偏头七用于制备抗真菌药物的用途的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及偏头七用于制备抗真菌药物的用途。

背景技术

偏头七属于秦岭七药的一种，为百合科鹿药属多年生草本植物鹿药smilacinajaponicaa.gray及管花鹿药smilacinahenryi(baker).wangtang的干燥根及根茎。具有补气益肾、祛风除湿和活血调经的功效，可用于治疗风湿骨痛、神经性头痛、乳腺炎、月经不调、痈疖肿毒和跌打损伤等病症。

但是目前，国内外未见偏头七抗真菌作用的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供偏头七用于制备抗真菌药物的用途。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了偏头七在制备抗真菌药物中的应用。

优选地，选用偏头七的干燥根及根茎作为制备抗真菌药物的原料。

优选地，所述真菌包括敏感真菌菌株和耐药真菌菌株。

进一步优选地，所述敏感真菌菌株包括：敏感白念珠菌(sc5314)，近平滑念珠菌(22019)和新生隐球菌(32609)；所述耐药真菌菌株包括：耐药白念珠菌(103)，耐药热带念珠菌，天然耐药克柔念珠菌(atcc2340)和天然耐药光滑念珠菌(atcc2281)。

本发明公开了一种抗真菌药物，是将偏头七醇提物与药用辅料制成片剂、胶囊剂或注射剂。

优选地，偏头七醇提物的制备方法如下：

将偏头七干燥根及根茎粉碎成粉末，按1g：20ml的料液比，用75％的乙醇冷凝回流提取2小时，放冷、过滤除去残渣，将药液浓缩干燥制得。

优选地，所述的药用辅料包括稳定剂、增溶剂、润滑剂和崩解剂中的一种或几种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开的偏头七用于制备抗真菌药物的用途，通过体外细胞实验表明，偏头七对耐药白念珠菌103、白念珠菌sc5314、新生隐球菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌具有不同程度的抗真菌甚至是杀真菌作用，因此可将偏头七用作抗真菌药物，为偏头七开辟了新的用途，将其用于制备抗真菌药物，为真菌感染治疗提供了新的候选药物。

附图说明

图1为不同浓度的偏头七对各种真菌生长情况的影响图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

一、偏头七对不同真菌的作用

1、试药

偏头七：购于德尔康医药连锁(槐芽第四连锁店)。

氟康唑：sigma公司，批号036m4709v。

二甲亚砜(dmso)：天津市天力化学试剂有限公司。

各试药置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀，分别进行药效学检验。

2、菌株

使用的菌株，包括：

1)敏感菌株：敏感白念珠菌(sc5314)、近平滑念珠菌(22019)和新生隐球菌(32609)；

2)耐药菌株：耐药白念珠菌(103)、耐药热带念珠菌、天然耐药克柔念珠菌(atcc2340)和天然耐药光滑念珠菌(atcc2281)。

以上菌株均由上海长海医院真菌室提供，分别采自长海医院不同科室临床样本，并经形态学和生化学鉴定。

所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基(sda)划板活化，白念珠菌、热带念珠菌、新生隐球菌等球状菌于30℃培养2-3天后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置sda斜面，用上述方法培养后于4℃保存备用。

3、培养液/基

1)rpmi1640液体培养液

rpmi1640(gibcobrl)10g，nahco32.0g，吗啡啉丙磺酸(sigma)34.5g(0.165mol)，加三蒸水900ml溶解，1mol/lnaoh调ph至7.0(25℃)，三蒸水定容至1000ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃保存备用。

2)沙堡葡萄糖琼脂固体培养基(sda)

蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整ph至7.0，以三蒸水定容至1000ml，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。

3)yepd培养液

酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，三蒸水定容至1000ml，高压灭菌(121℃，15min)后于4℃保存备用。

4、仪器设备

隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；

thz－82a台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；

sw-ct-if型超净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。

5、偏头七提取物和氟康唑贮备液

将购买的偏头七，粉碎成细粉末，称取5g，用20倍体积(100ml)75％的乙醇，冷凝回流提取2小时，放冷，过滤除去残渣，将药液旋转浓缩至干燥，取15mldmso溶解完全，配制母液浓度为0.333g/ml，分装，-20℃保存待用。

将市售的氟康唑用dmso溶解，配成浓度为6.4mg/ml，于-20℃保存备用。

6、菌液制备

实验前，用接种圈从4℃保存的sda培养基上分别挑取各球状真菌少量，分别接种至1mlyepd培养液，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。然后将各菌液分别加至1mlyepd培养液中，用上述方法再次活化，培养16h，用血细胞计数板计数，以rpmi1640培养液分别调整各菌液浓度至1×10³～5×10³cfu/ml。

7、药敏板制备：

各菌株分别取无菌96孔板一块，于每排1号孔加rpmi1640液体培养基100μl作空白对照；3～12号孔各加上述新鲜配制的菌液100μl；2号孔加菌液198μl；12号孔不含药物，只加菌液100μl作阳性生长对照。在每排的2号孔加母液浓度为0.3333g/ml和6.4mg/ml的偏头七或氟康唑各2μl。

对2～11号孔进行10级倍比稀释，使各孔的最终偏头七药物浓度分别为3330μg/ml、1665μg/ml、832.5μg/ml、416.3μg/ml、208.1μg/ml、104.1μg/ml、52.0μg/ml、26.0μg/ml、13.0μg/ml和6.5μg/ml，氟康唑的药物浓度分别为64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml。各孔中dmso含量均低于1％。将各药敏板于30℃恒温箱培养。

8、mic值判定：

在30℃恒温箱中，念珠菌培养24h，新生隐球菌培养72h，观察实验结果，并确定其mic值。观察结束后，放回恒温培养箱中，继续培养。当药物的mic值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：mic值高于最高浓度64μg/ml时，计为“>64μg/ml”；mic值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.125μg/ml”。上述实验均平行操作3次，当mic值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为mic值；当mic值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。

实验结果如下表1所示：

表1偏头七对各种真菌的mic值(μg/ml)

从表1可以看出，偏头七作用各种真菌24h和48h后，对光滑念珠菌和新生隐球菌的mic值均为416.3μg/ml，对白念珠菌103、白念珠菌sc5314和近平滑念珠菌的mic值均为832.5μg/ml，对克柔念珠菌的mic值均为1665.0μg/ml，对热带念珠菌的mic值，24h为416.3μg/ml，48h为832.5μg/ml。当药物作用48h后，对克柔念珠菌、光滑念珠菌和新生隐球菌的mic值分别32μg/ml、8μg/ml和8μg/ml，这显示了偏头七具有抗真菌作用。

二、偏头七对各种真菌生长情况的影响

所用药物、菌株及实验材料同上述所示。

将各菌株以1：100接种至1mlyepd培养液，于30℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至1mlyepd培养液中，用上述方法再次活化16h后，稀释调整菌液浓度至1×10⁵～5×10⁵cfu/ml，取1ml新鲜配制的菌液放置于玻璃管中，分别加入偏头七或氟康唑，药物分组情况为：空白组(不含药)、氟康唑(64μg/ml)、偏头七(416.3μg/ml)、偏头七(832.5μg/ml)、偏头七(1665μg/ml)、偏头七(3330μg/ml)。

实验结果如图1所示，从图1中可以看出，培养24h和48h后，空白组试管内的菌液浑浊，而不同浓度的偏头七作用试管内的菌液均保持较澄清，进一步显示了偏头七各种真菌生长的抑制作用。

三、偏头七对各种真菌存活的影响

所用药物、菌株及实验材料同上述所示。

实验前，从4℃保存的sda培养基上挑取菌克隆少量，接种至1mlyepd培养液，于37℃，200rpm振荡培养16h，使真菌处于指数生长期后期。以rpmi1640培养液稀释并调整菌液浓度至1×10⁵cfu/ml。分别于上述菌液中加入氟康唑使其终浓度为64mg/ml、16mg/ml，阳性提取物终浓度为104.1mg/ml、208.2mg/ml、416.3mg/ml和832.5mg/ml，空白对照加入相同体积的dmso，所有菌液中dmso含量均低于0.5％。于37℃孵箱中，以200rpm振荡培养，分别于0h、24h，各样品分别取样，稀释不同浓度，涂铺于sda平板，培养48小时后数克隆，计算各组的菌落存活数。

实验结果如下表2所示：

表2.偏头七作用7种不同真菌后的存活菌落数(cfu/ml)

由表2可知，浓度为416.3μg/ml和832.5μg/ml偏头七作用7种不同真菌(白念珠菌sc5314，近平滑念珠菌，新生隐球菌，白念珠菌103，热带念珠菌，克柔念珠菌，光滑念珠菌)24h后，菌落数由约10⁵cfu/ml变为0，这表明浓度为416.3μg/ml和832.5μg/ml的偏头七对这7种真菌均具有较好的杀灭活性。

综上所述，本发明通过体外细胞实验表明，偏头七对耐药白念珠菌103、白念珠菌sc5314、新生隐球菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌具有不同程度的抗真菌甚至是杀真菌作用，表明偏头七具有抗真菌谱广且杀真菌活性的特点，因此可将偏头七用作抗真菌药物。本发明为偏头七开辟了新的用途，将其用于制备抗真菌药物，为真菌感染治疗提供了新的候选药物，为临床高效治疗真菌甚至是耐药真菌的感染，提供新的治疗途径。