一种烟草活性组分、提取方法及其应用与流程

本发明涉及烟草产品加工提取技术领域，具体涉及一种烟草活性组分、提取方法及其应用。

背景技术：

烟草也称仙草，是一味传统的中药材，它的无机成分包括水、矿质元素；有机成分主要包括糖类、生物碱、杂环类、色素、酚类、萜类、有机酸类、脂质类、醇类、醛酮类等。其中，烟草中有机成分具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化活性、清除体内自由基等多种功能。

目前，为了实现对烟草活性组分的提取，一般采用超临界提取、索氏提取、超声波提取方式。采用无水乙醇、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷作为提取溶剂。其中低极性溶剂如石油醚、正己烷，中极性溶剂丙酮、二氯甲烷，这些溶剂多为易挥发、易燃、有毒溶剂，对工业生产设备、人员等要求高，且得到的烟草活性组分的含量少，这就大大限制了烟草活性组分的进一步研究和应用。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供一种烟草活性组分、提取方法及其应用，以提高烟草活性组分的提取量。

第一方面，本发明提供了一种烟草活性组分的提取方法，该方法包括以下步骤：

(1)预处理：对烟草原料进行烘干处理，以及将烘干处理后的烟草原料进行超微粉碎处理，得到烟草超微粉；

(2)常温水提：在烟草超微粉中加入提取溶剂，在常温下进行提取操作；对提取操作后的烟草超微粉进行离心处理，并收集离心处理后的沉淀物；步骤(2)中的提取溶剂为纯化水；

(3)高温水提：在步骤(2)中收集的沉淀物中加入提取溶剂，在90-100℃的提取温度下进行浓缩提取操作；对浓缩提取操作后得到的浓缩提取液进行降温处理、离心处理，并收集离心处理后的沉淀物；步骤(3)中的提取溶剂为纯化水；

(4)甲醇提取：在步骤(3)中得到的沉淀物中加入提取溶剂，在0-4℃的提取温度下进行浸渍提取操作，对浸渍提取物进行离心处理，并收集离心处理后的上清，将收集的上清进行旋转蒸发浓缩烘干处理，得到烟草活性组分；步骤(4)中的提取溶剂为85-100％的甲醇。

优选地，步骤(1)中的烘干处理是将烟草原料放置在烘箱中进行烘干，使得烘干处理后的烟草原料的含水量小于5％，烘干温度为50-60℃，烘制时间为4-8h；

优选地，步骤(1)中的超微粉碎处理是将烘干处理后的烟草原料，使用50-80目筛网的粉碎机进行粉碎处理，并对粉碎处理后的烟草原料，使用200-400目筛网的粉碎机进行粉碎处理，得到所述烟草超微粉。

优选地，步骤(2)中加入提取溶剂的质量是所述烟草超微粉的质量的2-4倍；

优选地，步骤(2)中的提取操作是指将所述烟草超微粉和提取溶剂置于提取罐中，提取时间为0.5-3h；

优选地，步骤(2)中的离心处理是指：离心温度为8-12℃，离心时间为0.5-1.5h，转速为3000-6000rpm/min。

优选地，步骤(3)中加入提取溶剂的质量是沉淀物的质量的1.2-2.4倍；

优选地，步骤(3)中的浓缩提取操作的提取时间为0.5-1.5h；

优选地，步骤(3)中的离心处理是指将降温处理后的所述浓缩提取液置于离心瓶中，离心温度为8-12℃，离心时间为0.5-1.5h，转速为3000-6000rpm/min。

优选地，步骤(4)中加入提取溶剂的质量是沉淀物的质量的1.5-2.5倍；

优选地，步骤(4)中的浸渍提取操作是指每隔0.5h搅拌一次，提取时间为12-24h；

优选地，步骤(4)中的离心处理是指将所述浸渍提取物置于离心瓶中，离心温度为：3-5℃，离心时间为0.5-1.5h，转速为3000-6000rpm/min；

优选地，步骤(4)中的浓缩烘干处理的温度为60-70℃。

第二方面，本发明提供了一种根据上述任一所述提取方法提取到的烟草活性组分。

第三方面，本发明提供了一种根据所述烟草活性组分在制备抗菌、抗癌药物中的应用。

本发明提供一种烟草活性组分、提取方法及其应用，通过对烟草原料进行预处理，并针对预处理后的烟草原料依次进行常温提取、高温提取、甲醇提取三次操作，且使用高极性溶剂纯化水、甲醇作为提取溶剂，通过采用不同提取溶剂不同提取条件，可以保证将烟草原料中的烟草活性组分实现充分提取，提高烟草活性组分的提取含量。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例。

附图说明

图1是烟草活性组分提取方法的流程图；

图2是烟草活性组分抑制真菌-虫草菌生长示意图；

图3是烟草活性组分抑制细菌-大肠杆菌生长示意图；

图4是烟草活性组分对人肺肿瘤a549细胞生长抑制示意图；

图5是烟草活性组分对人肝癌hep-g2细胞生长抑制示意图；

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

本发明提供了一种烟草活性组分的提取方法，该提取方法请参考图1所示的流程图，该提取方法可以包括以下步骤：

(1)预处理：对烟草原料进行烘干处理，以及将烘干处理后的烟草原料进行超微粉碎处理，得到烟草超微粉；

(2)常温水提：在烟草超微粉中加入提取溶剂，在常温条件下进行提取操作；对提取操作后的烟草超微粉进行离心处理，并收集离心处理后的沉淀物；步骤(2)中的提取溶剂为纯化水；

(3)高温水提：在步骤(2)中收集的沉淀物中加入提取溶剂，在90-100℃的提取温度下进行浓缩提取操作；对浓缩提取操作后得到的浓缩提取液进行降温处理、离心处理，并收集离心处理后的沉淀物；步骤(3)中的提取溶剂为纯化水；

(4)甲醇提取：在步骤(3)中得到的沉淀物中加入提取溶剂，在0-4℃的提取温度下进行浸提提取操作，对浸渍提取物进行离心处理，并收集离心处理后的上清，将收集的上清进行旋转蒸发浓缩烘干处理，得到烟草活性组分；步骤(4)中的提取溶剂为85-100％的甲醇。

下面分别以具体实施例对本发明的提取方法进行进一步说明。

实施例1

本发明实施例1提供了一种烟草活性组分的提取方法，包括以下步骤：

(1)预处理。

称取30kg烟草原料，放置在烘箱中进行烘干，烘干温度50℃，烘制时间4h，烘至烟草含水量小于5％取出；取烘干处理后的烟草原料，使用50目筛网的粉碎机粉碎后，并放入200目筛网的粉碎机中进行超微粉碎处理，得到烟草超微粉。

(2)常温水提。

称取30kg烟草超微粉加入到200l提取罐中，加入100kg纯化水，常温搅拌提取0.5h；搅拌提取结束后转移至离心瓶中，8℃离心0.5h，转速为3000rpm/min；收集离心处理后的沉淀物。

(3)高温水提。

称取步骤(2)中的沉淀物25kg，加入到100l浓缩提取罐中；加入60kg纯化水，打开浓缩提取罐加热开关；加热到90℃后，在90℃的温度下浓缩提取0.5h；向浓缩提取罐夹套中通入循环水，以对浓缩提取液进行降温处理，使其降温至室温；将浓缩提取液转移至离心瓶中进行离心处理，8℃离心0.5h，转速为3000rpm/min；并收集离心处理后的沉淀物。

(4)甲醇提取。

将步骤(3)中得到的沉淀物加入到不锈钢桶中，每桶10kg；每桶中加入15kg的甲醇，甲醇的质量分数为92％，在0℃的提取温度下浸渍提取操作；其中，提取时间为12h，每隔0.5h对桶内物质搅拌一次；将浸渍提取物置于离心瓶中，3℃离心1.5h，转速为3000rpm/min；收集离心处理后的上清，将收集的上清转移至50l旋蒸中60℃浓缩处理，在浓缩完成后转移至烘盘中，60℃烘制成浸膏，得到烟草活性的组分。

实施例2

本发明实施例2提供了一种烟草活性组分的提取方法，包括以下步骤：

(1)预处理。

称取40kg烟草原料，放置在烘箱中进行烘干，烘干温度55℃，烘制时间6h，烘至烟草含水量小于5％取出；取烘干处理后的烟草原料，使用60目筛网的粉碎机粉碎后，并放入300目筛网的粉碎机中进行超微粉碎处理，得到烟草超微粉。

(2)常温水提。

称取40kg烟草超微粉加入到200l提取罐中，加入120kg纯化水，常温搅拌提取1.5h；搅拌提取结束后转移至离心瓶中，10℃离心1h，转速为5000rpm/min；收集离心处理后的沉淀物。

(3)高温水提。

称取步骤(2)中的沉淀物30kg，加入到100l浓缩提取罐中；加入60kg纯化水，打开浓缩提取罐加热开关；加热到100℃后，在100℃的温度下浓缩提取1h；向浓缩提取罐夹套中通入循环水，以对浓缩提取液进行降温处理，使其降温至室温；将浓缩提取液转移至离心瓶中进行离心处理，10℃离心1.5h，转速为5000rpm/min；并收集离心处理后的沉淀物。

(4)甲醇提取。

将步骤(3)中得到的沉淀物加入到不锈钢桶中，每桶10kg；每桶中加入25kg的甲醇，甲醇的质量分数为85％，在4℃的提取温度下浸渍提取操作；其中，提取时间为18h，每隔0.5h对桶内物质搅拌一次；将浸渍提取物置于离心瓶中，4℃离心1h，转速为5000rpm/min；收集离心处理后的上清，将收集的上清转移至50l旋蒸中65℃浓缩处理，在浓缩完成后转移至烘盘中，65℃烘制成浸膏，得到烟草活性的组分。

实施例3

本发明实施例3提供了一种烟草活性组分的提取方法，包括以下步骤：

(1)预处理。

称取50kg烟草原料，放置在烘箱中进行烘干，烘干温度60℃，烘制时间8h，烘至烟草含水量小于5％取出；取烘干处理后的烟草原料，使用80目筛网的粉碎机粉碎后，并放入400目筛网的粉碎机中进行超微粉碎处理，得到烟草超微粉。

(2)常温水提。

称取50kg烟草超微粉加入到200l提取罐中，加入120kg纯化水，常温搅拌提取0.5h；搅拌提取结束后转移至离心瓶中，12℃离心1.5h，转速为6000rpm/min；收集离心处理后的沉淀物。

(3)高温水提。

称取步骤(2)中的沉淀物45kg，加入到100l浓缩提取罐中；加入60kg纯化水，打开浓缩提取罐加热开关；加热到95℃后，在95℃的温度下浓缩提取1.5h；向浓缩提取罐夹套中通入循环水，以对浓缩提取液进行降温处理，使其降温至室温；将浓缩提取液转移至离心瓶中进行离心处理，12℃离心1h，转速为6000rpm/min；并收集离心处理后的沉淀物。

(4)甲醇提取。

将步骤(3)中得到的沉淀物加入到不锈钢桶中，每桶10kg；每桶中加入25kg的甲醇，甲醇的质量分数为100％，在0℃的提取温度下浸渍提取操作；其中，提取时间为24h，每隔0.5h对桶内物质搅拌一次；将浸渍提取物置于离心瓶中，5℃离心1.5h，转速为6000rpm/min；收集离心处理后的上清，将收集的上清转移至50l旋蒸中70℃浓缩处理，在浓缩完成后转移至烘盘中，70℃烘制成浸膏，得到烟草活性的组分。

实施例4：烟草活性组分抑制真菌-虫草菌的实验

(1)配置固体培养基：酵母提取物0.2g、蛋白胨0.5g、葡萄糖0.2g、磷酸氢二钾0.1g、硫酸镁0.05g、琼脂1.5g定容在100ml，高压灭菌，待温度合适时，在超净工作台内倒平板，凝固后使用。

(2)虫草菌接种：将虫草菌接种到固体培养基培养皿内，用涂布棒涂布均匀，盖好培养皿。

(3)琼脂打孔：在涂布有菌液的培养皿上用1ml枪头打三个孔。

(4)添加烟草活性组分：打完孔用无菌药芍将孔中枪头未带出的部分培养基挑出，用纯水稀释烟草活性组分，浓度为0.2g/ml，用移液枪移取200μl稀释液至菌液培养皿的三个孔中，培养皿做好虫草菌标记和实验日期。

(5)培养：将培养皿放入培养箱中27℃，培养48-96小时。

(6)实验结果如图2所示：利用观片机查看培养结束后的培养皿，孔的周围没有生长出菌种，因此表明烟草活性组分对虫草菌具有抑制作用。

实施例5：烟草活性组分抑制细菌-大肠杆菌的实验

(1)设置固体培养基：酵母提取物0.2g、蛋白胨0.5g、葡萄糖0.2g、琼脂1.5g定容在100ml，高压灭菌，待温度合适时，在超净工作台内倒平板，凝固后使用。

(2)大肠杆菌接种：将大肠杆菌接种到固体培养基培养皿内，用涂布棒涂布均匀，盖好培养皿。

(3)琼脂打孔：在涂布有菌液的培养皿上用1ml枪头打三个孔。

(4)添加烟草活性组分：打完孔用无菌药芍将孔中枪头未带出的部分培养基挑出，用纯水稀释烟草活性组分，浓度为0.2g/ml，用移液枪移取200μl稀释液至菌液培养皿的三个孔中，培养皿做好大肠杆菌标记和实验日期。

(5)培养：将培养皿放入培养箱中37℃，培养48-96小时。

(6)实验结果如图3所示：观片机查看培养结束后的培养皿，孔的周围没有生长出菌种，因此表明烟草活性组分对大肠杆菌具有抑制作用。

实施例6：烟草活性组分的毒理实验

动物：健康的小鼠54只雌雄各半体重(30g左右)。

药物：实施例1得到的烟草活性组分

实验方法：将50只健康小鼠分为5组，每组10只，雌雄各半，分为高剂量组、较高剂量组、中剂量组、低剂量组、较低剂量组、低剂量组。再取4只健康小鼠为一组雌雄各半作为空白组。以上各组每天灌胃给药一次，连续灌胃给药观察14d。

检测指标：每天对各组小鼠进行观察，是否有死亡现象出现，记录死亡数量并计算其死亡率。

实验计算：

(1)利用下述式(1)计算半数致死量：

logld50＝xm-i(p-0.5)式(1)

其中，ld50用于表征半数致死量，xm用于表征最高致死量的对数值，i用于表征相邻剂量的对数差，∑p用于表征各组雌雄死亡率的总和。

(2)利用下述式(2)计算半数致死量的标准误差：

其中，se50用于表征半数致死量的标准误差，n用于表征每组动物数，

∑p2用于表征各组雌雄死亡率平方值之和。

实验结果：

表1：烟草活性组分对小鼠死亡率的影响

注：剂量＝烟草活性组分质量/10g小鼠体重

由表1和实验计算方法，计算得雌鼠ld50＝34.05mg/10g、雄鼠ld50＝25.76mg/10g。雌小鼠ld50大于雄小鼠ld50，雌雄ld50平均值＝29.905mg/10g，根据相关产品毒理学指标(天然提取物)ld50＝2500～5000mg/kg属于低毒性产品。说明烟草活性组分属于低毒组分。

实施例7：抑制人肺肿瘤a549细胞生长的试验

细胞培养：在5％co2，37℃，饱和湿度下，用rpmi1640(10％fbs+1％ps)培养基培养人肺肿瘤a549细胞，选取对数期生长的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为一定浓度的细胞悬液。

细胞生长情况监测：将细胞实时监测仪放入37℃、5％co2，饱和湿度培养箱中。取8孔板，每孔加入150μlrpmi1640培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀好的a549细胞悬液345μl，至每孔细胞数约2×104个，静置30min，在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5μl稀释好的药物(实施例1得到的烟草活性组分)至终浓度为50μg/ml，含1％dmso的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，检测完毕时拍照记录。

空白对照孔：不加药物，加1％dmso；

实验孔：加药物。

实验结果如图4所示：上方线为空白对照孔、下方线为实验孔。

根据a549细胞的增殖生长曲线，说明本发明烟草活性组分对a549细胞生长抑制作用。

实施例8：抑制人肝癌hep-g2细胞生长的试验

细胞培养：在5％co2，37℃，饱和湿度下，用dmem(10％fbs、1％ps)培养基培养人肺癌hep-g2细胞，选取生长状态良好的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为一定浓度的细胞悬液。

细胞生长情况监测：将细胞实时监测仪放入5％co2，37℃饱和湿度培养箱中。取八孔板，每孔加入150μldmem培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的hep-g2细胞悬液345μl，至每孔细胞数约4×104个，静置30min，在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5μl稀释好的药物(实施例1得到的烟草活性组分)至终浓度为50μg/ml，含1％dmso的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，检测完毕时拍照记录。

空白对照孔：不加药物，加入1％dmso；

实验孔：加药物。

实验结果如图5所示：上方线为空白对照孔、下方线为实验孔。

根据hep-g2细胞的增殖生长曲线，说明本发明烟草活性组分对hep-g2细胞生长抑制作用。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书范围内。