本发明属于动物医学中兽药制备领域，具体是一种岩陀黄酮、黄柏黄酮和当归多糖复合物在制备兽药中的应用，具有显著增强动物机体免疫功能的作用。
背景技术：
岩陀药材为虎耳草科植物，西南鬼灯擎或羽叶鬼灯擎的干燥根茎。在中医上具有收敛、消炎、祛风除湿的功效，常用于治疗痢疾、肠炎、感冒头痛、外伤出血、风湿骨痛、老年性支气管炎等常见疾病。目前在动物医学中的开发应用较少。
黄柏药材是芸香科植物黄皮树的干燥树皮，其味苦，性寒，归肾、膀胧经，具有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮等功效川，中医主要用于治疗湿热泻痢、黄疽、带下、热淋、痔漏、盗汗、骨蒸劳热、疮疡后伤口感染等疾病。现代中药成分研究分析，黄柏中含有生物碱、黄酮、酚类及黄柏内脂等多种生物活性成分。目前在动物医学中的开发应用较少。
当归来源于伞形科植物当归的干燥根，其性温，味甘、辛，归肝、心、脾经。当归根入药，有补血活血、调经止痛、润肠通便和调控免疫活性的功效。其主要成分有挥发油、多糖、多酚、黄酮等。近年来，国内外医学专家研究发现当归有抗缺氧、抗癌、康肤美容、补血活血、抑菌、抗动脉硬化作用等，对当归的深度开发在医药、保健品和化妆品领域取得了一定成效，在动物医学方面研究应用较少。
黄酮是一类具有2-苯基色原酮结构的植物次级代谢产物，是一类广泛存在于植物中的活性物质，在医学上具有抗氧化、抗肿瘤、抗心血管病以及抗炎症等功能，具有广阔的应用前景。目前黄酮类物质在动物生产中的应用较少。
多糖是由糖苷键连接起来的醛糖或酮糖组成的天然大分子物质，是构成生命的四大基本物质之一，广泛地存在于植物体内。研究表明，多糖及其复合物分子具有多种生物活性和重要的生理作用，广泛应用于畜牧业生产中，对保证畜产品的安全和我国畜牧业可持续发展具有重大意义。
本申请提出之前，岩陀、黄柏黄酮和当归多糖复合物用在制备兽药的药物原料作为添加剂的应用尚未见相关报道。
免疫细胞产生的细胞因子和免疫球蛋白是免疫细胞相互作用的重要信号及物质基础，在机体细胞免疫和体液免疫调控中发挥重要作用。免疫细胞种类多，分布广泛。血液中的成熟免疫细胞俗称白细胞，主要由单个核细胞构成，包括单核细胞、淋巴细胞和粒细胞。淋巴细胞包括t、b淋巴细胞，是最主要的免疫细胞，t淋巴细胞参与细胞免疫，b淋巴细胞参与体液免疫。
环磷酰胺常用于抗肿瘤的治疗，其最大的副作用就是免疫抑制，尤其是对体液免疫的抑制，所以，环磷酰胺常用于动物免疫抑制模型的建立。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种岩陀、黄柏黄酮和当归多糖复合物在制备兽药中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种岩陀黄酮、黄柏黄酮和当归多糖复合物在制备兽药中的应用，其特征在于，岩陀黄酮粗提物、黄柏黄酮粗提物和当归多糖粗提物按2:2:1的质量配比组成复合物，用于制备增强动物机体免疫功能的兽药中的药物添加剂，所述岩陀黄酮粗提物从岩陀植物中提取制备得到，所述黄柏黄酮粗提物从黄皮树植物中提取制备得到，所述当归多糖粗提物从当归植物中提取制备得到，所述岩陀黄酮粗提物、黄柏黄酮粗提物和当归多糖粗提物组成的复合物作为兽药中的药物添加剂，添加到兽药中的药物添加剂添加量为1.25~5mg/ml。
2、如权利要求1所述的岩陀黄酮、黄柏黄酮和当归多糖复合物在制备兽药中的应用，其特征在于，所述岩陀黄酮粗提物、黄柏黄酮粗提物和当归多糖粗提物组成的复合物的制备步骤如下：
一、岩陀黄酮的提取：
（1）将晒干的岩陀根茎粉碎后过40目筛，得到岩陀粉；
（2）取岩陀粉末，按料液质量比1:（55-65）加入浓度60%乙醇浸泡，静置过夜，超声波功率280-320w条件下提取10-20min，在水浴锅内65-75℃水浴2.5-3.5小时；
（3）用真空泵抽滤除去药渣，再经减压旋转蒸发仪挥去乙醇，放入65-75℃恒温干燥箱干燥，得到纯度含量为35-40%的岩陀黄酮粗提物；
二、黄柏黄酮的提取：
（1）将晒干的黄皮树的树皮粉碎后过40目筛，得到黄柏粉；
（2）取黄柏粉末，按料液质量比1:（55-65）加入浓度60%乙醇浸泡，静置过夜，超声波功率280-320w条件下提取10-20min，在65-75℃水浴锅水浴2.5-3.5小时；
（3）用真空泵抽滤除去药渣，再经减压旋转蒸发仪挥去乙醇，放入恒温干燥箱控制在65-75℃条件下干燥，得到含量不低于12%的黄柏黄酮粗提物；
三、当归多糖的提取：
（1）取植物当归的干燥根粉碎后过20目筛，得到当归粉；
（2）取当归粉，按料液质量比1:（35-45）加入蒸馏水，在55-65℃水浴及超声波功率280-320w条件下提取10-20min；
（3）上一步骤得到的药液在75-85℃热水中浸提1h，冷却后抽滤得到浓缩液，在浓缩液中加入浓度为95%的乙醇，使浓缩液中乙醇含量达到80%，于4℃低温环境条件下静置过夜；
（4）离心机中1500r/min分离得到沉淀和上清液，收集沉淀于60℃条件下烘干，得到纯度为30%的当归多糖；
四、将所得岩陀黄酮、黄柏黄酮和当归多糖三者按2:2:1的质量配比组成岩陀、黄柏黄酮和当归多糖复合物。
所述的岩陀、黄柏黄酮和当归多糖复合物，在在猪淋巴细胞转化试验和对大鼠的免疫调节试验中显示具有显著增强动物机体免疫功能的效果，并具有提高大鼠淋巴细胞和白细胞数量的作用，使免疫抑制大鼠身体状况得到恢复。
与现有技术相比，本发明具有下述的优益效果：
本发明中的岩陀黄酮、黄柏黄酮和当归多糖提取工艺简单、提取条件温和，所得复合物活性强，试验中表明复合物可在动物上应用；大鼠的免疫调节试验显示所述的复合物具有显著增强动物机体免疫功能的效果，容易开发成兽药使用，具有原料来源广、提高免疫力显著、药用安全和高效的优点。
附图说明
图1为岩陀黄酮、黄柏黄酮和当归多糖复合物对大鼠淋巴细胞数的影响变化情况示意图。
图2为岩陀黄酮、黄柏黄酮和当归多糖复合物对大鼠白细胞数的影响变化情况示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本申请中出现的“药物”与岩陀的提取物黄酮、黄柏的提取物黄酮和当归中提取的当归多糖组成的复合物为同一所指。
实施例1、岩陀中黄酮的提取
（1）将晒干的岩陀根茎粉碎后过40目筛，得到岩陀粉；
（2）取岩陀粉末，按料液比1:60加浓度60%乙醇浸泡，静置过夜，超声15min，70℃水浴锅水浴3小时；
（3）用真空泵抽滤除去药渣，再经减压旋转蒸发仪挥去乙醇，放70℃恒温干燥箱干燥，得到3.68g纯度含量为39.35%的岩陀黄酮粗提物。
实施例2、黄柏中黄酮的提取
（1）将晒干的黄皮树的树皮粉碎后过40目筛，得到黄柏粉；
（2）取黄柏粉，按料液比1:60加浓度60%乙醇浸泡，静置过夜，超声15min，70℃水浴锅水浴3小时；
（3）用真空泵抽滤除去药渣，再经减压旋转蒸发仪挥去乙醇，放70℃恒温干燥箱干燥，得到2.48g纯度含量为12%的黄柏黄酮粗提物。
实施例3、当归中的当归多糖提取
（1）取植物当归的干燥根粉碎后过20目筛，得到当归粉；
（2）取当归粉，液料比为1g:40ml加入蒸馏水，60℃水浴条件下超声提取15min；
（3）80℃热水中浸提1h，冷却后抽滤，在浓缩液中加入浓度为95%的乙醇，使浓缩液中乙醇含量达到80%，于4℃低温环境条件下静置过夜；
（4）离心机中控制转速1500r/min进行分离，沉淀和上清液，收集沉淀于60℃条件下烘干，得到5.65g纯度含量为30%左右的当归多糖提取物。
（5）将所得岩陀黄酮、黄柏黄酮和当归多糖三者按2:2:1的质量配比组成复合物。
实施例4、岩陀黄酮、黄柏黄酮和当归多糖组成的复合物对猪淋巴细胞转化实验：
（1）无菌采集猪前腔静脉血20ml，装进含有肝素钠的抗凝管中。
（2）将抗凝血与稀释液按1:1进行稀释，将稀释液与淋巴细胞分离液按1:2混匀分装到高压灭菌的离心管中，水平离心机1850r/min，进行30min离心。
（3）吸取中间白色絮状物的淋巴细胞层，置于干净的高压灭菌离心管中，加入清洗液混匀后1500r/min，10min离心；弃掉液体，加入1ml红细胞裂解液吹打均匀，静置3min，加入清洗液配平后1500r/min，10min离心；弃掉液体。
（4）完全培养基配制：1640培养基:胎牛血清:双抗比例为89%:10%:1%。
（5）取450μl淋巴细胞悬液到小离心管中，加入50μl台盼蓝染色计数。将细胞悬液稀释至2×105个，置于二氧化碳培养箱进行培养。
（6）将实施例3所得复合物用完全培养基进行溶解，用微孔滤膜进行过滤，配制不同浓度梯度的药物。
（7）取96孔板，按不同药物梯度进行加样，每一浓度梯度为4的重复，对照孔设4个重复，每孔100μl。
（8）刀豆蛋白a（cona）实验：分为无细胞组，加含有20%cona的完全培养基100μl；有细胞组，加含有20%cona的细胞悬液100μl。
（9）无刀豆蛋白a（cona）实验：分为无细胞组，加入完全培养基100μl；有细胞组，加淋巴细胞细胞悬液100μl。
（10）置于二氧化碳培养箱进行培养42~44h。避光加5%的mtt溶液每孔20μl，二氧化碳培养箱培养4h，避光加二甲亚砜每孔100μl。紫外分光光度计570nm处测定od值。
（11）计算：转化率=（od实验组-od对照组）/od对照组×100%；结果大于1表示药物有免疫增强效果。
（12）结果：在药物浓度为5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml时，cona复合物对应的转化率为：3.294、3.275、1.908。结果表明实施例3所得复合物在1.25~5mg/ml的浓度条件下具有显著提高免疫力的效果。
实施例5、提高大鼠免疫力检测实验：
试验第0天，将21只体重为180-200g的成年健康清洁级昆明种雄性大鼠，随机分为3组，即：空白对照组（
在试验第0、7、14、21、28、35天进行采血，分别测定血常规指标并进行统计分析。
结果：在试验过程中，空白对照组的大鼠表现正常，采食正常，精神状况良好，未出现死亡。岩柏当药物组在灌喂环磷酰胺后，精神沉郁，食欲不振，灌喂药物之后，精神状况明显好转，食欲增加。灌喂环磷酰胺的环磷酰胺组，未经任何处理，每天正常灌喂生理盐水，给予相同应激条件，精神沉郁，食欲不振，后期出现死亡。
由图1-2所示结果可见，对照岩柏当组、空白对照组和环磷酰胺组的2个免疫指标，均呈现先下降后上升的趋势，0-7d下降，7-35d上升。岩柏当组第7-14d，上升趋势明显，超过空白对照组和环磷酰胺组。第7天时环磷酰胺组和岩柏当组在灌喂环磷酰胺后比空白组差异显著（p＜0.05）；在第14天时，各组灌喂相应药物后，岩柏当组高于环磷酰胺组差异显著（p＜0.05）；在21天时，岩柏当组比环磷酰胺组差异显著（p＜0.05）；在第35天时，各组恢复正常水平。可见在对大鼠进行免疫抑制后灌喂复合物，能快速激活体内的免疫系统，调节机体免疫功能。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由权利要求书及其等效物界定。