一种提高脱细胞基质生物相容性的交联方法与流程

本发明涉及一种脱细胞基质的交联处理方法以及应用交联脱细胞基质制备的生物材料及医疗器械技术领域。

背景技术：

随着人口老龄化严重，心脏瓣膜病的发病率正在提高。心脏瓣膜病是一种常见的瓣膜衰退疾病。主要表现为心脏瓣膜处狭窄或瓣膜关闭不全。

心脏瓣膜病的主要治疗方法是心脏瓣膜置换。手术方式主要分为开胸瓣膜置换手术和介入瓣膜置换手术。开胸手术对病人造成极大的创伤，风险高，恢复慢，需要体外循环支持，很多患者，尤其是老年患者无法进行开胸手术。介入瓣膜置换手术对病人创伤小，风险低，是未来瓣膜置换手术的主要发展趋势。

心脏瓣膜主要分为机械心脏瓣膜和生物心脏瓣膜。置换机械瓣的患者由于机械瓣生物相容性差，需要长期服用抗凝药物以减少机械瓣处凝血的发生。但同时，也会伴随着出血的风险。而且机械瓣的置换需要开胸手术，对患者造成巨大的创伤。而生物瓣由于其本身良好的生物相容性及介入置换技术的发展，使其成为一个非常有潜力的瓣膜种类。

目前商业应用的生物心脏瓣膜一般是由牛心包膜、猪心瓣膜和猪心包膜通过戊二醛交联制备而成。戊二醛交联的方法据有工艺简单、成本低廉、胶原蛋白结构稳定及较好的力学性能。但戊二醛交联的心脏瓣膜存在不容忽视的问题。由戊二醛交联不能对弹性蛋白起到保护作用，容易引起心脏瓣膜的力学性能下降；戊二醛交联的心脏瓣膜容易发生钙化问题，影响使用寿命；戊二醛及残余的醛基具有较强毒性，易引发炎症反应，造成瓣膜失效。

因此，通过改变脱细胞基质交联方法，在保持原有交联效果基础上，提高弹性蛋白的保护作用，降低钙化反应，提高生物相容性对于生物心脏瓣膜的科学研究以及相关产业化应用的发展具有重大的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决上述现有技术的不足而提供一种具有提高脱细胞基质中弹性蛋白的稳定性、提高脱细胞基质的抗钙化性能和提高交联脱细胞基质材料的生物相容性的提高脱细胞基质生物相容性的交联方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

一种提高脱细胞基质生物相容性的交联方法，具体包括以下步骤：

1、获取新鲜的动物组织材料,并于4℃下低温保存；

2、将动物组织材料脱细胞，制成脱细胞基质；

3、将脱细胞基质放入蒸馏水与酒精按比例配置的清洗液中，于室温下超声清洗清洗干净；

4、将清洗过的脱细胞基质在20-45℃的温度的条件下浸泡于质量浓度为1-10%的甲基丙烯酸缩水甘油酯溶液当中，并持续反应72-240小时，使得脱细胞基质与甲基丙烯酸缩水甘油酯通过化学键结合；

5、将脱细胞基质清洗干净；

6、将脱细胞基质中接入的双键通过热引发聚合引发剂在温度为20-45℃的条件下进行热引发12-48小时或在室温的条件下通过紫外灯光源进行光引发方式聚合5-30分钟；

7、将聚合后的脱细胞基质清洗干净。

进一步的，所述步骤1中的动物组织来源于猪和牛，所述的动物组织部位包括心包膜、瓣膜、肠膜、脑膜、肺膜、血管、小肠、大肠、皮肤和韧带的一种或多种。

进一步的，所述所述步骤2中的脱细胞基质主要成分为胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸和明胶的一种或多种。

进一步的，所述步骤4中的脱细胞基质与甲基丙烯酸缩水甘油酯通过氨基与环氧基反应结合、羧基与环氧基反应结合和羟基与环氧基反应结合中的其中一种。

进一步的，在所述的步骤6中，所述热引发聚合引发剂包括有机过氧化物引发剂、无机过氧化物引发剂和偶氮类引发剂，所述光引发聚合引发剂包括2-羟基-2-甲基-1-苯基丙酮、1-羟基环己基苯基甲酮、2-甲基-2-(4-吗啉基)-1-[4-(甲硫基)苯基]-1-丙酮、2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮、2,4,6-三甲基苯甲酰基-二苯基氧化膦和2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮。

本发明的有益效果是：

1.本发明可以提高脱细胞基质中弹性蛋白的稳定性，潜在提高了脱细胞基质材料的力学性能，提高了材料的使用寿命。

2.本发明可以提高脱细胞基质的抗钙化性能。

3.本发明可以降低交联脱细胞基质的细胞毒性、免疫反应，提高交联脱细胞基质材料的生物相容性。

附图说明

图1为本发明所述的制备流程及甲基丙烯酸缩水甘油酯与脱细胞基质的链接方式；

图2为弹性蛋白纤维的维多利亚蓝的染色示意图。

图3为钙元素的茜素红染色示意图。

图4为马森染色示意图；

图5为纤维囊密度的统计数据。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实例对本发明进一步详细说明，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，全部实例中，新鲜的动物组织材料来自于当地屠宰场。

实例1：

本实例的处理方法如下：

1、获取新鲜的猪心包膜，并于4℃湿润状态下保存；

2、将动物组织材料脱细胞，制成脱细胞基质；

3、将脱细胞基质清洗干净；

4、将清洗过的脱细胞基质浸泡于质量浓度为1%甲基丙烯酸缩水甘油酯溶液当中25℃反应72小时；

5、将脱细胞基质清洗干净；

6、将脱细胞基质中接入的双键通过热引发方式聚合，具体为将脱细胞基质浸入5mm过硫酸钾溶液中，40℃反应24小时；

7、将聚合后的脱细胞基质清洗干净。

根据本实例提供的处理方法，在步骤3中，需使用蒸馏水与酒精的混合溶液多次超声清洗，将脱细胞过程中引入的杂质洗涤干净。

根据本实例提供的处理方法，在步骤4中，需将脱细胞基质与甲基丙烯酸缩水甘油酯溶液震荡充分接触，使甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基团与脱细胞基质中的残基充分反应，提高接入双键的含量，提高交联密度，进而使交联脱细胞基质材料更加稳定。

根据本实例提供的处理方法，在步骤5中，需使用蒸馏水与酒精的混合溶液多次超声清洗，将步骤4中引入的未反应的游离甲基丙烯酸缩水甘油酯清洗干净。

根据本实例提供的处理方法，在步骤6中，需选择合适的引发剂浓度、反应温度与反应时间，使聚合反应可以发生，聚合度足够大以提高交联密度，增加脱细胞基质结构的稳定性。

根据本实例提供的处理方法，在步骤7中，需使用蒸馏水多次超声清洗，将步骤6中引入的引发剂等杂质清洗干净。

根据本实例提供的处理方法，制备的交联脱细胞基质通过在甲基丙烯酸缩水甘油酯与弹性蛋白疏水链段之间形成氢键，从而保护了弹性蛋白。此外，通过本实例提供的处理方法可以提高交联密度，对稳定弹性蛋白起到了促进作用。

根据本实例提供的处理方法，制备的交联脱细胞基质没有引入戊二醛，同时遮蔽了大部分脱细胞基质中的残基，使得脱细胞基质材料结合钙离子能力下降，从而降低了钙化反应。

根据本实例提供的处理方法，制备的交联脱细胞基质没有引入戊二醛这种具有生物毒性的交联剂，取而代之的是一种生物相容性的交联剂，因此降低了交联脱细胞基质材料的细胞毒性及免疫反应。

实例2：

1、获取新鲜的猪心包膜，并于4℃湿润状态下保存；

2、将动物组织材料脱细胞，制成脱细胞基质；

3、将脱细胞基质清洗干净；

4、将清洗过的脱细胞基质浸泡于质量浓度为3%甲基丙烯酸缩水甘油酯溶液当中25℃反应120小时；

5、将脱细胞基质清洗干净；

6、将脱细胞基质中接入的双键通过热引发方式聚合，具体为将脱细胞基质浸入5mm过硫酸钾溶液中，40℃反应24小时；

7、将聚合后的脱细胞基质清洗干净。

实例3：

1、获取新鲜的猪心包膜，并于4℃湿润状态下保存；

2、将动物组织材料脱细胞，制成脱细胞基质；

3、将脱细胞基质清洗干净；

4、将清洗过的脱细胞基质浸泡于质量浓度为5%甲基丙烯酸缩水甘油酯溶液当中25℃反应240小时；

5、将脱细胞基质清洗干净；

6、将脱细胞基质中接入的双键通过热引发方式聚合，具体为将脱细胞基质浸入20mm过硫酸钾溶液中，40℃反应24小时；

7、将聚合后的脱细胞基质清洗干净。

实例4：

1、获取新鲜的猪血管组织，并于4℃湿润状态下保存；

2、将动物组织材料脱细胞，制成脱细胞基质；

3、将脱细胞基质清洗干净；

4、将清洗过的脱细胞基质浸泡于质量浓度为5%甲基丙烯酸缩水甘油酯溶液当中25℃反应168小时；

5、将脱细胞基质清洗干净；

6、将脱细胞基质中接入的双键通过热引发方式聚合，具体为将脱细胞基质浸入20mm过硫酸钾溶液中，40℃反应24小时；

7、将聚合后的脱细胞基质清洗干净。

实例5：

1、获取新鲜的猪心包膜，并于4℃湿润状态下保存；

2、将动物组织材料脱细胞，制成脱细胞基质；

3、将脱细胞基质清洗干净；

4、将清洗过的脱细胞基质浸泡于质量浓度为5%甲基丙烯酸缩水甘油酯溶液当中25℃反应240小时；

5、将脱细胞基质清洗干净；

6、将脱细胞基质中接入的双键通过光引发方式聚合，具体为将脱细胞基质浸入质量分数为1%的irgacure2959溶液中，40℃浸泡24小时；

7、将脱细胞基质置于紫外交联箱中照射10分钟；

8、将聚合后的脱细胞基质清洗干净。

实验例

如图1所示，图为本发明所述的制备流程及甲基丙烯酸缩水甘油酯与脱细胞基质的链接方式。

如图2所示，本发明提供的处理方法在交联脱细胞基质与传统戊二醛交联脱细胞基质经过弹性蛋白酶降解后，可以有效保护脱细胞基质中的弹性蛋白，其中pgma为本发明所制备的交联脱细胞基质，glut为戊二醛交联的脱细胞基质。

如图3所示，本发明提供的处理方法通过交联脱细胞基质与传统戊二醛交联脱细胞基质经过30天皮下植入后，可以有效降低钙化反应，其中pgma为本发明所制备的交联脱细胞基质，glut为戊二醛交联的脱细胞基质。

如图4所示，本发明提供的处理方法通过交联脱细胞基质与传统戊二醛交联脱细胞基质经过30天皮下植入后，可以有效降低材料在植入动物皮下后产生的免疫反应，图4中星号为材料，红线另一侧为纤维囊；此外图4中纤维囊致密程度可以反映免疫反应程度。

本发明所制备交联脱细胞基质与传统戊二醛交联脱细胞基质经过30天皮下植入后，马森染色切片中，纤维囊密度的统计数据如图5所示：

其中点划线为pgma,实线为glut。

本发明的有益效果是：

1.本发明可以提高脱细胞基质中弹性蛋白的稳定性，潜在提高了脱细胞基质材料的力学性能，提高了材料的使用寿命。

2.本发明可以提高脱细胞基质的抗钙化性能。

3.本发明可以降低交联脱细胞基质的细胞毒性、免疫反应，提高交联脱细胞基质材料的生物相容性。

当然，以上只是本发明的典型实例，除此之外，本发明还可以有其它多种具体实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求保护的范围之内。