胞放入1.5ml离心管中3000r/min离心5min，弃上清；加入facs缓冲液100μl悬浮细胞。加入fc受体抗体0.5μl(0.5mg/ml)，冰浴3min。加入荧光抗体1μl(0.5mg/ml)，冰浴30min。加入facs缓冲液350μl，轻轻混匀，3000r/min，离心5min，弃上清，重复2次。取100μl仪器缓冲液加入获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞，将细胞悬液移入facs专用管中，准备进行仪器检测和分析。
序列表
<110>厦门大学
<120>ifna4与ifna10基因在克罗恩病中的应用
<160>2
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<210>1
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