靶向突变型p53基因的硼酸铅纳米颗粒在癌症治疗中的用途及这些纳米颗粒的制备方法

本发明涉及纳米级硼酸铅化合物由于它们对p53突变型乳腺癌细胞系t47d的选择性抗癌活性而用于治疗目的的用途。

背景技术：

硼酸铅(pbxbyozht-pbxbyoz)近年来因其优异的光学和光电性能以及用作催化剂和中子-γ射线俘获材料均可的能力而吸引了大量的研究兴趣，并且已经尝试使用各种合成方法来合成硼酸铅。然而，据观察，迄今为止还没有检验这些化合物的健康影响和生物学应用。文献中使用常规固态、溶胶-凝胶和溶剂热合成方法合成的一些硼酸铅化合物如下：pbb4o7、pb(bo2)2.h2o、pb6b10o21、pb3b10o18.2h2o、pb2[b5o9]oh.h2o、pb5b3o8(oh)3.h2o、pb6b12o24.h2o、pb2b3o5.5(oh)2、[pb3(b3o7)].no3、pb6b11o18(oh)9和pb6b6o15。

众所周知，当从微米级转变为纳米级时，材料的许多物理性质发生变化并获得更高的质量。因此，硼酸铅化合物的纳米级合成变得重要，但是在文献中对合成这些化合物的研究仍然非常有限。这些研究之一是通过中国专利申请号cn1562840中公开的微波共沉淀法获得硼酸铅。在该合成中，在磺基琥珀酸2-乙基己酯存在下，将硼酸钠和硝酸铅溶液以适当的化学计量比混合，并且使所得混合物在实验室型微波中于35-45℃的温度下以500w的功率经受微波射线1.5-2小时。将所得产物用蒸馏水和乙醇洗涤并随后在60℃的烘箱中干燥10小时以除去杂质。第二项研究是关于通过中国专利申请号cn105568378中公开的溶剂热法合成纳米级pb3b10o16(oh)4化合物。在该合成中，在吡啶存在下，将乙酸铅和硼酸溶液以适当的化学计量比混合，并使用氨溶液调节介质的ph。将所得混合物转移至高压釜中并在230度下加热12小时。将所得产物用蒸馏水和乙醇洗涤，并在60度下加热12小时。

癌症是由细胞不受控制的生长和分裂导致的疾病的总称。虽然癌细胞可以在身体的大多数组织中形成，但是形成的癌细胞可以通过血液转移到身体的不同部位。癌症具有六个基本标志。这些如下：

1.自身合成生长因子，

2.避开生长抑制信号，

3.寻找其它存活方式以抵抗程序性细胞死亡，

4.具有无限增殖的能力，

5.产生新血管(血管生成)以便维持(sustenance)的能力，和

6.通过血管侵入和转移到其它组织[1]。

在识别这六个标志十一年后，hanahan和weinberg发表了更新的文章，其中他们将癌症标志的数量增加到十个。增加的四个标志如下：

7.具有不规则的代谢途径，

8.具有对突变开放的不稳定基因组，

9.回避免疫系统，和

10.肿瘤促进炎症[2]。

这十个特征是癌症相关死亡的主要原因，并且癌症在统计学上是仅次于心血管疾病的第二大常见的死亡原因。每年花费数十亿美元来寻找癌症的治愈方法(这是引起世界范围内科学家的最大关注的问题之一)以及治疗患者。尽管nci(美国国家癌症研究所(nationalcancerinstitute))仅支持250种抗癌药物，但所有这些药物具有23种已知的副作用。

在paulagarcíacalavia等人于2018年进行的研究中，研究了乳糖-酞菁官能化的金纳米颗粒对乳腺癌的光动力作用。乳糖作为所述研究中的碳水化合物既用于稳定金纳米颗粒，又用于通过半乳凝素(galectin)-1受体靶向乳腺癌细胞。比较了mda-mb-231乳腺腺癌细胞系和健康乳腺上皮细胞mcf-10a，结果观察到金纳米颗粒以半乳凝素-1受体的过表达来选择性杀死腺癌细胞系，但对mcf-10a细胞系没有影响[3]。

在hekmata.等人于2012年发表的文章中，通过与人子宫内膜干细胞进行比较，显示了银纳米颗粒和多柔比星(doxorubicin)的组合对t47d和mcf-7乳腺癌细胞系的影响。观察到将0.3μm多柔比星和10μm银纳米颗粒的组合用于t47d细胞系上导致60%的死亡率。在mcf-7细胞系中，相同的组合导致的死亡率为49%[4]。

纳米技术产品在尺寸上是细胞的大约一倍至万分之一倍，并且以其这种特征，它们类似于生物分子，例如受体或某些酶。由于它们的小尺寸，纳米颗粒可以容易地与细胞内和/或细胞外的许多分子相互作用。小于二十纳米的纳米颗粒可以容易地从血管中出来，并且可以容易地移动到身体的任何部位(epr效应-增强的渗透性和保留力)，并且这种接近身体的任何和所有部位的容易性具有很重要的意义，因为它提供了识别癌细胞并将其治疗完全留给纳米颗粒的潜力。然而，在某些类型的癌症中，由于血管渗透性的变化，epr效应的百分比可能降低[5]。此外，由于这种接近的容易性而导致癌细胞的识别是必要的。否则，纳米颗粒还将与杀死癌细胞一起杀死健康细胞。在这方面，设计适合于患者的纳米颗粒是重要的。

纳米颗粒制剂研究吸引了研究者的关注和兴趣，因为它们使得能够改进目前治疗癌症的方法。

外科手术和/或化学疗法经常用于治疗癌症。虽然外科手术在一些情况下产生完全且有效的结果；但是通常，在手术后还会施用化学治疗药物以对抗将长期存活并引发癌症形成的癌细胞存在的可能性。通常，化学疗法通过损伤健康细胞以及癌细胞而引起许多副作用。在身体中具有高增殖率的细胞受化学疗法的影响最大，所述细胞是毛细胞、骨髓中产生的血细胞和消化系统细胞。化学疗法后经常观察到的副作用如下：

●疲劳：尽管它主要是由于血细胞受到影响的事实所导致的贫血引起的，但是其原因也可能是心理上的。

●恶心和呕吐：虽然它可能是由于对药物的敏感性导致的，但它可能具有心理原因。

●脱发：由于其快速生长的细胞而受到化学疗法不利影响的脱发是导致患者抑郁的最重要原因之一。

●血液值(bloodvalues)降低：受化学疗法影响的骨髓导致血细胞显著减少。由于这种减少而导致不能向组织提供足够量的氧，因此可能观察到许多不利影响，例如免疫系统弱化和凝血困难。

●口疮：化学疗法药物有时可能导致口腔中的炎性疮。在治疗过程中，患者应避免极热或极凉的饮品，并应尽量注意其口腔卫生。

●腹泻和便秘：由于消化系统的细胞对不同化学治疗剂的反应，可能观察到腹泻或便秘。这种情况的影响大部分可以通过饮食来降低，但在一些情况下可能导致严重的腹泻，需要静脉液体摄入。

●皮肤和指甲变化：化学治疗药物具有副作用，例如肤色变暗、皮肤脱皮、发红或皮肤干燥。还可能观察到指甲容易折断或其颜色变暗。应特别注意皮肤的剥离，因为它会在免疫系统受损的患者中造成开放性伤口。

●睡眠问题：尽管它通常是由于心理原因而发生的，但是身体无法休息，特别是在化学疗法治疗过程中，既降低了化学疗法的效果，又进一步破坏了患者的精神健康。

为了增加治疗的成功率，需要将化学疗法与手术和其它方法结合使用，并且其副作用的丰富性和不可预测性因患者而异，这使得科学家们寻求新的治疗方法。为了改善目前的治疗方法和减少副作用，纳米颗粒在开展的研究中已变得突出。

除了所有这些之外，在现有技术中，纳米颗粒或者与已知化学品组合使用(其中即使不使用纳米颗粒，所述化学品也可以选择性地杀死癌症，在此，目的是增强影响)，或者通过葡萄糖补充来进行靶向以使细胞能够识别纳米颗粒。由于所有细胞普遍需要葡萄糖，因此能够仅按比例杀死更多癌细胞将不会对健康细胞造成损害。此外，如上所述，由于许多纳米颗粒的epr效应，可能以不受控的方式进入非癌细胞的纳米颗粒可能对这些细胞的健康造成危害。

作为现有技术申请，日本专利文献号jp2005300232公开了使用气凝胶的正电子发射断层摄影术的应用以及制备所述气凝胶的方法。本发明的目的在于提供一种能够高精度地定位异常组织如癌细胞的位置的正电子发射断层摄影术。在气凝胶制备中使用的原料之一是氧化铅，并且为此目的，使用属于还包括硼酸铅的组的铅盐。

作为现有技术申请，国际专利申请号wo2011022350公开了用于治疗感染和癌症的药学上可接受的锌纳米颗粒。锌纳米颗粒具有包含元素锌而无显著量的其它金属或金属氧化物的核。本发明的锌纳米颗粒的另一个用途是诊断和成像。锌纳米颗粒具有固有的自发荧光能力，因此可用于对感染和肿瘤等部位进行成像。因为它在诸如x射线成像之类的情况下是有用的，所以可以使用选自还包括铅(ii)的组的离子。

作为现有技术申请，中国专利申请文献号cn103046113公开了化合物硼酸铅和硼酸铅的非线性光学晶体，及其制备方法。该硼酸铅化合物的化学式为pb4o(bo3)2，分子量为962.38，并且通过采用固相反应法来合成。该化合物中铅和硼的摩尔比为2:1，并且含铅化合物为碳酸铅、硝酸铅、氧化铅、乙酸铅或草酸铅；且含硼化合物为硼酸或氧化硼。

可以看出，在文献中没有关于本发明的纳米级硼酸铅化合物对癌症和相关生理病症的作用的出版物或专利。

技术实现要素：

本发明的目的是将纳米级硼酸铅化合物用于治疗过程中，这是由于其对癌细胞的选择性毒性作用。

本发明的另一个目的是首次通过采用缓冲-沉淀合成法来合成纳米级硼酸铅化合物。

本发明的另一个目的是使这些化合物具有小于100nm的尺寸，以便将它们用于体内生物学应用。

本发明的另一个目的是使用一种合成方法，与水热/溶剂热和微波沉淀合成法相比，该方法更容易、经济且适于制造，这是由于它可以在对高温、长反应时间、高压和任何种类的辐射没有任何需要的情况下进行的事实。

具体实施方式

为实现本发明的目的而开发的“靶向突变型p53基因的硼酸铅纳米颗粒在癌症治疗中的用途和这些纳米颗粒的制备方法”在附图中进行了说明，其中；

图1是不同浓度的纳米级硼酸铅对(a)hacat(健康对照角质形成细胞)、(b)t47d(乳腺癌)、(c)mcf7(乳腺癌)和(d)a549(肺癌)细胞中活力的影响的图示。

图2是在用铅纳米颗粒处理后具有p53突变的t47d细胞系和不具有p53突变的mcf7细胞系通过实时聚合酶链式反应的基因表达变化的示意图。(结果根据不涉及纳米颗粒施用的细胞对照和gapdh基因(其也可以称为护卫基因(guardiangene))的表达水平进行归一化而确定)。

本发明涉及由于它们对癌细胞的选择性毒性作用而用于治疗癌症的纳米级偏硼酸铅化合物。在本发明的范围内，由于它们对p53突变型乳腺癌细胞系t47d的选择性抗癌作用(毒性作用)，纳米级硼酸铅化合物被用于治疗这些癌细胞的目的。

在本发明范围内的经开发用于癌症治疗过程的纳米级(低于100nm)硼酸铅化合物的合成在室内条件(roomconditions)下通过缓冲沉淀法进行。该合成方法的步骤如下：

1-在蒸馏水中将氢氧化钠和硼酸以1:2的化学计量比溶解并相互混合，制备ph值为9至9.5并能够将反应介质的ph值保持在该范围内的硼酸盐缓冲液(naoh/h3bo3缓冲溶液)。

2-在不同的烧杯中，将硝酸铅(和优选peg(400至20000da))以1:1.5的化学计量比同样溶解在200ml的蒸馏水中。将硝酸铅(和优选peg)溶液和硼酸盐缓冲溶液在机械搅拌器下以2000rpm搅拌30分钟。

3-将所得产物用蒸馏水洗涤4次并随后在60℃下干燥24小时以除去杂质。

peg是生物相容性表面活性剂。在上述方法中，也可以在不使用表面活性剂如peg的情况下进行反应。在这种情况下，在烧杯中将仅10mmol的硝酸铅溶解在20ml的水中。在反应中使用peg的目的是获得具有更小粒度的硼酸铅纳米颗粒。

根据本发明合成的纳米级硼酸铅化合物的粒度低于100nm。低于100nm的粒度使得这些化合物能够用于体内生物学应用。

与水热/溶剂热和微波沉淀合成法相比，所采用的合成方法是一种更容易、经济且适于制造的方法，这是由于它可以在对高温、长反应时间、高压和任何种类的辐射没有任何需要的情况下进行的事实。

加入到介质中的peg(聚乙二醇)是生物相容性表面活性剂。它使得所获得的颗粒能够以更小的尺寸(50nm及以下)获得并且易于分散在水中。为了能够在生物学应用中使用硼酸铅化合物并且为了获得更小的纳米颗粒，可以在反应过程中或反应后使用具有不同分子量的peg和其它生物相容性表面活性剂。

根据本发明的用于形成纳米颗粒的该缓冲-沉淀法是通过改进文献中先前已知的常规沉淀法的某些部分而获得的用于仅合成金属硼酸盐的新型沉淀法。该方法最重要的特征是用作硼酸盐源的氢氧化钠/硼酸缓冲液在整个反应过程中将介质的ph值保持在9和9.5之间的能力。该合成方法不仅可用于获得硼酸铅，而且还可用于获得所有其它带(+2)和(+3)电荷金属硼酸盐。可以使用该合成方法合成的其它金属硼酸盐化合物的金属如下：ca⁺²、mn⁺²、ni⁺²、co⁺²、cu⁺²、zn⁺²、sr⁺²、ba⁺²、sc⁺³、fe⁺³、cr⁺³、al⁺³、y⁺³、la⁺³、ce⁺³、pr⁺³、nd⁺³、sm⁺³、eu⁺³、gd⁺³、tb⁺³、dy⁺³、ho⁺³、er⁺³、tm⁺³、yb⁺³、lu⁺³、bi⁺³、tl^+3'。在此给出的实例是可以通过该合成方法获得的其它金属硼酸盐实例的实例。

实验研究

细胞毒性实验

所制备的纳米颗粒对细胞活力的影响通过使用文献中给出的mts(材料测试系统)方法来确定。用于产品中的分子单独制备或在介质中组合制备，并施用于通过以每个孔4000个细胞的浓度计数接种到96-孔培养板上的t47d(乳腺癌)、mcf7(乳腺癌)、a549(肺癌)和hacat(健康对照角质形成细胞)细胞。通过测量细胞活力3天来确定细胞对分子毒性的反应。细胞活力通过使用称为mts的方法测定，该方法测量细胞的线粒体脱氢酶活性。与介质一起添加到细胞上的mts物质导致有色的甲臜晶体(formazancrystal)形成作为细胞活力的指示剂。通过使用elisa板读数器，基于吸光度测量结果评价所产生的颜色变化。分析所获得的结果。

实时聚合酶链式反应

进行实时聚合酶链式反应试验以观察用纳米颗粒处理的细胞的基因水平变化。这些变化既处于形态水平，又处于基因表达水平。所用引物是使用primerblast软件(美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnology)=ncbi)设计的。从其上施用凝胶组合的细胞中分离总rna，并合成cdna。将合成的cdna与fermentasmaximasybrgreen混合物产品中的引物混合，使得最终体积为20μl，并通过使用bio-rad装置分析基因的表达水平。

参考文献

[1].hanahan,d.andr.a.weinberg(2000)."thehallmarksofcancer."cell100(1):57-70.

[2].hanahan,d.andr.a.weinberg(2011)."hallmarksofcancer:thenextgeneration."cell144(5):646-674.

[3].garciacalavia,p.,i.chambrier,m.j.cook,a.h.haines,r.a.fieldandd.a.russell(2018)."targetedphotodynamictherapyofbreastcancercellsusinglactose-phthalocyaninefunctionalizedgoldnanoparticles."jcolloidinterfacesci512:249-259.

[4].hekmat,a.,a.a.sabouryanda.divsalar(2012)."theeffectsofsilvernanoparticlesanddoxorubicincombinationondnastructureanditsantiproliferativeeffectagainstt47dandmcf7celllines."jbiomednanotechnol8(6):968-982.

[5].fang,j.,h.nakamuraandh.maeda(2011)."theepreffect:uniquefeaturesoftumorbloodvesselsfordrugdelivery,factorsinvolved,andlimitationsandaugmentationoftheeffect."advdrugdelivrev63(3):136-151.