用于免疫疗法的基因修饰的包含归巢受体或细胞因子和嵌合抗原受体的四顺反子系统的制作方法

本申请要求2018年8月1日提交的序列号为62/713,264、2018年8月1日提交的序列号为62/713,278、2018年8月1日提交的序列号为62/713,310以及2018年8月1日提交的序列号为62/713,323的我们共同未决的美国临时申请的优先权。这些申请中的每一个申请均通过援引以其全文并入本文。

序列表

名为104077_0007pct_seq_listing_rev004_st25、大小为97kb的序列表的ascii文本文件创建于2019年8月1日，通过efs-web与本申请一起以电子方式提交，并且通过援引以其全文并入。

本发明的领域是工程化细胞，其使用细胞毒性的活化自然杀伤细胞系(nk-92)作为基础，以改善针对癌症和肿瘤的免疫疗法。

背景技术：

背景描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认具体地或隐含地引用的任何出版物是现有技术。

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基于过继转移的肿瘤特异性细胞毒性淋巴细胞的癌症免疫疗法有望用于治疗恶性肿瘤患者。尽管这在某些癌症中取得了早期成功，但是肿瘤的治疗仍然是一项挑战，这主要是由于肿瘤微环境的免疫抑制性质。参见swarts等人“tumormicroenvironmentcomplexity：emergingrolesincancertherapy[肿瘤微环境的复杂性：在癌症治疗中的新兴作用]，”cancerres[癌症研究]，第72卷，第2473-2480页，2012。除了经修饰的t细胞以外，正在探索基于nk细胞的免疫疗法。自然杀伤(nk)细胞是构成先天免疫系统的主要组成部分的细胞毒性淋巴细胞。通常占循环淋巴细胞的约10％-15％的自然杀伤(nk)细胞结合并杀伤对抗原不具有特异性并且没有既往免疫致敏的靶细胞(包括被病毒感染的细胞和许多恶性细胞)。herberman等人，science[科学]214：24(1981)。是溶细胞性癌细胞系，其发现于患有非霍奇金淋巴瘤的受试者的血液中，然后在体外永生化。细胞源自nk细胞，但缺乏由正常nk细胞展示的主要抑制性受体，同时保留了大部分活化受体。然而，细胞不会攻击正常细胞，也不会在人中引起不可接受的免疫排斥反应。

淋巴结转移的常见驱动因素是缺氧驱动的ccr7上调，ccr7是一种主要在原初t细胞和树突状细胞中发现的趋化因子受体。先前已证明血液nk细胞上ccr7受体的上调会改善nk细胞向淋巴结的归巢，使它们遵循相同路径到达淋巴结隔室，这是转移性扩散的常见途径，但尚未在临床上相关的细胞系中得到证实。

因此，仍然需要改进nk细胞和基于nk细胞的疗法，特别是在nk细胞归巢至肿瘤微环境和调节肿瘤微环境的情况下。

技术实现要素：

本文提供了经修饰的细胞，这些细胞包含编码多种功能元件的核酸。功能元件典型地是蛋白质或多肽，其提供改善细胞作为用于免疫疗法的细胞系的有效性的特定功能。一方面，细胞包含编码四个功能元件的核酸构建体。在一些实施例中，该核酸构建体包含与启动子可操作地连接的编码四个功能元件的序列(称为“四顺反子构建体”)。

在一些实施例中，由核酸构建体编码的第一元件是细胞因子，其提供对表达该细胞因子诸如il-2或il-15的细胞的选择。因此，在一些实施例中，该核酸编码细胞因子，诸如il-2或il-15。在一个实施例中，il-2在具有将il-2引导至内质网il-2(“eril-2”)的信号序列的情况下表达。在另一个实施例中，il-15在具有将il-15引导至内质网il-15(“eril-15”)的信号序列的情况下表达。

在一些实施例中，由核酸构建体编码的第二元件是fc受体。在一些实施例中，fc受体是fc-γ受体(fcγr)。在一些实施例中，fc-γ受体是fcγriii-a(也称为cd16)，其是与igg抗体结合并激活adcc的低亲和力fc受体。在一些实施例中，cd16受体在成熟形式的多肽(seqidno：12)的氨基酸位置158(f158v)(对应于包含信号序列的全长形式的多肽的位置176)处包含苯丙氨酸(f)-缬氨酸(v)取代。在一个实施例中，fc受体包含seqidno：13的核酸序列或seqidno：12的氨基酸序列。

在一些实施例中，第一元件和第二元件存在于该核酸构建体中。因此，在一些实施例中，该核酸构建体编码fc受体(诸如cd16)和eril-2。

在一些实施例中，由核酸构建体编码的第三元件是归巢受体。在一些实施例中，归巢受体是细胞因子受体、g蛋白偶联受体、趋化因子受体、细胞粘附分子、选择素或整合素。在一些实施例中，归巢受体与允许核酸转录的启动子可操作地连接。经修饰的细胞能够向趋化因子的来源迁移，趋化因子是受体的配体。与正常的血液来源的nk细胞不同，经修饰的细胞可以发育成与人类临床试验相关的细胞系，从而为免疫疗法提供明显的优势。归巢受体的实例包括g蛋白偶联受体，诸如趋化因子受体，包括但不限于ccr1、ccr2、ccr3、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、ccr9、ccr10、cxcr1、cxcr2、cxcr3、cxcr4、cxcr5、cxcr6、cxcr7、cx3cr1、xcr1、ccxckr、d6、darc或cxcl14受体；细胞因子受体；细胞粘附分子，诸如选择素，包括l-选择素(cd62l)；整合素，诸如α4β7整合素、lpam-1和lfa-1。在一些实施例中，归巢受体是细胞粘附分子，诸如lfa-1。在一些实施例中，归巢受体是选择素，诸如l-选择素(cd62l)。在一些实施例中，归巢受体是整合素，诸如α4β7整合素、lpam-1或vla-4。在一些实施例中，归巢受体是c-c或c-x-c趋化因子受体。因此，在一些实施例中，由该核酸编码的第三元件是本文所述的归巢受体。

在一些实施例中，由核酸构建体编码的第三元件是分泌型细胞因子，由此细胞因子增强或改善细胞作为免疫治疗剂的功能。该细胞因子还可以调节肿瘤微环境。在一些实施例中，调节肿瘤微环境的分泌型细胞因子是il-12或ifn-α。因此，在一些实施例中，由核酸构建体编码的第三元件是细胞因子，诸如il-12或ifn-α。

因此，在一些实施例中，由核酸构建体编码的第三元件是趋化因子，诸如xcl1、ccl5、ccl21或ccl16。在一些实施例中，由核酸构建体编码的第三元件是toll样受体(tlr)激动剂。

一方面，由核酸构建体编码的第三元件是il-12。

已知肿瘤内的tgf-β表达会抑制肿瘤微环境中白细胞的抗肿瘤活性。因此，在一些实施例中，由核酸构建体编码的第三元件是tgf-β抑制剂，例如抑制tgf-β的肽。在一些实施例中，由核酸构建体编码的第三元件是tgf-β阱。在一些实施例中，tgf-β阱包含tgfβrii分子的细胞外结构域。在一些实施例中，tgf-β阱包含tgfβrii分子的细胞外结构域的单链二聚体，并且最优选地包含tgf-β受体ii胞外域的单链二聚体。

在一些实施例中，本文所述的nk细胞与tgf-β抑制剂一起施用以阻断tgf-β并帮助去除免疫抑制。在一些实施例中，本文所述的nk细胞与其他免疫疗法一起施用以帮助减小或消除肿瘤。例如，可以通过肿瘤内注射抑制肽并结合肿瘤内注射聚(i：c)和α-cd40抗体来抑制tgf-β。在一些实施例中，将tgf-β抑制剂与il-2组合。

在一些实施例中，由核酸构建体编码的第四元件是抗原结合蛋白(“abp”)。在一些实施例中，抗原结合蛋白特异性结合肿瘤相关抗原。在一些实施例中，abp包含抗体的片段，诸如scfv。在一些实施例中，抗原结合蛋白包含嵌合抗原受体(car)或者是嵌合抗原受体(car)的一部分。在一些实施例中，核酸编码特异性结合以下物质的abp或car：cd19、cd20、nkg2d配体、cs1、gd2、cd138、epcam、her-2、ebna3c、gpa7、cd244、ca-125、muc-1、eta、mage、cea、cd52、cd30、muc5ac、c-met、egfr、fap、wt-1、psma、ny-eso1、cspg-4、igf1-r、flt-3、cd276、cd123、pd-l1、bcma、cd33、b7-h4或41bb。

在另一方面，经修饰的细胞包含编码il-12的核酸。在另一方面，经修饰的细胞包含编码tgf-β阱的核酸。在一些实施例中，tgf-β阱包含tgfβrii分子的细胞外结构域的单链二聚体。

在另一方面，经修饰的细胞包含编码细胞因子的核酸，该细胞因子提供对表达该细胞因子的细胞的选择或允许表达该细胞因子的细胞存活。在一些实施例中，该核酸编码细胞因子，诸如il-2或il-15。在一个实施例中，il-2在具有将il-2引导至内质网il-2(“eril-2”)的信号序列的情况下表达。在一个实施例中，il-15在具有将il-15引导至内质网il-2(“eril-15”)的信号序列的情况下表达。

在一些实施例中，经修饰的细胞包含编码fc受体的核酸。在一些实施例中，fc受体是fc-γ受体(fcγr)。在一些实施例中，fc-γ受体是fcγriii-a(也称为cd16)，其是与igg抗体结合并激活adcc的低亲和力fc受体。在一些实施例中，cd16受体在成熟形式的多肽(seqidno：12)的氨基酸位置158(f158v)(对应于包含信号序列的全长形式的多肽的位置176)处包含苯丙氨酸(f)-缬氨酸(v)取代。在一个实施例中，fc受体包含seqidno：13的核酸序列或seqiidno：12的氨基酸序列。

在一些实施例中，经修饰的细胞包含编码抗原结合蛋白(“abp”)的核酸。在一些实施例中，抗原结合蛋白特异性结合肿瘤相关抗原。在一些实施例中，abp包含抗体的片段，诸如scfv。在一些实施例中，抗原结合蛋白包含嵌合抗原受体(car)或者是嵌合抗原受体(car)的一部分。在一些实施例中，核酸编码特异性结合以下物质的abp或car：cd19、cd20、nkg2d配体、cs1、gd2、cd138、epcam、her-2、ebna3c、gpa7、cd244、ca-125、muc-1、eta、mage、cea、cd52、cd30、muc5ac、c-met、egfr、fap、wt-1、psma、ny-eso1、cspg-4、igf1-r、flt-3、cd276、cd123、pd-l1、bcma、cd33、b7-h4或41bb。

在另一方面，经修饰的细胞包含编码调节肿瘤微环境的分泌型细胞因子的核酸。在一些实施例中，调节肿瘤微环境的细胞因子是趋化因子，诸如xcl1、ccl5、ccl21或ccl16。在一些实施例中，经修饰的细胞包含编码toll样受体(tlr)激动剂的核酸。在一些实施例中，经修饰的细胞包含编码il-12或ifn-α的核酸。在一些实施例中，经修饰的细胞包含编码tgf-β抑制剂(例如抑制tgf-β的肽)的核酸。在一些实施例中，经修饰的细胞包含编码tgf-β阱的核酸。在一些实施例中，tgf-β阱包含tgfβrii分子的细胞外结构域，或tgfβrii分子的细胞外结构域的单链二聚体。

一方面，经修饰的细胞包含一种或多种、或多个编码归巢受体、abp或car、fc受体和/或细胞因子的核酸分子，该细胞因子提供对表达该细胞因子的细胞的选择或允许表达该细胞因子的细胞存活。因此，在一些实施例中，经修饰的细胞包含编码趋化因子受体、car、cd16和eril-2的核酸分子。在一些实施例中，经修饰的细胞包含编码ccr7或cxcr2、car、cd16和eril-2的核酸分子。在一些实施例中，经修饰的细胞包含编码il-12或tgf-β阱、car、cd16和eril-2的核酸分子。

在一些实施例中，car包含来自fcε受体γ(fcεriγ)的细胞内信号传导结构域。在一个实施例中，car由细胞瞬时表达。在一个实施例中，car由细胞稳定表达。

迄今为止，含fcεriγ的car尚未在细胞、其他nk细胞系或内源性nk细胞中使用，因为确定了其他信号传导结构域(例如，cd3ζ)更有效，尤其是当与另外的信号传导结构域(第二代car和第三代car)组合时。本文描述了出人意料的惊人发现，即表达包含来自fcεriγ的细胞内结构域的“第一代”car的细胞与表达具有单独的或与其他信号传导结构域组合的cd3ζ信号传导结构域的car(即第二代或第三代car)的细胞相比具有针对表达被car识别的抗原的癌细胞的相同或更高的细胞毒活性。在一个实施例中，本文考虑的cd3ζ信号传导结构域可以包含与seqidno：40具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的多肽序列。

一方面，描述了一种细胞或细胞系，其在细胞的表面上表达嵌合抗原受体(car)，其中所述car包含fcεriγ的胞质结构域。在一个实施例中，fcεriγ的胞质结构域包含与seqidno：31具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，fcεriγ的胞质结构域由与seqidno：32具有至少95％序列同一性的核酸编码。

在一些实施例中，car包含来自cd8的铰链区。在一些实施例中，car包含来自cd28的跨膜结构域。

在一些实施例中，用包含seqidno：31(fcεriγ细胞内胞质结构域)、seqidno：32(fcεriγ细胞内信号传导域减去跨膜结构域)、seqidno：33(cd8铰链区)、seqidno：34(cd8铰链区dna)、seqidno：35(cd28跨膜结构域)和/或seqidno：36(cd28跨膜结构域，减去itam或细胞内序列)的核酸构建体对细胞或细胞系进行基因修饰。在一个实施例中，cd8铰链区、cd28跨膜和fceriγ信号传导结构域的氨基酸序列包含与seqidno：37或seqidno：38具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽或多核苷酸序列。在一些实施例中，核酸构建体进一步包含促进核酸序列转录的启动子。在一些实施例中，启动子是诱导型启动子。在一些实施例中，核酸构建体是包含一个或多个内部核糖体进入位点(ires)的多顺反子载体，以实现从核酸序列转录的mrna内部区域起始翻译。在一些实施例中，核酸构建体包含编码2a肽，诸如t2a、p2a、e2a或f2a肽的序列，以产生由相同mrna编码的等摩尔水平的多肽。在一些实施例中，核酸构建体进一步包含编码抗原结合蛋白(abp)的核酸序列。在一些实施例中，abp是scfv或密码子优化的scfv。在一些实施例中，abp特异性结合肿瘤细胞表达的抗原。在一些实施例中，abp是嵌合抗原受体(car)的一部分。在一些实施例中，构建体包含编码细胞因子的核酸，细胞因子提供对表达该细胞因子(诸如il-2)的细胞的选择或允许该细胞存活。在一个实施例中，细胞因子靶向内质网。在一个实施例中，carscfv可以包含与seqidno：39具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的多肽序列。

在一些实施例中，构建体包含图10所示的载体。在一些实施例中，对细胞或细胞系进行基因修饰以在细胞表面上表达cd16。在一个实施例中，对细胞或细胞系进行基因修饰以在细胞表面上表达高亲和力cd16(f158v)。

在一个实施例中，abp或car靶向或特异性结合肿瘤相关抗原。在一个实施例中，肿瘤相关抗原选自由以下组成的组：cd19、cd20、nkg2d配体、cs1、gd2、cd138、epcam、her-2、ebna3c、gpa7、cd244、ca-125、muc-1、eta、mage、cea、cd52、cd30、muc5ac、c-met、egfr、fap、wt-1、psma、ny-eso1、cspg-4、igf1-r、flt-3、cd276、cd123、pd-l1、bcma、cd33b7-h4和41bb。在一个实施例中，该肿瘤相关抗原是cd19。在另一个实施例中，该肿瘤相关抗原是cd33。

在一个方面，本披露涉及一种细胞系，该细胞系被编码具有fcεriγ的胞质结构域的嵌合抗原受体(car)的核酸转化，其中car在细胞的表面上表达。在一个实施例中，该核酸是rna。在一个实施例中，该核酸是dna。

在一些实施例中，细胞经进一步修饰以表达至少一种细胞因子或其变体，该细胞因子或其变体提供对表达该细胞因子的细胞的选择或允许表达该细胞因子的细胞存活。在一个实施例中，该至少一种细胞因子由细胞瞬时表达。在一个实施例中，该至少一种细胞因子由细胞稳定表达。

在一些实施例中，经修饰的细胞包含表达载体，该表达载体包含一种或多种或多个本文所述的核酸分子。在一些实施例中，核酸分子与能够起始核酸分子转录的启动子可操作地连接。在一些实施例中，该多个核酸分子中的每个核酸分子与单独的、有差别的和/或不同的启动子可操作地连接。在一些实施例中，这些核酸分子中的一个或多个核酸分子与同一启动子可操作地连接。在一个实施例中，编码归巢受体、car、fc受体和细胞因子的核酸分子与同一启动子或单个启动子可操作地连接。在一些实施例中，启动子是诱导型启动子。在一实施例中，编码细胞因子的核酸分子位于编码归巢受体、car和fc受体(例如，cd16或高亲和力cd16)的核酸分子的下游或3’。

在一些实施例中，细胞在细胞表面上表达由本文所述的核酸分子编码的蛋白质。例如，在一些实施例中，经修饰的细胞在细胞表面上表达归巢受体、abp或car和fc受体(例如，cd16或高亲和力cd16)。

还提供了包含经修饰的细胞的组合物和试剂盒。提供了制备经修饰的细胞的方法和使用这些细胞治疗癌症的方法。

在另一方面，描述了用于治疗癌症或减小肿瘤大小的方法。在一些实施例中，治疗癌症或减小肿瘤大小的方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的经修饰的细胞，其中施用治疗受试者中的癌症或减小受试者中的肿瘤大小。在一些实施例中，这些方法包括向受试者施用治疗有效量的经修饰的细胞，经修饰的细胞包含编码归巢受体，与靶抗原特异性结合的abp或car，fc受体(诸如cd16或cd16-158v)和/或细胞因子(诸如eril-2或eril-15)的核酸。在一些实施例中，这些方法包括向受试者施用治疗有效量的经修饰的细胞，经修饰的细胞包含编码分泌型细胞因子，与靶抗原特异性结合的abp或car，fc受体(诸如cd16或cd16-158v)和/或细胞因子(诸如eril-2或eril-15)的核酸。

在一些实施例中，本文所述的nk细胞与tgf-β抑制剂一起施用以阻断tgf-β并帮助去除免疫抑制。在一些实施例中，本文所述的nk细胞与其他免疫疗法一起施用以帮助减小或消除肿瘤。例如，可以通过肿瘤内注射抑制肽并结合肿瘤内注射聚(i：c)和α-cd40抗体来抑制tgf-β。在一些实施例中，将tgf-β抑制剂与il-2组合。

在另一方面，提供了本文所述的组合物用于治疗疾病的用途。在一些实施例中，提供本文所述的经修饰的细胞用作治疗疾病的药物。在一些实施例中，提供本文所述的经修饰的细胞用于治疗疾病。在一些实施例中，经修饰的细胞包含编码归巢受体，与靶抗原特异性结合的abp或car，fc受体(诸如cd16或cd16-158v)和/或细胞因子(诸如eril-2或eril-15)的核酸。在一些实施例中，经修饰的细胞包含编码分泌型细胞因子，与靶抗原特异性结合的abp或car，fc受体(诸如cd16或cd16-158v)和/或细胞因子(诸如eril-2或eril-15)的核酸。在一些实施例中，该疾病是癌症。

在下面的附图和描述中阐述了一个或多个实施例的详情。根据说明书和附图以及根据权利要求书，其他特征、目的和优点将显而易见。

附图说明

图1是显示用于插入细胞中的aavs1基因座处的含有ccr7受体的质粒pnkat-ccr7-lp3的示意图。

图2是显示含有nfat应答性ccl21基因的质粒pcrenfat-ccl21的示意图。

图3是显示与细胞相关的表型标志物在野生型细胞和表达ccr7的经修饰的细胞中的表达的图表。(泳道1：ank(野生型)；泳道2：经修饰的细胞(ma3)；泳道3：经修饰的细胞(mb4)；泳道4：经修饰的细胞(mb6)；泳道5：经修饰的细胞(me6)；泳道6：经修饰的细胞(mh3)；a：同种型(apc)；b：cd54(icam-1)；c：nkp30；d：nkg2d

图4是显示表达ccr7的经修饰的细胞针对k562细胞的细胞毒活性的图表。

图5是显示表达ccr7的经修饰的细胞针对hl-60细胞的细胞毒活性的图表。

图6a和图6b是显示在与k562和sup-b15细胞结合的情况下(当nk-92细胞被cd19-car的mrna电穿孔时)证实的nk-92细胞中nfat-荧光素酶报告基因激活的图表。

图7是显示表达ccr7的经修饰的细胞(mi-ank)向趋化因子ccl19和ccl21迁移的图表。

图8示出了表示用于体外测试本文所述的经修饰的细胞的示例性方法的图解。活化的细胞(ank)经修饰以表达趋化因子受体(例如，ccr7)，并且靶细胞经修饰以表达与受体结合的趋化因子(例如，ccl19或ccl21)。如图所示，在改良的boyden腔室transwell测定中对经修饰的细胞进行测试。

图9示出了使用本文所述的经修饰的细胞的代表性细胞毒性测定。测试了来自图8的经修饰的细胞对表达和分泌一种或两种趋化因子配体的k562靶细胞的细胞毒性。ml4克隆物显示出最高的靶细胞裂解百分比，并且当k562靶细胞同时表达ccl19和ccl21时，该百分比增加。

图10是显示质粒pnkat-ccr7-cd19car-cd16-eril2(称为“四顺反子载体”)的示意图，该质粒可用于在单个插入位置稳定地转染细胞。

图11是显示来自图10的线性化质粒的示意图。

图12示出了细胞对ccr7、cd16和cd19car的细胞表面表达。“ank”是野生型细胞系。“ml4”是用与启动子可操作连接的编码ccr7的核酸构建体转染的ank细胞系(即mi-ank)。“p2”是用编码ccr7、cd16、er-il2和cd19car(即mi-t-hank)的核酸构建体转染的ank细胞系。

图13.在nk细胞施用后的指定小时，非cr与mi-t-hank细胞向亲本或表达ccl19的肿瘤的归巢。数据是平均值±sem。-号和+号表示ccr7受体(第一个符号)和ccl19配体(第二个符号)的表达状态。*，通过单因素方差分析(one-wayanova)，随后通过tukey检验进行多重比较测定p＜0.05。最后一个图呈现了时间进程曲线。

图14.给药后24小时，单只动物的非cr和mi-t-hank细胞向亲本或表达ccl19的肿瘤的浸润的头对头比较。接受mi-t-hank细胞的4只动物中有3只显示出向ccl19+肿瘤的较高浸润，而接受非crcd19t-hank细胞的4只动物中有3只显示出与k562和k-19肿瘤相似的浸润水平。每组中的一只“离群”动物用虚线表示。

图15说明了ivraji-19.5荷瘤动物的存活曲线。经媒介物、cd19t-hank细胞或r7-19.1细胞处理的raji-19.5iv荷瘤nsg小鼠的存活曲线。通过对数秩(mantel-cox)检验进行统计分析。***，p＝0.0002；****，p＜0.0001。

图16说明了ivraji-19.5肿瘤模型中的体重变化。经媒介物、cd19t-hank细胞或r7-19.1细胞处理的ivraji-19.5荷瘤动物的体重变化曲线(相比于第0天体重的变化％)。数据是平均值±sem。红色箭头表示给药天数。在给药当天所做的重量测量是在剂量施用之前进行的。对于第20天之前的所有时间点，通过双因素方差分析(2-wayanova)，随后通过tukey检验进行多重比较，nk细胞处理组的曲线与媒介物对照组相比，达到统计学上显著的差异(p＜0.05)。

图17说明了随机分组时scraji-19.5肿瘤的大小。示出了随机分组时的个体肿瘤大小。黑色方框包围大小＞200mm³的大肿瘤，而蓝色方框包围＜200mm³的小肿瘤。还表示了组平均值±sem。

图18说明了scraji-19.5荷瘤小鼠的大肿瘤亚群的肿瘤生长。(a)组分析。数据是平均值±sem。使用双因素混合效应分析(2-waymixed-effectsanalysis)，随后通过tukey检验进行的多重比较来进行统计分析。未达到统计显著性。(b)个体曲线。红色箭头表示给药天数。tx：处理。

图19说明了scraji-19.5荷瘤小鼠的小肿瘤亚群的肿瘤生长。(a)组分析。数据是平均值±sem。使用双因素混合效应分析，随后通过tukey检验进行的多重比较来进行统计分析。任何时间点在任2个组之间均未检测到统计显著性。(b)个体曲线。红色箭头表示给药天数。tx：处理。

图20说明了scraji-19.5肿瘤模型中的体重变化。经媒介物、cd19t-hank细胞或r7-19.1细胞处理的scraji-19.5荷瘤动物的体重变化曲线(相比于第1天体重的变化％)。数据是平均值±sem。红色箭头表示给药天数。在给药当天所做的体重测量是在剂量施用之前进行的。对于第16天之前的所有时间点，通过双因素混合效应分析，随后通过tukey检验进行多重比较，nk细胞处理组的曲线与媒介物对照组相比，达到统计学上显著的差异。

图21说明了装有四顺反子tgfβ-阱的pd-l1car构建体的一个实施例。

图22说明了pd-l1(tgfβ-阱)t-hank克隆物中pd-l1car和cd16的表达分析。

图23说明了tgfb阱分泌到tgfβ阱/pd-l1t-hank克隆物的培养上清液中。

图24说明了四顺反子tgfβ-阱构建体对k562靶细胞的细胞毒性。

图25说明了四顺反子tgfβ-阱构建体对表达pd-l1的sup-b15靶细胞的car杀伤。

图26说明了四顺反子tgfβ-阱构建体对mda-mb231靶细胞的car杀伤。

图27说明了四顺反子tgfβ-阱构建体对sup-b15^cd19-cd20+的adcc。

图28说明了受tgfβ诱导的tgfβ/smad荧光素酶报告hek293细胞。

图29说明了在hek293t报告测定中分泌的tgfβ-阱螯合的tgfβ和受抑制的荧光素酶表达。

图30说明了il-12病毒转导的细胞系的il-12分泌。

图31说明了四顺反子il-12/pd-l1t-hank构建体的一个实施例。

图32说明了ccr7cd19t-hank细胞的细胞毒性数据。

图33说明了il-12/pd-l1t-hank^tm细胞系的il-12分泌。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与免疫学和免疫疗法领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。

在本说明书和随后的权利要求书中，将参考许多术语，这些术语应被定义为具有以下含义：

本文所用的术语仅出于描述具体实施例的目的，而无意限制本发明。除非上下文另外明确指出，否则如本文所用，单数形式“一”、“一种(个)”和“该”也旨在包括复数形式。

所有数字名称(例如ph、温度、时间、浓度、量和分子量，包括范围)都包括本领域普通技术人员通常所遇到的变化。因此，视情况而定，根据相关的有效数位，数值可以包括(+)或(-)增量为0.1或1.0的变化。应当理解，尽管并非总是明确地陈述，但是所有数字名称前均可以有术语“约”。如本文所用，术语“约”也可以意指该值可以变化±1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。

还应理解，尽管并非总是明确地陈述，但本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等同物是本领域已知的。

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或不发生，并且所述描述包括其中事件或情况发生的例子以及其中事件或情况不发生的例子。

术语“包含”旨在意指组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由......组成”应意指排除对组合具有任何重要意义的其他要素。例如，基本上由本文定义的要素组成的组合物将不排除未实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖性特征的其他要素。“由......组成”应意指排除多于痕量的其他成分和所列举的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施例在本披露内容的范围内。

术语“归巢受体”是指激活细胞途径的受体，该细胞途径直接或间接导致细胞向靶细胞或靶组织迁移。例如，由白细胞表达的归巢受体被白细胞和淋巴细胞用于经由高内皮小静脉进入次级淋巴组织。归巢受体也可以被细胞用于向化学梯度源诸如趋化因子梯度源迁移。归巢受体的实例包括g蛋白偶联受体，诸如趋化因子受体，包括但不限于ccr1、ccr2、ccr3、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、ccr9、ccr10、cxcr1、cxcr2、cxcr3、cxcr4、cxcr5、cxcr6、cxcr7、cx3cr1、xcr1、ccxckr、d6和darc；细胞因子受体；细胞粘附分子，诸如选择素，包括l-选择素(cd62l)；整合素，诸如α4β7整合素、lpam-1和lfa-1。归巢受体通常与靶组织或靶细胞上的同源配体结合。在一些实施例中，归巢受体与小静脉内皮上的地址素(addressin)，诸如粘膜血管地址素蛋白细胞粘附分子1(madcam-1)结合。

如本文所用，“免疫疗法”是指单独或组合的并且能够在与靶细胞接触时诱导细胞毒性的经修饰或未修饰的细胞、自然存在的或经修饰的nk细胞或t细胞的使用。

如本文所用，“自然杀伤(nk)细胞”是免疫系统的细胞，其在不存在特定抗原刺激的情况下杀伤靶细胞，并且没有根据主要组织相容性复合物(mhc)类别的限制。nk细胞的特征在于存在cd56和不存在cd3表面标志物。

术语“内源性nk细胞”用于指源自供体(或患者)的nk细胞，与细胞系不同。内源性nk细胞通常是其中nk细胞已被富集的异种细胞群。内源性nk细胞可用于患者的自体或异体治疗。

术语“nk-92”是指源自gong等人(1994)描述的高效独特细胞系(其权利归所有)的自然杀伤细胞(以下简称“细胞”)。永生化的nk细胞系最初获自患有非霍奇金淋巴瘤的患者。除非另有说明，否则术语是指原始的细胞系以及已被修饰(例如，通过引入外源基因)的细胞系。细胞及其示例性和非限制性的修饰描述于美国专利号7,618,817、8,034,332、8,313,943、9,181,322、9,150,636和公开的美国申请号10/008,955中，这些专利全部通过援引以其全文并入本文，并且包括野生型(f176v)、和细胞是本领域普通技术人员已知的，对于本领域普通技术人员，此类细胞可从南特西部公司(nantkwest，inc)获得。

术语“ank”是指源自gong等人(1994)描述的高效独特细胞系(其权利归南特西部公司所有)的未修饰的自然杀伤细胞(以下简称“细胞”)。术语“hank”是指源自gong等人(1994)所述的高效独特细胞系(其权利归南特西部公司所有)，经修饰以在细胞表面上表达cd16的自然杀伤细胞(以下简称“细胞”或“细胞”)。在一些实施例中，cd16+细胞在细胞表面上包含高亲和力cd16受体。术语“tank”是指源自gong等人(1994)所述的高效独特细胞系(其权利归南特西部公司所有)，经修饰以表达嵌合抗原受体的自然杀伤细胞(以下简称“car修饰的细胞”或“细胞”)。术语“t-hank”是指源自gong等人(1994)所述的高效独特细胞系(其权利归南特西部公司所有)，经修饰以在细胞表面上表达cd16并表达嵌合抗原受体的自然杀伤细胞(以下简称“car修饰的cd16+细胞”或“t-hank细胞”)。在一些实施例中，t-hank细胞在细胞表面上表达高亲和力cd16受体。

术语“靶向趋化因子的t-hank”和“mi-t-hank”是指经修饰以在细胞表面上表达趋化因子受体的t-hank细胞。

如本文所用，术语“细胞毒性的”和“溶细胞性的”当用于描述效应细胞(诸如细胞)的活性时，旨在同义。通常，细胞毒活性涉及通过多种生物学、生物化学或生物物理机制中的任一种杀伤靶细胞。细胞溶解更具体地是指效应子裂解靶细胞的质膜从而破坏其物理完整性的活性。这导致靶细胞的杀伤。不希望受理论的约束，认为细胞的细胞毒性作用是由于细胞溶解。

针对细胞/细胞群体的术语“杀伤”旨在包括将导致该细胞/细胞群体死亡的任何类型的操纵。

术语“fc受体”是指在某些细胞(例如，自然杀伤细胞)的表面发现的蛋白，其通过与抗体的称为fc区的部分结合而有助于免疫细胞的保护功能。抗体的fc区与细胞的fc受体(fcr)的结合通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)来刺激细胞的吞噬或细胞毒活性。fcr根据其识别的抗体类型进行分类。例如，fc-γ受体(fcγr)与igg类抗体结合。fcγriii-a(也称为cd16)是与igg抗体结合并激活adcc的低亲和力fc受体。fcγriii-a通常在nk细胞上发现。细胞不表达fcγriii-a。fc-ε受体(fcεr)与ige抗体的fc区结合。

如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(car)是指与细胞内信号传导结构域融合的细胞外抗原结合结构域。car可以在t细胞或nk细胞中表达以增加细胞毒性。通常，细胞外抗原结合结构域是对目标细胞上发现的抗原具有特异性的scfv。基于scfv结构域的特异性，表达car的细胞靶向在细胞表面上表达某些抗原的细胞。可以对scfv结构域进行工程改造以识别任何抗原，包括肿瘤特异性抗原。例如，cd19car识别cd19，cd19是某些癌症表达的细胞表面标志物。

如本文所用的术语“肿瘤特异性抗原”是指存在于癌细胞或赘生性细胞上但不能在源自与癌细胞相同的组织或谱系的正常细胞上检测到的抗原。如本文所用，肿瘤特异性抗原还指肿瘤相关抗原，即与源自与癌细胞相同的组织或谱系的正常细胞相比，在癌细胞上以更高水平表达的抗原。

术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、est或sage标签)、外显子、内含子、信使rna(mrna)、转运rna、核糖体rna、核酶、cdna、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的dna、任何序列的分离的rna、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在多核苷酸组装之前或之后进行核苷酸结构修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后进一步修饰，诸如通过与标记组分缀合。该术语还指双链和单链分子。除非另有说明或要求，否则本发明的多核苷酸的任何实施例既包括双链形式，也包括已知或预测组成双链形式的两个互补单链形式的每一个。

多核苷酸由四种核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(a)；胞嘧啶(c)；鸟嘌呤(g)；胸腺嘧啶(t)；当多核苷酸为rna时，尿嘧啶(u)取代胸腺嘧啶。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中的位置来确定序列相似性，该位置可以出于比较的目的进行比对。当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列之间的序列相似性百分比是序列在给定比较窗口内共有的匹配位置或同源位置的数量的函数。序列可与本文所述的序列至少60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

在两个或更多个核酸序列或多肽序列的情况下，术语相同或百分比同一性是指正如使用blast或blast2.0序列比较算法用下述默认参数所测量的，或通过人工比对和目视检查所测量法(参见例如，ncbi网站等)，两个或更多个序列或子序列相同，或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，在比较窗口或指定区域上比较和比对最大对应性时，在指定区域上具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)。于是称此类序列是基本上相同的。这个定义还指或可以应用于测试序列的互补序列。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的那些序列。如下所述，优选的算法可以考虑空位等。在一些实施例中，同一性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上，或存在于长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上。

对于序列比较，典型地，一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机；必要时，指定子序列坐标；并指定序列算法程序参数。优选地，可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后该序列比较算法基于程序参数，计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。

如本文所用，比较窗口包括对具有选自由20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150组成的组的任一个连续位置数目的区段的提及，在两个序列最佳比对之后，可以将一个序列与具有相同数目的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。用于比较的序列最佳比对可以例如通过以下方法进行：通过smith和waterman的局部同源性算法，adv.appl.math.[应用数学进展]2：482(1981)；通过needleman和wunsch的同源性比对算法，j.mol.biol.[分子生物学杂志]48：443(1970)；通过pearson和lipman的相似性搜索方法，proc.nat’l.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]85：2444(1988)；通过计算机化执行这些算法(威斯康星州遗传学软件包中的gap、bestfit、fasta和tfasta，遗传学电脑集团(geneticscomputergroup)，575科学博士，威斯康辛麦迪逊(madison，wi))；或通过手动比对和目视检查(例如参见currentprotocolsinmolecularbiology[分子生物学最新操作规程](ausubel等编辑，1995年增刊))。

适于测定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的优选实例是blast和blast2.0算法，其分别在altschul等人，nuc.acidsres.[核酸研究]25：3389-3402(1977)和altschul等人，j.mol.biol.[分子生物学杂志]215：403-410(1990)中有描述。使用blast和blast2.0，用本文描述的参数，测定核酸或蛋白质的序列同一性百分比。用于进行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)公开获得，如本领域已知。该算法涉及首先通过识别查询序列中选定长度(w)的短字来识别高评分序列对(hsp)，这些短字在与数据库序列中相同长度的字比对时，匹配或满足一些正值阈值得分t。t称为邻域字得分阈值(altschul等人，同上)。这些最初的邻域字命中点充当起始搜索以查找包含它们的较长hsp的种子。字命中点沿着每个序列在两个方向上延伸，直到可以增加累积比对得分为止。对于核苷酸序列，可以使用参数m(一对匹配残基的奖励得分；总是＞0)和n(错配残基的罚分；总是＜0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当出现以下情形时，字命中点向各方向的延伸终止：累积比对得分从其最大实现值下降了数量x；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或到达任一序列的末端。blast算法参数w、t和x确定比对的灵敏度和速度。期望值(e)表示不同比对的数目，其得分等于或高于偶然出现在数据库搜索中的期望得分。blastn程序(对于核苷酸序列)默认使用字长(w)为11，期望值(e)为10，m＝5，n＝-4，以及两条链的比较。对于氨基酸序列，blastp程序默认使用字长为3，期望值(e)为10，以及blosum62评分矩阵(参见henikoff和henikoff，proc.natl.acad.sci.usa[美国科学学院学报]89：10915，1989)比对(b)为50，期望值(e)为10，m＝5，n＝-4。

如本文所用的术语转化是指将外源或异源核酸分子(例如，载体或重组核酸分子)引入受者细胞的过程。外源或异源核酸分子可以整合或可以不整合到(即，共价连接至)构成宿主细胞基因组的染色体dna中。例如，外源或异源多核苷酸可以维持在附加元件诸如质粒上。替代性地或另外地，外源或异源多核苷酸可以整合到染色体中，使其通过染色体复制而被子细胞遗传。转化的方法包括但不限于磷酸钙沉淀；受者细胞与含有重组核酸的细菌原生质体融合；用含有重组核酸的脂质体处理受者细胞；deae葡聚糖；使用聚乙二醇(peg)进行融合；电穿孔；磁穿孔(magnetoporation)；生物射弹递送；逆转录病毒感染；脂质转染；以及将dna直接显微注射到细胞中。

如关于细胞所用，术语“转化的”是指已经如本文所述经历转化的细胞，使得细胞携带外源或异源遗传物质(例如，重组核酸)。术语“转化的”也可以或替代性地用于指含有外源或异源遗传物质的细胞、细胞类型、组织、生物等。

如本文关于将核酸引入细胞或生物中所用，术语“引入”旨在具有最广泛的含义，并且旨在涵盖例如通过转化方法(例如，氯化钙介导的转化、电穿孔、粒子轰击)引入，并且还涵盖通过其他方法(包括转导、缀合和交配)引入。任选地，利用构建体将核酸引入细胞或生物中。

当关于细胞、核酸、多肽、载体等使用时，术语“经修饰的”和“重组”表示该细胞、核酸、多肽、载体等已通过实验室方法修饰或是实验室方法的结果，并且是非自然发生的。因此，例如，经修饰的细胞包括通过实验室方法，例如通过用于将核酸引入细胞的转化方法产生或修饰的细胞。经修饰的细胞可以包括在细胞的天然(非重组)形式中未发现的核酸序列，或者可以包括已经改变的核酸序列，例如与非天然启动子连接的核酸序列。

如本文所用，术语“外源”是指被人工引入细胞或生物中和/或并非自然存在于它所在的细胞中的物质，诸如核酸(例如，包括调控序列和/或基因的核酸)或多肽。换句话说，诸如核酸或多肽之类的物质起源于将其引入其中的细胞或生物外部。外源核酸可具有与细胞中自然存在的核酸相同的核苷酸序列。例如，可以将细胞工程改造为包括具有序列的核酸，例如乙酰肝素酶。任选地，内源乙酰肝素酶序列与具有在自然条件下不涉及的调控序列的基因可操作地连接。尽管乙酰肝素酶序列可以自然存在于宿主细胞中，但是根据本披露，引入的核酸是外源的。外源核酸可以具有与自然存在于细胞中的任何核酸不同的核苷酸序列。例如，外源核酸可以是异源核酸，即来自不同物种或生物的核酸。因此，外源核酸可以具有与在源生物中自然发现的核酸相同，但是与向其中引入该外源核酸的细胞不同的核酸序列。如本文所用，术语“内源”是指细胞天然的核酸序列。如本文所用，术语“异源”是指不是细胞天然的，即来自与细胞不同的生物的核酸序列。术语“外源”和“内源”或“异源”不互相排斥。因此，核酸序列可以是外源的和内源的，意味着该核酸序列可以引入细胞中，但是具有与细胞中自然存在的核酸序列相同或相似的序列。类似地，核酸序列可以是外源的和异源的，意味着该核酸序列可以引入细胞中，但是具有该细胞非天然的序列，例如来自不同生物的序列。

如本文所述，对照或标准对照是指用作参考(通常是已知参考)，用于与测试样品、测量值或值进行比较的样品、测量值或值。例如，可以将测试细胞，例如用编码fc受体基因的核酸序列转化的细胞，与已知的正常(野生型)细胞(例如，标准对照细胞)进行比较。标准对照也可以表示从不表达fc受体或不具有fc受体活性或具有最低水平的fc受体活性的细胞(例如标准对照细胞)群体中收集的平均测量值或平均值。技术人员将认识到，可以设计标准对照用于评估许多参数(例如，rna水平、多肽水平、特定细胞类型等)。

术语“表达”是指基因产物(例如，蛋白质)的产生。当涉及表达时，术语“瞬时”意指多核苷酸未并入细胞的基因组中。术语“稳定”在涉及表达时意指将多核苷酸并入细胞的基因组中，或利用阳性选择标志物(即由细胞表达的在某些生长条件下具有益处的外源基因)来维持转基因的表达。

术语“细胞因子”是指影响免疫系统细胞的生物分子的一般类别。示例性细胞因子包括但不限于干扰素和白介素(il)，尤其是il-2、il-12、il-15、il-18和il-21。在优选的实施例中，细胞因子是il-2。

术语“调节肿瘤微环境的细胞因子”是指由细胞表达并起到增加抗肿瘤应答作用的分子。某些细胞因子可以抑制内源免疫系统对肿瘤的应答，并因此降低免疫疗法在治疗癌症中的有效性。因此，该术语还包括促进肿瘤生长的细胞因子抑制剂，诸如与促进肿瘤生长的细胞因子(例如配体阱)结合的肽抑制剂和/或配体或受体。

如本文所用，术语“载体”是指包含完整复制子的非染色体核酸，使得当置于允许的细胞内时，例如通过转化过程，可以复制载体。载体可以在一种细胞类型(诸如细菌)中复制，但是在另一种细胞(诸如哺乳动物细胞)中复制的能力有限或没有。载体可以是病毒的或非病毒的。用于递送核酸的示例性非病毒载体包括裸dna；与阳离子脂质复合的dna，单独或与阳离子聚合物组合；阴离子和阳离子脂质体；dna-蛋白质复合物和颗粒，包含与阳离子聚合物缩合的dna，诸如异质聚赖氨酸、定义长度的寡肽和聚乙烯亚胺，在某些情况下包含在脂质体中；以及使用包含病毒和聚赖氨酸-dna的三元复合物。在一个实施例中，该载体是病毒载体，例如，腺病毒。病毒载体是本领域熟知的。

如本文所用，术语“靶向的”在涉及蛋白表达时旨在包括但不限于将蛋白质或多肽引导至细胞内或其外部的适当目的地。典型地通过信号肽或靶向肽来实现靶向，该信号肽或靶向肽是多肽链中的氨基酸残基的一段。这些信号肽可以位于多肽序列内的任何位置，但通常位于n端。多肽也可以经工程改造为在c端具有信号肽。信号肽可以指导多肽进行细胞外切割，定位到质膜、高尔基体、内体、内质网和其他细胞区室。例如，在其c端具有特定氨基酸序列的多肽(例如，kdel)被滞留在er管腔中或转运回er管腔。

如本文所用，术语“靶向”在提及肿瘤的靶向时是指细胞识别和杀伤肿瘤细胞(即靶细胞)的能力。在这个背景下的术语“靶向的”是指例如由细胞表达的car识别并结合由肿瘤表达的细胞表面抗原的能力。

如本文所用，术语“转染”是指核酸插入细胞中。可以使用允许核酸进入细胞的任何方式进行转染。dna和/或mrna可以被转染进入细胞中。优选地，转染的细胞表达由核酸编码的基因产物(即蛋白质)。

为了方便读者，可以在说明书中使用标题或副标题，但这并不旨在影响本发明的范围。另外，本说明书中使用的一些术语在下面更具体地定义。

具体实施方式

本文提供了工程化细胞，其使用细胞毒性的活化自然杀伤细胞系(nk-92)作为基础，以改善针对癌症和肿瘤的免疫疗法和/或增加向目标靶标的归巢(迁移)。在一些实施例中，细胞经工程改造以表达已知会在表达时将淋巴细胞引导至淋巴结的归巢受体。在一些实施例中，细胞经工程改造以表达调节肿瘤微环境的分泌型细胞因子或阻断调节肿瘤微环境的细胞因子的抑制剂。

本披露提供了使用四顺反子载体插入由单个高活性启动子驱动的多个基因以产生用于临床免疫疗法的稳定的免疫治疗性细胞系的益处。四顺反子载体使用一种或多种方法(包括p2a肽和ires元件)在单个启动子的控制下将四个基因串在一起，并与最终元件的表达联系在一起-在这种情况下，是需要表达才能维持细胞存活和/或扩增的选择剂。

在概念验证实施例中，用于在治疗细胞系中产生修饰基因表达谱的四个基因是：ccr7、cd19嵌合抗原受体、cd16的高亲和力变体以及内质网结合的il-2。er结合的il-2除了它在刺激将它整合到其中的基于的细胞系的细胞毒性能力中的作用以外，还用作选择剂。产生il-2的基因置于四顺反子载体的最后，距离启动子最远，因此最有可能丢失的元件应该是基因构建体片段(导致阴性选择和从库中自我切除，因为细胞持续存活需要il-2)。然而，如果所有元件都成功整合到基因组中，则将通过从培养基中去除il-2来选择细胞，因为只有那些整合了自身il-2来源的细胞才能存活。由于il-2元件距离启动子最远，因此这有利于四个元件的整个盒完全整合-可以通过对其他组分的流式细胞术染色分析进一步验证(请参见实例)。

本文所述的构建体提供了减少产生新的治疗细胞系的开发时间，以及减少来自多轮基因组操纵和随后选择对细胞的应力和不利影响的优点。另外，通过将选择剂(在这种情况下为er-il-2)放在构建体的末端，预计细胞将难以使构建体的任何给定组分沉默而不导致由于rna转录和加工的性质引起的il-2饥饿。因此，以这种方式构建的稳定细胞系应保持已经包含在载体中的所有组分的表达，只要它们继续产生自身的il-2即可。

为了演示概念验证，通过作为这种四顺反子构建体的一部分的4个组分来解决四个具体目标。il-2起到选择剂的作用并且是细胞的细胞毒性作用的已知激动剂，使得这些细胞成为有效的癌症治疗剂。ccr7元件(c-c趋化因子受体7型)是一种负责使表达它的免疫细胞在通常在淋巴结中表达的配体ccl19和ccl21的趋化因子梯度方向上迁移的趋化因子受体。在一个实施例中，本文考虑的ccr7元件可以包含与seqidno：1(ccr7序列)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的多核苷酸序列。在一个实施例中，本文考虑的ccl21可以包含与seqidno：2(ccl21序列)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的多核苷酸序列。在一个实施例中，本文考虑的ccl19可以包含与seqidno：16(ccl19序列)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的多核苷酸序列。

cd19car(嵌合抗原受体)是一种用于当它们遇到它们所遇到的细胞表面的cd19分化群(这是通常在正常和恶性b细胞上表达的分化群)时增加细胞的细胞毒性的构建体，并且已在针对b细胞淋巴瘤的定向免疫疗法试验中显示出功效。高亲和力cd16受体允许经修饰的细胞识别并应答已被igg抗体识别的细胞，这些抗体诸如在癌症治疗方案中用作单克隆抗体的那些抗体，如利妥昔单抗(rituxumab)和赫塞汀(herceptin)。当有cd16受体武装的免疫细胞遇到包被在这些抗体之一中的细胞时，它会触发adcc(抗体依赖性细胞毒性)，并试图破坏该细胞。实际上，这允许已经这样武装的细胞与针对癌症新抗原等的单克隆抗体一起用于组合治疗方案中。虽然这些组分中的每一种组分都有其自身的实用性，但建议组合这种特定组合，将会产生一种针对能够迁移到肿瘤长出的常见部位(淋巴结)的b细胞淋巴瘤的有效疗法，在那里识别b细胞抗原cd19并起始car介导的细胞毒性，或与单克隆抗体(如利妥昔单抗)一起起作用，以避免抗原逃逸的可能性。应当理解，该概念验证实例是非限制性的，并且可以使用本文所述的方法修饰细胞，以表达靶向其他目标抗原的其他归巢受体和/或car，以便产生有效的免疫治疗细胞系。

如本文所述，已经产生了经修饰的细胞，在用含有ccr7表达盒连同具有选择标志物的可去除选择盒的线性化基因构建体电穿孔后，受延长因子1a(ef1a)启动子驱动的ccr7淋巴结归巢受体具有稳定长期表达。嘌呤霉素选择一周后，随后进行连续稀释克隆，建立了保持高水平ccr7表达的单克隆细胞系。这些过表达ccr7的nk细胞在迁移/侵袭测定中对淋巴结相关趋化因子ccl21和ccl19具有功能性应答。在一个实施例中，本文考虑的ef1a启动子可以包含与seqidno：3(ef1a启动子序列)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的多核苷酸序列。

在一些示例性实施例中，本文考虑的趋化因子和归巢受体可以包含与seqidno：44(ccr7氨基酸序列)、或seqidno：45(ccl19氨基酸序列)、或seqidno：46(ccl21氨基酸序列)或seqidno：47(cxcr2核苷酸序列)、或seqidno：48(cxcr2氨基酸序列)、或seqidno：49(cxcl14核苷酸序列)、或seqidno：50(cxcl14氨基酸序列)、或seqidno：51(cd62l核苷酸序列)、或seqidno：52(cd62l氨基酸序列)、或seqidno：53(il-8核苷酸序列)、或seqidno：54(il-8氨基酸序列)、或seqidno：55(cxcl1核苷酸序列)、或seqidno：56(cxcl1氨基酸序列)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽序列或多核苷酸序列。

通过nfat转录因子的活化及其核易位，证实在细胞中识别易感细胞系的靶标接合。涉及fcerig或cd3ζ途径的靶标结合(包括adcc或car介导的靶标识别)足以在细胞中诱导nfat活化。这是通过插入含有3个终止区侧翼nfat结合结构域和一个驱动萤火虫荧光素酶的最小启动子的报告基因盒来证明的。通过将cd19carmrna电穿孔到该报告细胞系中，通过cd3ζ途径激活nfat，接着与sup-b15(cd19+，但对非特异性细胞毒性有抵抗力)共同培养，引起荧光素酶表达。

在一个实施例中，本文考虑的nfat应答元件序列(活化nfat的结合位点)可以包含与seqidno：4具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。

在一个实施例中，本文考虑的最小启动子(在3个nfat应答元件的下游)可包含与seqidno：5具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。

在一个实施例中，本文考虑的完整nfat应答盒(聚a+暂停位点，随后是3个nfat应答元件，随后是最小启动子)可以包含与seqidno：6具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。

在一个实施例中，本文考虑的用于初始插入的完整序列(ef1a启动子、带聚a的ccr7基因和由泛素启动子驱动的loxp侧翼嘌呤霉素抗性基因，全部包裹在靶向aavs1基因座的同源臂中)可包含与seqidno：7具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。

在一个实施例中，本文考虑的用于第二次插入的完整序列(含有驱动ccl21+聚a的nfat应答盒和由cmv驱动的frt嵌入型杀稻瘟素抗性基因)可以包含与seqidno：8具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。seqidno：8序列可以置换来自第一次插入的loxp侧翼嘌呤霉素抗性盒，即包围该序列中的杀稻瘟素基因的frt序列，以允许以后使用相似的flp-frt重组去除或置换该盒。

细胞系是人类il-2依赖性的nk细胞系，由诊断为非霍奇金淋巴瘤的50岁男性的外周血单核细胞(pbmc)建立(gong等人，leukemia.[白血病]8：652-8(1994))。细胞的特征在于在不存在cd3、cd8和cd16的情况下表达cd56^亮和cd2。cd56^亮/cd16^阴性/低表型是外周血中一小部分nk细胞的典型的，这一小部分nk细胞具有作为细胞因子生产者的免疫调节功能。与正常的nk细胞不同，缺乏大多数杀伤细胞抑制剂受体(kir)的表达(maki等人，jhematotherstemcellres.[造血干细胞研究杂志]10：369-83(2001))。在nk-92的表面上仅检测到kir2dl4，这是所有nk细胞表达的具有激活功能和抑制潜力的kir受体。kir2dl4被认为通过与hla等位基因g结合来介导抑制作用(suck，cancerimmunol.immunother.[癌免疫学免疫疗法]65(4)：485-92(2015))。细胞的细胞毒性杀伤的主要途径是通过穿孔素/酯酶途径；表达高水平的穿孔素和颗粒酶b(maki等人，jhematotherstemcellres.[造血干细胞研究杂志]10：369-83(2001))。

细胞具有非常宽的细胞毒性范围，并且对源自血液系统恶性肿瘤和实体瘤的细胞系具有活性(klingemann，blood[血液]，87(11)：4913-4(1996)；swift，haematologica.[血液学]97(7)：1020-8(2012)；yan等人，clincancerres.[临床癌症研究]4：2859-68(1998))。在严重的联合免疫缺陷(scid)小鼠中的安全性评估未显示出与治疗相关的影响，诸如急性毒性或长期致癌性(tam等人，jhemaother.[血液疗法杂志]8：281-90(1999)，yan等人，clincancerres.[临床癌症研究]4：2859-68(1998))。将细胞施用给受人类白血病细胞攻击的小鼠或人类黑色素瘤小鼠模型引起存活率提高以及对肿瘤生长的抑制，包括在一些小鼠肿瘤中完全缓解(tam等人，jhematother.[血液疗法杂志]8：281-90(1999)，yan等人，clincancerres.[临床癌症研究]4：2859-68(1998))。i期临床试验已证实其安全性。在wo1998/49268和美国专利申请公开号2002-0068044中披露了细胞系的表征，二者通过援引以其全文并入本文。

任选地，经修饰的细胞也可以表达fc受体cd16。如本文所用，术语“fc受体”是指在某些细胞(例如，自然杀伤细胞)的表面发现的蛋白，其通过与抗体的称为fc区的部分结合而有助于免疫细胞的保护功能。抗体的fc区与细胞的fc受体(fcr)的结合通过抗体介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)来刺激细胞的吞噬或细胞毒活性。fcr按其识别的抗体类型分类。例如，fc-γ受体(fcγr)与igg类抗体结合。fcγriii-a(也称为cd16)是与igg抗体结合并激活adcc的低亲和力fc受体。fcγriii-a通常在nk细胞上发现。编码cd16的代表性氨基酸序列如seqidno：12所示。编码cd16的代表性多核苷酸序列如seqidno：13所示。cd16的完整序列可以在swissprot数据库中按照条目p08637找到。

在一些实施例中，cd16受体在成熟cd16受体的igg结合域中的氨基酸位置158(f158v)处(对应于全长蛋白的位置176处的val)包含苯丙氨酸(f)-缬氨酸(v)取代，该取代会影响nk细胞的抗体依赖性细胞毒性(adcc)功能。与158f变体相比，cd16158v变体以更高的亲和力与人igg1和igg3结合。

任选地，经修饰的细胞包含与seqidno：13具有70％、80％、90％或95％同一性的核酸序列。任选地，经修饰的细胞包含与seqidno：13具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。任选地，经修饰的细胞包含与seqidno：12(在全长多肽的位置176处具有缬氨酸)具有70％、80％、90％或95％同一性的多肽。任选地，经修饰的细胞包含与seqidno：12具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽。

细胞的细胞毒性取决于细胞因子(例如，白介素2(il-2))的存在。因此，任选地，经修饰的细胞经进一步修饰以表达至少一种细胞因子。任选地，该至少一种细胞因子是il-2、il-12、il-15、il-18、il-21或其变体。任选地，该至少一种细胞因子是il-2、il-15或它们的组合。任选地，在具有将细胞因子引导至内质网的信号序列的情况下表达il-2和/或il-15。将il-2引导至内质网容许il-2以足以自分泌激活的水平表达，而不会在细胞外释放大量il-2。参见konstantinidis等人“targetingil-2totheendoplasmicreticulumconfinesautocrinegrowthstimulationtocells[使il-2靶向内质网将自分泌生长刺激限制于细胞中]”exphematol.[实验血液学]2005年2月；33(2)：159-64。编码il-2的代表性核酸如seqidno：14所示，并且il-2的代表性多肽如seqidno：15所示。

任选地，经修饰的细胞包含与seqidno：14具有70％、80％、90％或95％同一性的编码il-2的核酸序列。任选地，经修饰的细胞包含与seqidno：14具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。任选地，经修饰的细胞包含与seqidno：15具有70％、80％、90％或95％同一性的il-2多肽。任选地，经修饰的细胞包含与seqidno：15具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的il-2多肽。所提供的经修饰的细胞有利地能够在不存在il-2的情况下得以维持，而不会分泌引起临床副作用的量的il-2。

一方面，本发明的主题包括能够调节肿瘤微环境的经修饰的细胞。经修饰的细胞优选包含四顺反子载体，该四顺反子载体包含一个或多个编码以下物质的核酸：i)il-12或tgf-β阱，ii)与靶抗原特异性结合的抗原结合蛋白(abp)或嵌合抗原受体(car)，iii)fc受体，诸如cd16或cd16-158v，和/或iv)细胞因子，诸如eril-2或eril-15，其中核酸序列与启动子可操作地连接。在一个实施例中，分别在图21、图30和图31中说明了本文考虑的四顺反子载体。本文考虑的il-12可以包含与seqidno：57(p35核苷酸序列)或seqidno：59(p40核苷酸序列)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。本文考虑的il-12还可以包含与seqidno：58(p35氨基酸序列，同种型1前体)或seqidno：60(p40氨基酸序列，前体)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。

在一个示例性的实施例中，il-2/pd-l1四顺反子载体中的il-12单链p40_p35序列可以包含与seqidno：61具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多肽序列，或者可以包含与seqidno：62具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。

本文考虑的tgf-β阱可以包含与seqidno：63(tgfbrii细胞外结构域)或seqidno：65(tgfb阱序列)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。本文考虑的tgf-β阱还可以包含与seqidno：64(tgfbrii细胞外结构域)或seqidno：66(tgfb阱序列)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。其他合适的tgf-β阱包括在mol.canc.ther.[分子癌症疗法]2012，第11卷(7)，1477-1487中描述的那些。

此外，本发明主题的核酸构建体还可以包含编码2a肽(诸如t2a、p2a、e2a或f2a肽)的序列，以便产生由相同mrna编码的等摩尔水平的多肽。本文考虑的e2a肽可以包含与seqidno：17具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。本文考虑的t2a肽可以包含与seqidno：18具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。

在一个示例性的非限制性实例中，本文披露的质粒可以包含与seqidno：19(aavs1的5’同源臂)、seqidno：20(ef1a启动子)、seqidno：21(t7启动子)、seqidno：22(ccr7cdna)、seqidno：23(p2a元件)、seqidno：24(ighc前导序列)、seqidno：25(cd19car减去信号肽)、seqidno：26(高亲和力cd16)、seqidno：27(ires)、seqidno：28(sc40聚a)、seqidno：29(aavs1的3’同源臂)和/或seqidno：30(aavs1的同源臂)具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。

嵌合抗原受体

任选地，将经修饰的细胞进一步工程改造以在细胞表面上表达嵌合抗原受体(car)。任选地，car对肿瘤特异性抗原具有特异性。作为非限制性实例，肿瘤特异性抗原在us2013/0189268、wo1999024566a1、us7098008和wo2000020460a1中有描述，其各自通过援引以其全文并入本文。肿瘤特异性抗原包括但不限于nkg2d、cs1、gd2、cd138、epcam、ebna3c、gpa7、cd244、ca-125、eta、mage、cage、bage、hage、lage、page、ny-seo-1、gage、cea、cd52、cd30、muc5ac、c-met、egfr、fap、wt-1、psma、ny-eso1、afp、cea、ctag1b、cd19、cd33、b7-h4、cd20和41bb。可以如例如在专利公开号wo2014039523、us20140242701、us20140274909、us20130280285和wo2014099671中描述的那样设计car，每个专利公开均通过援引以其全文并入本文。任选地，该car是cd19car、cd33car或cspg-4car。在一个示例性的非限制性实例中，cd19car_cd3a可以包含与seqidno：41具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸序列。

归巢受体

本文提供了包含编码归巢受体的核酸的经修饰的细胞。在一些实施例中，归巢受体与启动子可操作地连接。在一些实施例中，归巢受体是g蛋白偶联受体。在一些实施例中，归巢受体是选自ccr1、ccr2、ccr3、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、ccr9、ccr10、cxcr1、cxcr2、cxcr3、cxcr4、cxcr5、cxcr6、cxcr7、cx3cr1、xcr1、ccxckr、d6、darc或cxcl14受体。在一些实施例中，编码ccr7的核酸与seqidno：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。任选地，归巢受体在经修饰的细胞的细胞表面上表达。任选地，经修饰的细胞进一步包含car。任选地，car是cd19。任选地，经修饰的细胞进一步包含fc受体。任选地，fc受体是cd16。任选地，经修饰的细胞进一步包含细胞因子，诸如il-2。在一些实施例中，il-2多肽可以具有与seqidno：42具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施例中，il-2多肽可以具有与seqidno：43具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。

表达载体

本文提供了包含与启动子可操作地连接的核酸的表达载体。该载体的编码不同元件的核酸可以各自与相同或不同的启动子可操作地连接。示例性的启动子包括但不限于cmv启动子、泛素启动子、pgk启动子还有ef1启动子。任选地，本文提供了表达载体，这些表达载体包含具有seqidno：1的核酸或与seqidno：1具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸。任选地，核酸与启动子可操作地连接。任选地，启动子选自由seqidno：3、9、10或11或与seqidno：3、9、10或11具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的启动子组成的组。任选地，核酸与启动子可操作地连接。任选地，启动子包含seqidno：4和/或seqidno：5。任选地，启动子包含seqidno：6或与seqidno：6具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸。

在一些实施例中，提供的表达载体包含seqidno：1或与seqidno：1具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸；seqidno：25(cd19car)或与seqidno：13(cd16158v)具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸，或与seqidno：14(eril-2核苷酸序列)具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸或多肽序列；和/或seqidno：15(eril-2氨基酸序列)，或与seqidno：14具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸。在一些实施例中，提供的表达载体包含seqidno：47(cxcr2)或与seqidno：47具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸；seqidno：25(cd19car)或与seqidno：12具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸；和seqidno：13(cd16158v)，和/或与seqidno：14具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸；和/或seqidno：15(eril-2)，或与seqidno：14具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸。合适的表达载体是本领域已知的并且可以使用。在另外的方面，重组核酸包含编码eril-15的区段，并且编码eril-15的核酸与seqidno：67具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。任选地，表达载体是质粒。

在图22中说明了pd-l1(tgfβ-阱)t-hank细胞中pd-l1car和cd-16的表达分析。而且，如图23所示，tgfβ-阱被分泌到tgfβ-阱/pd-l1t-hank细胞的培养上清液中。类似地，图30右栏示出了il-12病毒转导的细胞系的il-12分泌。

制备经修饰的细胞的方法

本文提供了制备包含本文所述的核酸分子的经修饰的细胞的方法。这些方法包括用表达载体转化细胞，该表达载体包含与启动子可操作地连接的本文所述的核酸。

如本文所用，术语启动子、启动子元件和调控序列是指调控与启动子可操作地连接的选定多核苷酸序列的表达，并实现选定多核苷酸序列在细胞中的表达的多核苷酸。在一些实施例中，启动子元件是或包含编码序列的5’位置的非翻译区(utr)。5’utr形成mrna转录物的一部分，因此也是真核生物中蛋白质表达不可或缺的一部分。转录后，5’utr可以在转录和翻译水平上调控蛋白质表达。哺乳动物宿主细胞中来自载体的控制转录的启动子可以从各种来源获得，例如，病毒，诸如多瘤病毒、猿猴病毒40(sv40)、腺病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒和巨细胞病毒的基因组(例如，seqidno：11)，或来自异源哺乳动物启动子，例如β肌动蛋白启动子、真核翻译延伸因子1α1(ef1α)启动子(例如，seqidno：3)、磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子(例如，seqidno：10)和泛素启动子(例如，seqidno：9)。本文提供的启动子与seqidno：3、9、10或11具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

如本文所用，短语选择标志物是指编码允许进行选择的产物(多肽)的核苷酸序列(例如，基因)，或者是指基因产物(例如，多肽)本身。术语选择标志物如同在本领域中通常理解的那样在本文中使用，并且是指在某些限定的培养条件(选择性条件)下，其在细胞或生物内的存在赋予该细胞或生物显著的生长或存活优势或劣势的标志物。如本文所用的短语选择剂是指对细胞或细胞群体引入选择压力以有利于或抵抗带有选择标志物的细胞或细胞群体的试剂。例如，选择剂是抗生素并且选择标志物是抗生素抗性基因。哺乳动物细胞的合适选择标志物的实例是二氢叶酸还原酶(dhfr)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物g418、潮霉素和嘌呤霉素。

如本文所用的核酸是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物和补体。该术语包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。该术语涵盖含已知核苷酸类似物或经修饰的主链残基或连键的核酸，其是合成的、自然存在的和非自然存在的，其具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-o-甲基核糖核苷酸、肽核酸(pna)。除非另有说明，否则可以使用核酸序列的保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列代替本文叙述的特定核酸序列。具体地说，简并密码子取代可通过产生一个或多个选定(或全部)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(batzer等人，nucleicacidres.[核酸研究]19：5081(1991)；ohtsuka等人，j.biol.chem.[生物化学杂志]260：2605-2608(1985)；rossolini等人，mol.cell.probes[分子细胞探针]8：91-98(1994))。术语核酸可与基因、cdna、mrna、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。

当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，核酸是可操作地连接的。例如，如果编码前序列或分泌前导序列的dna表达为参与多肽分泌的前蛋白，则它是与编码多肽的dna可操作地连接的；如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则它与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接意指连接的dna序列彼此靠近，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的且处于阅读相。然而，增强子不必是连续的。例如，与第二核酸序列可操作地连接的核酸序列直接或间接地共价连接至此类第二序列，但是任何有效的三维缔合都是可接受的。单个核酸序列可以与多个其他序列可操作地连接。例如，单个启动子可以指导多个rna种类的转录。可以通过在方便的限制位点连接来完成连接。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

治疗方法

本文描述了治疗受试者中的癌症或肿瘤的方法。如本文所用，术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、赘生物或恶性肿瘤，包括白血病、癌和肉瘤。示例性癌症包括脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和髓母细胞瘤。其他实例包括霍奇金氏病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、癌症、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类癌、膀胱癌、恶变前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌和外分泌胰腺赘生物以及前列腺癌。

如本文所用，术语“转移”、“转移性”和“转移性癌症”可以互换使用，并且是指增殖性疾病或病症例如癌症从一个器官或另一不相邻器官或身体部分扩散。癌症发生在起源部位，例如乳腺癌，该部位称为原发肿瘤，例如原发性乳腺癌。原发性肿瘤或起源部位中的一些癌细胞获得穿透和浸润局部区域中的周围正常组织的能力，和/或穿透淋巴系统壁或血管系统壁，通过该系统循环至体内其他部位和组织的能力。由原发性肿瘤的癌细胞形成的第二种临床上可检测的肿瘤称为转移性肿瘤或继发性肿瘤。当癌细胞转移时，推测转移性肿瘤及其细胞与原始肿瘤相似。因此，如果肺癌转移到乳腺，则乳腺部位的继发性肿瘤由异常的肺细胞而不是异常的乳腺细胞组成。乳腺中的继发性肿瘤称为转移性肺癌。因此，短语转移性癌症是指其中受试者患有或曾经患有原发性肿瘤并具有一个或多个继发性肿瘤的疾病。短语非转移性癌症或患有非转移性癌症的受试者是指其中受试者患有原发性肿瘤但没有一个或多个继发性肿瘤的疾病。例如，转移性肺癌是指患有原发性肺肿瘤或具有原发性肺肿瘤病史并且在第二位置或多个位置(例如在乳腺中)具有一个或多个继发性肿瘤的受试者中的疾病。

如本文所用，“治疗”病状、疾病或病症与病状、疾病或病症相关的症状或病状、疾病或病症与病状、疾病或病症相关的症状的“治疗”是指获得有益或期望的结果(包括临床结果)的方法。有益或期望的临床结果可以包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或病状，减弱病状、病症或疾病的程度，稳定病状、病症或疾病的状态，防止病状、病症或疾病的发展，防止病状、病症或疾病的扩散，延迟或减缓病状、病症或疾病进展，延迟或减缓病状、病症或疾病发作，改善或缓和病状、病症或疾病状态，以及部分或完全缓解。“治疗”也可以意指延长受试者的存活期，使其超出未进行治疗时预期的存活期。“治疗”也可以意指暂时抑制病状、病症或疾病的进展，暂时减缓病状、病症或疾病的进展，但是在一些情况下，它涉及永久性停止病状、病症或疾病的进展。如本文所用，术语治疗是指减少以蛋白酶表达为特征的疾病或病状的一种或多种症状或以蛋白酶表达为特征的疾病或病状的症状的影响的方法。因此，在披露的方法中，治疗可以指已确定的疾病、病状或该疾病或病状的症状的严重程度降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。例如，如果与对照相比，受试者中疾病的一种或多种症状减轻10％，则认为治疗疾病的方法是治疗。因此，与天然或对照水平相比，减轻量可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或介于10％和100％之间的任何百分比。应当理解，治疗不一定是指疾病、病状或该疾病或病状的症状的治愈或完全消融。此外，如本文所用，对降低、减轻或抑制的提及包括与对照水平相比为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的变化，并且此类术语可以包括但不一定包括完全消除。

术语受试者、患者、个体等并不是旨在为限制性的，并且通常可以互换。也就是说，被描述为患者的个体不一定患有给定疾病，而可能仅仅是在寻求医疗建议。如全篇所用，受试者可以是脊椎动物，更具体地说是哺乳动物(例如，人、马、猫、狗、牛、猪、绵羊、山羊、小鼠、兔、大鼠和豚鼠)，鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类和任何其他动物。该术语不指定特定的年龄或性别。因此，旨在覆盖成年和新生受试者，无论是雄性还是雌性的。如本文所用，患者、个体和受试者可以互换使用，并且这些术语并不是旨在为限制性的。也就是说，被描述为患者的个体不一定患有给定疾病，而可能仅仅是在寻求医疗建议。术语患者或受试者包括人类和兽类受试者。

如本文所用，“施用”是指通过任何适当的途径提供、接触和/或递送一种化合物或多种化合物以实现期望的效果。施用可以包括但不限于口服、舌下、肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病变内或颅内注射)、经皮、局部、经颊、直肠、阴道、鼻、眼、吸入和植入。任选地，细胞经肠胃外施用。任选地，细胞经静脉内施用。任选地，细胞是经瘤周施用。

因此，本文提供了减少受试者中的癌症转移的方法，这些方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的经修饰的细胞，从而减少受试者中的癌症转移。还提供了治疗受试者中的癌症的方法，这些方法包括选择患有癌症的受试者并向受试者施用治疗有效量的本文所述的经修饰的细胞的步骤，其中施用治疗受试者中的癌症。任选地，这些方法进一步包括向受试者施用另外的治疗剂。

在一些实施例中，这些方法进一步包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的经修饰的细胞，其中施用治疗受试者中的癌症或减小受试者中的肿瘤大小。在一些实施例中，这些方法包括向受试者施用经修饰的细胞，这些细胞包含编码以下物质的核酸：i)il-12或tgfb阱，ii)与靶抗原特异性结合的abp或car，iii)fc受体诸如cd16或cd16-158v，和/或iv)细胞因子诸如eril-2或eril-15。在一些实施例中，这些方法包括向受试者施用经修饰的细胞，这些细胞包含编码以下物质的核酸：i)归巢受体，ii)与靶抗原特异性结合的abp或car，iii)fc受体诸如cd16或cd16-158v，和/或iv)细胞因子诸如eril-2或eril-15。

在图24中说明了tgfβ阱/pd-l1对k562靶细胞的细胞毒性。而且，图25中示出了针对sup-b15^pd-l1+靶细胞的car杀伤，而图26中示出了针对mda-mb231靶细胞的car杀伤。在图27中说明了tgfβ阱/pd-l1对sup-b15^cd19-cd20+的adcc。图28说明tgfβ/smad荧光素酶报告hek293细胞受tgfβ诱导。图29中示出了在hek293t报告测定中分泌的tgfβ-阱螯合的tgfβ和受抑制的荧光素酶表达。报告细胞经1ng/mltgfβ1处理19小时。在其他选择中，优选的car分子特异性结合pd-l1，并且可以具有与seqidno：69至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列(其可以由与seqidno：68至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列编码。

细胞可以通过多种途径施用于受试者。例如，可以在一段时间内通过输注(例如，静脉内输注)将细胞施用于受试者。通常，对于单剂量的细胞，该时间段为5至130分钟。任选地，该时间段在90至120分钟之间。任选地，该时间段在15至30分钟之间。

细胞以及任选地其他抗癌剂可以在疗法期间向患有癌症的患者施用一次或其可以施用多次，例如每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时一次，或每1、2、3、4、5、6或7天一次，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周或更多周一次，或这些数字中任何两个之间的任何范围(包括端点)。因此，例如，可以每天向受试者施用细胞一次，持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天或更多天。任选地，以每天一次持续两天的周期施用细胞。在该周期之后一个或多个小时、一天或几天或一周或几周不用细胞治疗。如本文所用，术语“周期”是指以规律的时间表重复的治疗，其间有休息时间段(例如，没有治疗或用其他药剂治疗)。例如，给予一周的治疗然后休息两周是一个治疗周期。此类治疗周期可以重复一次或多次。因此，可以在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个周期施用细胞。

可以按细胞的绝对数量向受试者施用细胞，例如，可以向所述受试者施用约1000个细胞/次注射至多达约100亿个细胞/次注射，诸如每次注射约、至少约或至多约1×10¹⁰、1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁴、5×10⁴、1×10³、5×10³个(依此类推)细胞，或这些数字中任何两个之间的任何范围(包括端点)。任选地，将1×10⁸至1×10¹⁰个细胞施用于受试者。任选地，每周施用细胞一次或多次，持续一周或多周。任选地，每周施用细胞一次或两次，持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周或更多周。

任选地，可以以约1000个细胞/次注射/m²至多达约100亿个细胞/次注射/m²向受试者施用，诸如每次注射约、至少约或至多约1×10¹⁰个/m²、1×10⁹个/m²、1×10⁸个/m²、1×10⁷个/m²、5×10⁷个/m²、1×10⁶个/m²、5×10⁶个/m²、1×10⁵个/m²、5×10⁵个/m²、1×10⁴个/m²、5×10⁴个/m²、1×10³个/m²、5×10³个/m²(依此类推)细胞，或这些数字中任何两个之间的任何范围(包括端点)。任选地，向该受试者每m²施用1×10³至1×10¹⁰个细胞。任选地，向该受试者每m²施用2×10⁹个细胞。

任选地，可以按细胞的相对数量向此类个体施用细胞，例如，可以向所述个体施用约1000个细胞/千克个体至多达约100亿个细胞/千克个体，诸如约、至少约或至多约1×10¹⁰、1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、5×10⁷、1×10⁶、5×10⁶、1×10⁵、5×10⁵、1×10⁴、5×10⁴、1×10³、5×10³(依此类推)个细胞/千克个体，或这些数字中任何两个之间的任何范围(包括端点)。

任选地，总剂量可以按体表面积m²进行计算，包括每m²约1×10¹¹个、1×10¹⁰个、1×10⁹个、1×10^8个、1×10⁷个，或这些数字中任何两个之间的任何范围(包括端点)。任选地，向患者施用约10亿个至约30亿个的细胞。任选地，每剂注射的细胞的量可以通过体表面积m2计算得出，包括每m²为1×10¹¹个、1×10¹⁰个、1×10⁹个、1×10⁸个、1×10⁷个、1×10⁶个、1×10⁵个、1×10⁴个、1×10³个。

任选地，以包含细胞和培养基(诸如人血清或其等效物)的组合物的形式施用细胞。任选地，培养基包含人血清白蛋白。任选地，培养基包含人血浆。任选地，培养基包含约1％至约15％的人血清或人血清等效物。任选地，培养基包含约1％至约10％的人血清或人血清等效物。任选地，培养基包含约1％至约5％的人血清或人血清等效物。任选地，培养基包含约2.5％的人血清或人血清等效物。任选地，血清是人ab血清。任选地，使用可接受用于人治疗剂的血清替代物代替人血清。此类血清替代物可以是本领域已知的。任选地，以包含细胞和支持细胞活力的等渗液体溶液的组合物的形式施用细胞。任选地，以从冷冻保存的样品重构的组合物的形式施用细胞。

根据本文提供的方法，向受试者施用有效量的本文提供的一种或多种药剂。术语有效量和有效剂量可以互换使用。术语有效量定义为产生期望的生理反应(例如减轻炎症)所必需的任何量。本领域技术人员可以凭经验确定施用药剂的有效量和时间表。施用的剂量范围是足够大以产生期望效果的那些剂量范围，在期望效果中疾病或病症的一种或多种症状受到影响(例如，减轻或延迟)。剂量不应如此大以致引起严重的不良副作用，诸如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量将随年龄、病状、性别、疾病类型、疾病或病症的程度、施用途径或方案中是否包括其他药物而变化，并且可以由本领域技术人员确定。如果发生任何禁忌症，则剂量可由个体医师调整。剂量可以变化，并且可以每天施用一次或多次，持续一天或几天。对于给定类别的药物产品，可以在文献中找到适当剂量的指南。例如，对于给定参数，有效量将显示至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％的增加或减少。功效也可以表示为增加或减少“多少倍”。例如，治疗有效量可以相对于对照具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多倍的作用。确切的剂量和配方将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知的技术来确定(参见，例如，lieberman，pharmaceuticaldosageforms[药物剂型](第1-3卷，1992)；lloyd，theart，scienceandtechnologyofpharmaceuticalcompounding[药物复合的领域、科学和技术](1999)；remington：thescienceandpracticeofpharmacy[雷明顿：药学科学与实践]，第22版，gennaro编辑(2012)，和pickar，dosagecalculations[剂量计算](1999))。

药学上可接受的组合物可以包含多种载剂和赋形剂。可以使用各种水性载剂，例如，缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，并且通常不含不需要的物质。合适的载剂及其配制品在remington：thescienceandpracticeofpharmacy[雷明顿：药学科学与实践]，第22版，loydv.allen等编辑，医药出版社(pharmaceuticalpress)(2012)中有描述。药学上可接受的载剂意指不是生物学上或其他方面不适宜的材料，即，向受试者施用该材料不会引起不适宜的生物学效应或以有害的方式与药物组合物中含有的其他组分相互作用。如果向受试者施用，则任选地选择载剂以最小化活性成分的降解和最小化受试者的不良副作用。如本文所用，术语药学上可接受与生理学上可接受以及药理学上可接受同义使用。药物组合物通常包含用于在储存中缓冲和保存的药剂，并且可以根据施用途径而定包括用于适当递送的缓冲剂和载剂。

这些组合物可以含有接近生理条件所需的可接受的辅助物质，诸如ph调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些配制品和/或其他药剂中的细胞浓度可以变化，并且将根据所选择的特定施用模式和受试者的需要，主要根据流体体积、粘度、体重等进行选择。

组合疗法

任选地，将细胞与用于所治疗癌症的一种或多种其他治疗一起施用于受试者。不受理论的束缚，据信用细胞和另一种癌症疗法共同治疗受试者将使细胞和替代疗法为内源免疫系统提供清除迄今为止压倒此类内源性作用的癌症的机会。任选地，用于所治疗癌症的两种或更多种其他治疗包括例如抗体、双特异性衔接子、辐射、化学治疗剂、干细胞移植或激素疗法。

任选地，将抗体与细胞一起施用于患者。任选地，细胞和抗体例如在相同的配制品中一起施用于受试者；例如在单独的配制品中，同时单独地施用于受试者；或者可以例如以不同的给药时间表或在一天中的不同时间单独地施用。当单独施用时，抗体可以任何合适的途径施用，诸如静脉内或口服施用。

任选地，抗体可用于靶向癌细胞或表达癌症相关标志物的细胞。已将许多抗体批准单独用于治疗癌症。

所提供的方法可以进一步与其他肿瘤疗法诸如放射疗法、手术、激素疗法和/或免疫疗法组合。因此，所提供的方法可以进一步包括向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。合适的另外的治疗剂包括但不限于止痛剂、麻醉剂、兴奋剂、皮质类固醇、抗胆碱能剂、抗胆碱酯酶、抗惊厥药、抗肿瘤剂、变构抑制剂、合成代谢类固醇、抗风湿剂、心理治疗剂、神经阻滞剂、抗炎剂、驱虫药、抗生素、抗凝剂、抗真菌剂、抗组胺药、抗毒蕈碱剂、抗分枝杆菌剂、抗原生动物剂、抗病毒剂、多巴胺能药、血液学药剂、免疫学药剂、毒蕈碱药、蛋白酶抑制剂、维生素、生长因子和激素。基于所治疗的给定疾病，本领域技术人员可以容易地确定药剂和剂量的选择。任选地，另外的治疗剂是醋酸奥曲肽(octreotideacetate)、干扰素、派姆单抗(pembrolizumab)、吡喃葡萄糖基脂质a、卡铂(carboplatin)、依托泊苷(etoposide)或其任意组合。

任选地，另外的治疗剂是化学治疗剂。化疗治疗方案可以包括向受试者施用一种化学治疗剂或化学治疗剂的组合。化学治疗剂包括但不限于烷化剂、蒽环类、紫杉烷类、埃博霉素(epothilone)、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、拓扑异构酶i抑制剂、拓扑异构酶ii抑制剂、激酶抑制剂、单克隆抗体、核苷酸类似物和前体类似物、肽抗生素、铂基化合物、类维生素a、长春花生物碱及其衍生物。任选地，化学治疗剂是卡铂。

药剂或组合物的组合可以伴随(例如，作为混合物)，单独但同时(例如，经由单独的静脉管)或依次施用(例如，先施用一种药剂，然后施用第二种药剂)。因此，术语组合用于指两种或更多种药剂或组合物的伴随、同时或依次施用。最好在个体的基础上根据受试者的特定特征和所选治疗类型来确定治疗过程。可以每天一次、每天两次、每两周一次、每月一次或以治疗有效的任何适用基础，向受试者施用治疗，诸如本文披露的那些治疗。治疗可以单独施用或与本文披露的或本领域已知的任何其他治疗组合施用。可以与第一疗法同时，在不同时间或以完全不同的治疗时间表来施用另外的治疗(例如，第一疗法可以是每天一次，而另外的治疗是每周一次)。

试剂盒

本文提供了包含本文所述的经修饰的细胞的试剂盒。在一些实施例中，该试剂盒包含经修饰的细胞，这些细胞包含与启动子可操作地连接的编码以下物质的核酸：i)归巢受体，ii)与靶抗原特异性结合的abp或car，iii)fc受体(诸如cd16或cd16-158v)，和/或iv)细胞因子(诸如eril-2)。任选地，由核酸序列编码的一种或多种蛋白质在经修饰的细胞的细胞表面上表达。在一些实施例中，试剂盒包含经修饰的细胞，其包含与启动子可操作地连接的编码c-c趋化因子受体7型(ccr7)、cxcr2或cxcl14受体的核酸。任选地，编码ccr7的核酸与seqidno：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。任选地，归巢受体在经修饰的细胞的细胞表面上表达。任选地，启动子包含一个或多个nfat结合元件和最小启动子。任选地，启动子与seqidno：6具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。任选地，由核酸序列编码的一种或多种蛋白质在经修饰的细胞的细胞表面上表达。

任选地，在包含药学上可接受的赋形剂的组合物中提供经修饰的细胞。任选地，试剂盒可以含有其他化合物，诸如治疗活性化合物或欲在施用经修饰的细胞之前、同时或之后施用的药物。任选地，试剂盒的使用说明书将包括在癌症治疗中使用试剂盒组分的指导。说明书可以进一步含有关于如何制备抗体(例如，在冷冻干燥的蛋白质的情况下，稀释或重构)和细胞(例如，解冻和/或培养)的信息。说明书可以进一步包括关于施用剂量和频率的指南。

披露了如下材料、组合物和组分，其可以用于披露的方法和组合物的产物，可以与这些产物结合使用，可以用于制备这些产物，或披露了这些产物。本文披露了这些和其他材料，并且应理解，当披露这些材料的组合、子集、相互作用、分组等时，虽然这些化合物的各个单独和总体组合与排列的具体提及可能未明确披露，但每个都在本文中都有特别考虑和描述。例如，除非明确指出相反，否则如果披露并讨论了一种方法，并且讨论了可对许多分子(包括该方法)进行的许多修改，则特别考虑了该方法的每种和每个组合与排列以及可能的修改。同样地，也特别考虑和披露这些的任何子集或组合。此概念适用于本披露的所有方面，包括但不限于使用所披露组合物的方法中的步骤。因此，如果可以进行多个另外的步骤，则应理解，这些另外的步骤中的每一个均可以用所披露方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来进行，并且特别考虑并且应该认为披露了每个此种组合或组合的子集。

本文引用的出版物及其所引用的材料特此通过援引以其全文并入。

以下实例旨在进一步说明本文所述的方法和组合物的某些方面，而非旨在限制权利要求的范围。

实例

实例1.表达调节肿瘤微环境的细胞因子ccr7的经修饰的nk细胞系。

使用neon转染系统(马萨诸塞州沃尔瑟姆市的赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific，waltham，ma))，通过用线性化pnkat-ccr7-lp3质粒(图1)对细胞进行电穿孔，制备经修饰的细胞。嘌呤霉素选择1周后，测试所得多克隆群体的ccr7表达，并通过在补充了5％人血清和il-2的生长培养基中进行连续稀释而得到单克隆细胞系。经修饰的细胞含有ef1α启动子、带聚a尾的ccr7基因和由泛素启动子驱动的loxp侧翼嘌呤霉素抗性基因，这些全部包裹在靶向aavs1基因座(seqidno：7)的同源臂中。

为了验证ccr7的表达不影响细胞，测定了细胞标志物的表达。结果如图3所示。图3中的所有数据都是使用intellicytiquescreenerplus生成的。将细胞与针对所述表型标志物的apc缀合抗体或用作阴性对照的适当同种型在4℃下孵育30分钟。然后将细胞在pbs+1％bsa中冲洗，沉淀，并重悬于30ulpbs+1％bsa中。然后如左上象限所示对示值读数(readout)进行门控，以从读数(reading)中消除细胞碎片，然后将右上象限中所示的高于荧光阈值的细胞百分比显示为两个单独的热图，分别在左下象限和右下象限中示出了高于“阳性”阈值和“强阳性”阈值的百分比。图3显示，驱动ccr7的表达不会对与我们的细胞系相关的主要表型标志物产生有意义的影响。具体地说，ccr7表达似乎不会影响cd54、nkp30或nkg2d表达。

为了测定经修饰的细胞的细胞毒性，将效应细胞(细胞和经修饰的细胞克隆物)在96孔v型底板中连续稀释，10万个效应细胞留在最高浓度的孔中并且在该板的8行中有另外7种2倍稀释液。然后将染色的靶细胞(k562(图4)、hl-60(图5))以1万个/孔接种到所有含效应细胞的孔中，以及其目标仅仅是测量背景死亡的对照孔中。然后将板短暂离心，并在37℃和5％co2下孵育4小时。然后将板离心，吸出上清液，并将细胞重悬于含碘化丙啶的pbs中以测量细胞死亡。然后使细胞运行通过intellicytiquescreenerplus，并测量pi染色也呈阳性的(通过其染色与效应子区分开的)靶细胞的比例。然后将死细胞的百分比与对照孔中自然死亡的细胞的数目进行比较，并计算被效应细胞特异性杀伤的细胞的百分比。结果如图4和图5所示。图4显示ccr7上调的克隆物与亲本细胞系相比对k562细胞的同等细胞毒性，图5显示ccr7上调的克隆物与亲本细胞系相比对hl-60细胞的同等细胞毒性。

体外测试由使用boyden腔室测定法和matrigel层来阻止迁移组成。在这些测定中，表达ccr7的经修饰的细胞显示出向ccl21和ccl19(一种替代的ccr7配体)迁移。将细胞置于上部孔中，并且被涂在8um孔隙上的matrigel(ecm样基质)薄层与下部腔室隔开。将细胞(2.5万个/孔)置于上部腔室中的低血清培养基(补充有1％人血清和500u/mlil-2)中，并在单独的或含有目标趋化因子的下部腔室中使用相同的低血清培养基。在这种情况下，以15ng/ml使用ccl21，以15ng/ml使用ccl19，并以20ng/ml使用sdf-1a。对于细胞或表达ccr7的经修饰的细胞，一式三份进行每个测试。然后将板置于培养箱中过夜，进行18小时的侵袭测定，之后移去上部腔室，并且在充分混合后从下部孔中取样150μl(总体积750μl)，并在macsquantfacs分析仪上进行读数。对下部腔室中的活细胞计数，然后将细胞数目与不含趋化因子的孔进行比较，并生成侵袭性指数数字。将这些数字取平均值，并使用双尾t检验计算统计相关性。由于对下部孔取样，而没有细胞从下部膜上脱离，那些仍附着在ecm下部的细胞将无法表示在这些数字中，可能在ccl19和ccl21之间产生差异。结果如图7所示。具体地说，图7显示了表达ccr7的经修饰的细胞向ccl19(一种ccr7趋化因子)的侵袭性的统计显著性增加。对ccl21缺乏统计学显著应答可能是由于所进行的测定法的性质所致。该测定法测量侵袭和随后从ecm的脱离，这是与ccl19梯度迁移一致的行为。ccl21在诱导迁移的同时，不会诱导从基质脱离，需要额外的步骤来证明统计上显著的侵袭潜力。

实例2.用于ccl21的受控表达的nfat应答性构建体的产生。

为了鉴定nfat应答元件，通过将线性化构建体电穿孔到细胞中来产生稳定地表达基于nfat的荧光素酶表达盒(nr2.2)的细胞系，这些细胞含有终止区，然后是3个nfat应答元件(seqidno：4)，和最小启动子(seqidno：5)，因此最小启动子将在活化nfat的存在下将驱动萤火虫荧光素酶的产生。然后，还用含有抗cd19car(一种存在于sup-b15细胞上的抗原，否则对细胞杀伤具有抵抗力)的mrna对这些细胞的子集进行电穿孔。这些细胞在左图中表示为enr2.2。然后在不存在或存在靶细胞的情况下将细胞一式三份接种，并孵育2.5小时至24小时。在孵育期结束时，将来自promegadualglo系统的步骤1试剂添加到孔中以激活荧光素酶(通过提供其底物荧光素来激活)。然后在spectramaxi3x酶标仪上读取结果，并以在microsoftexcel中计算的带标准偏差的平均值表示。结果如图6a和图6b所示。在靶标以时间依赖性方式与k562结合以及只有在用cd19-car的mrna进行电穿孔时才与sup-b15结合的情况下证明了nfat激活。

实例3.表达ccr7和ccl21的经修饰的nk细胞系。

在重组酶介导的盒式交换中使用嵌入pnkat-ccr7-lp3构建体中的loxp位点，将pcrenfat-ccl21质粒并入到含有ccr7的细胞中。在对环状质粒(pcrenfat-ccl21)进行电穿孔后，cre重组酶瞬时表达，介导新的loxp侧翼盒与旧的选择盒交换。使用杀稻瘟素中的选择有利于新盒的并入，并且以与实例1中先前描述的相同方式从所得群体中亚克隆单克隆细胞系，以获得表达ccr7和ccl21的经修饰的细胞。

为了评价表达ccr7和ccl21的经修饰的细胞，将未染色的经修饰的细胞与已知会引起nfat活化的细胞(k562或其他细胞系)一起在boyden腔室的下部孔中进行共同培养，并将染色的经修饰的细胞置于上部腔室中。如果证明会通过与敏感细胞系共同培养而诱导迁移，则该系统正在起作用。

实例4：使用表达ccr7的经修饰的nk细胞系进行体外细胞毒性测定

图9显示，如实例1中所述，经修饰以表达ccr7的细胞在经过改良的boyden腔室transwell测定中在迁移后仍保持对靶细胞的细胞毒性。

实例5：ccr7、cd16和cd19car在经核酸构建体转染的细胞中的细胞表面表达

图12显示，经编码ccr7、cd16和cd19car的核酸构建体转染的经修饰的细胞在细胞表面上表达高水平的相应蛋白质。

实例6：携带ccl19阳性皮下k562肿瘤的nsg小鼠中表达ccr7的趋化因子应答性nk细胞的生物分布

这项研究证明，在静脉内施用后，趋化因子应答性ank细胞归巢至表达趋化因子的靶组织。因为小鼠和人趋化因子不会交叉反应，所以诸位发明人开发了表达局部配体的肿瘤模型作为替代模型。

实验方法(表1)：

a.动物：

i.动物类型：nsg小鼠(jax)，雌性，7-8周龄

ii.动物数量：30只(28只动物接受nk细胞注射[24只+4只额外的]；另外2只小鼠未接受nk处理并且用作流式细胞术的阴性对照)

b.肿瘤模型：

i.细胞系：k562，亲本的和表达ccl19的亚系，k-19

ii.接种途径：皮下；亲本k562在左胁腹接种，k-19在右胁腹接种

iii.接种物：1e6个细胞在100μl无血清培养基/matrigel(v/v1∶1)中

iv.开始处理时的肿瘤负荷：k-19平均107mm³；亲本k562平均135mm³

v.随机分组：主要根据k-19肿瘤的体积将动物随机分组。

c.供试品：

i.nk细胞：

1.cd19t-hank(非cr)(南特西部多利松公司(nantkwesttorreypines))

2.四顺反子mi-ankr7-19.1(南特西部沃本公司(nantkwestwoburn))

ii.荧光标记：

1.根据制造商手册，将两种类型的nk细胞均用cfse标记，之后立即进行体内施用。

2.对于每个时间点，收获培养的cfse标记细胞以用作流式细胞术的阳性对照。

iii.施用方法：静脉内

iv.剂量：

1.1e7个细胞/只小鼠

v.给药频率：单剂量

d.肿瘤收集：

i.时间点：给药后3、24和48小时(±2小时)

ii.n＝4只小鼠/组/时间点

iii.肿瘤处理：根据内部方案(附加的)将收集的肿瘤解离为单细胞悬液，并进行cfse阳性nk细胞的流式细胞仪计数。

e.公式和统计分析：

i.肿瘤体积＝长度×宽度²/2(长度和宽度分别是肿瘤的最长和最短直径)

ii.通过单因素方差分析，随后使用graphpadprism7.0版通过tukey检验进行的多重比较来进行统计分析。p＜0.05被认为是统计学上显著的。

表1.实验设置

结果：

a.安全性：

iii.接受两种类型的nk细胞的动物在细胞输注后立即表现出轻度至中度的急性反应(g1-g2，轻度-明显抑郁，嗜睡，缓慢或无应答)。

iv.在注射后24小时内，发现r7-19.1组的2只动物(共14只)死亡，而cd19t-hank组中没有死亡。

v.24h后，cd19t-hank组的动物能够恢复，而r7-19.1组的动物则继续表现为轻度抑郁并且对刺激的应答较弱(g1)。它们在48小时(g0)时变得应答较强，但仍然看起来皮毛粗糙且呼吸急促。

b.nk细胞归巢：

vi.每个时间点的肿瘤浸润nk细胞的数目在表2中列出并且在图13中给出图表。

1.四种ccr7受体-ccl19配体组合为：

a.cd19k562肿瘤：无受体-无配体[--]；

b.cd19k-19肿瘤：无受体-有配体[-+]；

c.r7-19.1细胞，k562肿瘤：有受体-无配体[+-]；和

d.r7-19.1细胞，k-19肿瘤：有受体-有配体[++]

vii.在3小时时，r7-19.1细胞向k-19肿瘤的归巢[++]明显大于非crcd19t-hank细胞向ccl19-或ccl19+肿瘤的归巢(分别为[--]和[-+]；p＜0.05)。然而，由于我们无法从b组的四种k562肿瘤中的2种回收许多细胞，因此无法实现同一动物中r7-19.1细胞向ccl19阴性与阳性肿瘤的归巢的直接比较。

viii.在24小时时，四种ccr7受体-ccl19配体组合中的任何一种在nk细胞归巢方面均不存在统计学上显著的差异。然而，当比较同一动物中每个nk细胞系向ccl19+和-肿瘤的归巢时，接受r7-19.1细胞的4只动物中有3只显示出向ccl19+肿瘤的浸润改善，而大多数接受cd19的动物显示出向两种肿瘤的nk浸润水平相似，而无论其ccl19表达如何(图14)。

ix.在48小时时，在所有组合中，肿瘤浸润nk细胞的总数均降低，并且在任何组之间都不存在差异。

表2.在指定时间点非cr与r7-19.1向亲本肿瘤或表达ccl19肿瘤的归巢。结果是平均值±sem。除非另有说明，否则n＝4。

*，n＝2。

该实例证明在给药后3小时，ccr7受体和ccl19配体的共存导致更有效的nk细胞浸润。给药后24小时，在接受非crank细胞的动物中，在4只动物中的3只中无论ccl19表达状态如何，nk细胞均表现出相似的肿瘤归巢水平。相反，在接受r7-19.1细胞的动物中，在4只动物中的3只中，与不表达配体的亲本对照相比，nk细胞能够更有效地归巢至ccl19阳性肿瘤。不论受体或配体表达如何，在48小时时肿瘤浸润nk细胞的数目均减少。尤其是在早期数小时(给药后＜48小时)r7-19.1细胞向ccl19肿瘤有明显更多归巢的趋势，这表明如果将细胞在治疗环境中使用，则暴露量更高且细胞毒性也可能更强。

实例7：带有静脉内ccl19阳性raji肿瘤的nsg小鼠中表达ccr7的r7-19.1细胞的对比功效评价

ccr7是一种趋化因子受体，它诱导细胞向趋化因子ccl19和ccl21的梯度方向迁移，这些趋化因子通常在淋巴结和其他淋巴器官中表达，淋巴结和其他淋巴器官是b细胞淋巴瘤疾病表现的主要部位。我们已经基于t-hank平台创建了表达cd19-car、ccr7、cd16.158v和eril-2的趋化因子应答性细胞(即r7-19.1细胞)。除有ccr7表达以外，这些细胞还具有针对cd19癌抗原、cd16变体和er-il-2的靶向癌症的嵌合抗原受体(car)。先前的分布研究已经证明，与亲本对应物相比，r7-19.1细胞优先向表达ccl19的皮下(sc)肿瘤归巢。

在本研究中，在nsg小鼠中在raji-19.5的静脉内(iv)异种移植模型中评价了重复静脉内施用r7-19.1细胞的抗肿瘤作用，raji-19.5是经工程改造以表达ccl19的raji人伯基特淋巴瘤细胞。不表达ccr7的cd19t-hank细胞([抗cd19-car、cd16.158v、eril-2])用作对照nk细胞系。媒介物对照组也包括在内。

虽然与媒介物对照相比，两种nk细胞系在延长ivraji-19.5荷瘤动物的存活率方面均展示出显著的治疗功效，但用r7-19.1细胞处理给出比cd19t-hank细胞显著更高的存活益处。尽管在两种nk细胞系中均观察到明显的与处理相关的反应，但推测这些反应是与使用相对高剂量的人源细胞有关的小鼠特异性问题。

研究基本原理和目的：体内分布数据显示，iv施用的r7-19.1细胞表现出向表达ccl19的sc肿瘤的归巢增加。在本研究中，在nsg小鼠中在raji-19.5(raji的表达ccl19的亚系)的iv异种移植模型中评价了重复iv施用r7-19.1细胞的抗肿瘤作用。注意，原始研究方案含本报告中未包括的其他动物组(a-c组)。它们与该肿瘤模型中r7-19.1细胞的功效测定无关(有关简化的实验设计，请参见表3)。

研究材料：

一种或多种供试品。供试品是r7-19.1细胞和cd19t-hank细胞(不表达ccr7的对照nk细胞；克隆物6)。将r7-19.1细胞在补充有5％热灭活的人ab血清和0.05％普朗尼克(pluronic)f68的生长培养基中培养。关于cd19t-hank细胞(不表达ccr7的对照nk细胞；克隆物6)，将cd19t-hank细胞在补充有5％热灭活的人ab血清和0.05％普朗尼克f68的生长培养基中培养。将无血清生长培养基用作媒介物对照。

试验系统：试验动物：使用在研究开始时(在检疫和适应后)为10-11周龄且在随机分组时体重在20-27克之间的nod.cg-prkdc^scidil2rg^tmiwjl/szj(nsg)雌性小鼠。研究中使用的动物数目为30，并且供应商是杰克逊实验室(thejacksonlaboratory)(美国缅因州巴尔港大街610号，邮编04609(610mainstreetbarharbor，me04609us))。用耳标、笼号和尾标号对动物进行标识。

raji-19.5肿瘤模型(癌细胞系)

细胞培养基：使raji-19.5癌细胞在补充有10％胎牛血清的atcc配制的rpmi-1640改良培养基中生长。

细胞收获：按照南特西部公司的sop_suspensioncancercellcollectionforinvivostudies[用于体内研究的悬浮癌细胞收集]，通过离心收集指数期的raji-19.5细胞(第16代)。然后将细胞洗涤，并以5×10⁵个细胞/ml的浓度重悬于无血清培养基中，并在动物接种前于冰上储存。体内研究中使用的细胞具有97％的活力。

接种：经由侧尾静脉向30只小鼠接种0.2ml体积的1×10⁵个细胞。这被定义为第0天。

实验程序

体重：在入组前(在检疫/适应后)，随机分组之前，每次给药的当天(但在给药之前)，每次给药后的第二天以及安乐死之前为动物称重。根据iacuc机构政策，对与基线(第0天)体重相比展示出体重减轻＞20％的动物实施安乐死，然后由研究主管决定进行尸检。

临床观察：每天观察动物的死亡率/发病率(g0至g4；参见附录1的研究方案中的表2)。对濒死和瘫痪动物实施安乐死，然后由研究主管决定进行尸检。

随机分组：在第3天(接种肿瘤细胞后3天)，根据动物体重将30只荷瘤小鼠伪随机分为3个研究组，每组10只。

供试品施用：连续4周每周两次(在第3、6、10、13、17、20、24和27天)，通过离心收获在指数期生长的r7-19.1和对照cd19t-hank细胞，并以5×10⁷个细胞/ml的浓度配制在无血清生长培养基中，以通过200μl的注射体积以每只小鼠1×10⁷个细胞的剂量iv施用。所有细胞处理和配制程序均在室温下进行。所有剂量制剂的细胞活力均高于80％。如表3所示，在d组接受媒介物对照的同时，e组和f组分别接受cd19t-hank和r7-19.1细胞。

终点：当动物瘫痪、濒死或符合机构iacuc限定的任何其他终点标准时，对动物实施安乐死。当最后存活的动物死于疾病时，实验在第30天结束。安乐死是经由吸入co2，然后通过颈脱位进行的。在研究主管的决定范围内，对一些安乐死的动物进行尸检，以鉴定内部器官上可见的肿瘤结节。死亡率和死亡事件以及尸检结果的完整记录可在附录5中找到。

表3：研究设计(简略)

biw：每周两次；iacuc：机构动物护理和使用委员会；iv：静脉内。

数据分析：

体重曲线：通过双因素方差分析(或有缺少值时通过混合效应分析；请参见附录1的修订2)，然后通过tukey检验进行多重比较来分析体重曲线。

存活曲线：通过对数秩(mantel-cox)检验分析存活曲线。

统计分析：所有统计分析均使用graphpadprism8版进行。p＜0.05被认为是统计学上显著的。

结果

功效：功效的主要示值读数是动物存活率。当动物因发病、瘫痪或体重减轻＞20％而被安乐死时，对死亡事件进行计数。没有发现动物死亡。如图15和表4所示，与媒介物对照相比，用r7-19.1和对照cd19t-hank细胞处理均能够显著延长raji-19.5iv荷瘤动物的存活期(通过对数秩检验，对于r7-19.1，p＜0.0001；对于cd19t-hank，p＝0.0002)，中位存活期分别增加了6.5天和2.5天。这与相对于媒介物对照分别增加30％和12％相对应。更重要的是，与cd19t-hank细胞相比，r7-19.1细胞中ccr7趋化因子应答性受体的表达使中位存活期再增加4天(提高17％)(p＜0.0001)。

表4：经媒介物、cd19t-hank细胞或r7-19.1细胞处理的raji-19.5iv荷瘤nsg小鼠的中位存活期汇总。

na：不适用。

安全性

如图16所示，经nk细胞处理的动物在每次处理施用后始终展示出5％-10％的体重减轻。在大多数情况下，动物能够从细胞注射中恢复过来，并表现出体重恢复，从而在剂量之间引起体重变化曲线的振荡。然而，初始剂量似乎引起了最严重的反应，并且与临床症状以及体重变化的最长恢复时间相关。此类反应在接受ivnk输注的动物中并不罕见，而且肯定不是r7-19.1细胞特异性的。体重的恢复表明体重减轻是暂时且可逆的。

值得注意的是，在研究结束时，动物显示出体重急剧下降(图16)，这可能是由于疾病进展)。尸检揭示几乎所有检查的动物的肝脏、卵巢以及偶尔脾脏中都有肿瘤结节。有一个例外是cd19t-hank细胞组中实施安乐死的第一只小鼠，它在第6次给药后的第二天达到体重减轻＞20％。这只动物在尸检期间没有鉴定出可见的肿瘤结节。因此，不能确定批准安乐死的确切体重减轻原因。

结论

在ivraji-19.5异种移植模型中，以1×10⁷个细胞/剂的给药水平iv给药新制备的r7-19.1细胞(每周两次，持续4周)显示出值得注意且统计上显著的抗肿瘤功效。该处理相对于媒介物对照组提供了6.5天或30％的中位存活期增加，并且相对于cd19t-hank处理组提供了4天或17％的增长。

尽管观察到明显的与处理相关的反应，但这些反应是瞬时的，存活的动物确实显示出恢复的迹象。推测这些反应是与施用相对高剂量的人源nk细胞有关的小鼠特异性问题，因此不可能转化到人类中。

总体而言，在该raji-19.5的iv模型中，与媒介物及其非趋化因子应答性对应物相比，表达ccr7的r7-19.1细胞显示出显著的治疗功效。

实例8：带有皮下ccl19阳性raji肿瘤的nsg小鼠中表达ccr7的r7-19.1细胞的对比功效评价

ccr7是一种趋化因子受体，它诱导细胞向趋化因子ccl19和ccl21的梯度方向迁移，这些趋化因子通常在淋巴结和其他淋巴器官中表达，淋巴结和其他淋巴器官是b细胞淋巴瘤疾病表现的主要部位。我们已经基于t-hank平台创建了表达acd19-car、ccr7、cd16.158v和eril-2的趋化因子应答性细胞(即r7-19.1细胞)。除有ccr7表达以外，这些细胞还具有针对cd19癌抗原、cd16变体和er-il-2的靶向癌症的嵌合抗原受体(car)。先前的分布研究已经证明，与亲本对应物相比，r7-19.1细胞优先向表达ccl19的皮下(sc)肿瘤归巢。

在本研究中，在nsg小鼠中在raji-19.5的sc异种移植模型中评价了重复静脉内(iv)施用r7-19.1细胞的抗肿瘤作用，raji-19.5是经工程改造以表达ccl19的raji人伯基特淋巴瘤细胞。不表达ccr7的cd19t-hank细胞([抗cd19-car、cd16.158v、eril-2])用作对照nk细胞系。媒介物对照组也包括在内。

在荷瘤动物的亚群中，两种nk细胞处理均能在抑制肿瘤生长方面显示出明显效果，r7-19.1处理展示出比对照cd19t-hank细胞更强的抑制作用。尽管在两种nk细胞系中均观察到明显的与处理相关的反应，但推测这些反应是与使用相对高剂量的人源细胞有关的小鼠特异性问题。

研究基本原理和目的：体内分布数据显示，iv施用的r7-19.1细胞表现出向表达ccl19的sc肿瘤的归巢增加。在本研究中，在nsg小鼠中在raji-19.5(raji的表达ccl19的亚系)的iv和sc异种移植模型中评价了重复iv施用r7-19.1细胞的抗肿瘤作用。

研究材料

一种或多种供试品：将r7-19.1细胞(克隆物：和cd19t-hank细胞(不表达ccr7的对照nk细胞；克隆物6)用作供试品，而将生长培养基用作媒介物对照。

将r7-19.1细胞在补充有5％热灭活的人ab血清和0.05％普朗尼克(pluronic)f68的生长培养基中培养。

将cd19t-hank细胞在补充有5％热灭活的人ab血清和0.05％普朗尼克f68的生长培养基中培养。

试验系统：在研究中使用在研究开始时(在检疫和适应后)为10-11周龄且在肿瘤移植当天体重为19-28克的30只nod.cg-prkdc^scidil2rg^tmiwjl/szj(nsg)雌性小鼠。供应商是杰克逊实验室(美国缅因州巴尔港大街610号，邮编04609)。使用耳标、笼号和尾标号对动物进行标识。

raji-19.5肿瘤模型(癌细胞系)

细胞培养基：将raji-19.5癌细胞在补充有10％胎牛血清的atcc配制的rpmi-1640改良培养基中培养。

细胞收获：按照南特西部公司的sop_用于体内研究的悬浮癌细胞收集，通过离心收集指数期的raji-19.5细胞(第16代)。然后洗涤细胞并将其重悬于无血清培养基中，之后与等份的matrigel混合以达到2.5×10⁶个细胞/ml的最终浓度。在动物接种之前，将细胞于冰上储存。体内研究中使用的细胞具有97％的活力。

接种：在右胁腹为30只动物单侧接种100μl体积的2.5×10⁵个癌细胞。注射前将皮肤剃光。

实验程序

肿瘤体积测量：sc植入肿瘤后，每周至少两次检查动物的肿瘤形成情况。当肿瘤变得可测量时，每周用数字手持卡尺测量肿瘤体积(tv)，每周两次，并使用以下公式计算：tv＝长度×宽度²/2[长度是肿瘤的最大直径，宽度是肿瘤的最小直径]。根据机构iacuc政策，对肿瘤体积超过2000mm³或具有溃烂性肿瘤的动物实施安乐死，随后进行尸检。如下计算肿瘤生长抑制(tgi)：tgi＝(tc-tt)/δtc×100％，其中tc和tt分别是对照组和处理组在特定时间点的平均肿瘤体积；并且δtc是对照组平均肿瘤体积的变化。

体重：在入组前(在检疫/适应后)，随机分组之前，每次给药的当天(但在给药之前)，每次给药后的第二天以及安乐死之前为动物称重。根据iacuc机构政策，对与基线(第1天)体重相比展示出体重减轻＞20％的动物实施安乐死，随后进行尸检。

临床观察：每天观察动物的死亡率/发病率(g0至g4；参见表5)。对濒死或瘫痪动物实施安乐死，随后进行尸检。

随机分组：当平均肿瘤体积达到190mm³时，将30只小鼠伪随机分为3个研究组，每组10只小鼠，以在各组之间达到相似的肿瘤体积。这被定义为第1天。值得注意的是，由于随机分组时肿瘤大小的较大变异性，每个组含两个亚群：4-5只动物具有大(＞200mm³)肿瘤，5-6只具有小(＜200mm³)肿瘤(参见图17)。

供试品施用：连续4周每周两次(在第1、4、9、12和15天)，通过离心收获在指数期生长的r7-19.1和对照cd19t-hank细胞，并以5×10⁷个细胞/ml的浓度配制在无血清生长培养基中，以通过200μl的注射体积以每只小鼠1×10⁷个细胞的剂量iv施用。所有细胞处理和配制程序均在室温下进行。所有剂量制剂的细胞活力均高于80％。如表5所示，在a组接受媒介物对照的同时，b组和c组分别接受cd19t-hank和r7-19.1细胞。

终点：当动物达到机构iacuc限定的任何上述端点时，对动物实施安乐死。安乐死是经由吸入co2，然后通过颈脱位进行的。根据研究主管的决定，对一些安乐死的动物进行尸检，以鉴定内部器官上可见的肿瘤结节。

表5：研究设计(简略)

biw：每周两次；iacuc：机构动物护理和使用委员会；iv：静脉内；tgi：肿瘤生长抑制。

¹，iacuc限定的肿瘤负荷终点：肿瘤体积超过2000mm³；溃烂性肿瘤；以及肿瘤干扰正常步态。

数据分析

肿瘤体积计算：肿瘤体积＝长度×宽度²/2(长度和宽度分别是肿瘤的最长和最短直径)

肿瘤生长抑制(tgi)计算：tgi＝(tc-tt)/δtc×100％，其中tc和tt分别是对照和处理组在特定实践点的平均肿瘤体积，并且δtc是对照组中平均肿瘤体积的变化。

肿瘤生长和体重曲线的统计分析：通过双因素方差分析(或有缺少值时通过混合效应分析；请参见附录1的修订2)，然后通过tukey检验进行多重比较来分析肿瘤生长和体重曲线。所有统计分析均使用graphpadprism8版进行。p＜0.05被认为是统计学上显著的。

结果

功效：该研究中的主要示值读数是肿瘤生长抑制。具有不同初始肿瘤体积的sc肿瘤可能具有不同发育的脉管系统和ccl19梯度，这些可能会影响供试品向肿瘤的分布。另外，小肿瘤和大肿瘤可以不同的方式对nk细胞处理应答。出于这些原因，单独分析了两个亚群(即大肿瘤和小肿瘤)。

如图18所示，在带有大初始肿瘤的动物亚群中，与媒介物对照相比时，用两种nk细胞系处理均显示出明显的肿瘤生长抑制，其中在第9天由于肿瘤体积超过2000mm³或存在溃烂肿瘤，必须对4只动物中的3只实施安乐死。相反，在nk细胞处理组中，大多数动物存活到第12天或第15天。更重要的是，在第15天，与不表达ccr7的对应物相比，r7-19.1组中的肿瘤生长抑制显然增强，tgi达到35％。这种差异未能达到统计学显著性，可能是由于队列规模较小(cd19t-hank和r7-19.1组的n分别为2和4)。

然而，对于在治疗开始时带有小肿瘤的动物，与媒介物对照相比，或彼此相比时，两种nk细胞疗法均不能有效地抑制肿瘤生长(图19)。这可能归因于以下三个因素：1)小肿瘤的血管系统可能未充分发育，因此对供试品的暴露/可及性较低，从而导致两种nk细胞疗法均无效。2)ccr7介导的趋化性需要趋化因子梯度，而不是仅对趋化因子的存在作出应答。此类ccl19梯度在小肿瘤中可能建立得不够充分，从而导致r7-19.1细胞与cd19t-hank对照之间缺乏可辨性。以及3)在这些已经很小的队列中，肿瘤生长中有一些“离群值”，进一步排除了进行统计分析的可能性。

如图20所示，经nk细胞处理的动物在每次处理施用后通常展示出5％-10％的体重减轻。在大多数情况下，动物能够从细胞注射中恢复过来，并表现出体重恢复，从而在剂量之间引起体重变化曲线的振荡。然而，初始剂量似乎引起了最急性和最严重的反应，并且与临床症状以及体重变化的最长恢复时间相关。此类反应在接受ivnk输注的动物中并不罕见，而且肯定不是r7-19.1细胞特异性的。体重的恢复表明体重减轻是暂时且可逆的。

结论

以1×10⁷个细胞/剂的给药水平对新制备的趋化因子应答性r7-19.1细胞进行iv给药，每周两次，持续4周，在带有大的scraji-19.5肿瘤的动物中导致明显的抑制肿瘤生长，但此类作用未达到统计显著性，这可能是由于队列规模较小。该处理方案在起始肿瘤体积较小的动物中未显示出治疗功效。这可能归因于小肿瘤中肿瘤脉管系统未充分发育和/或趋化因子梯度建立不充分。观察到明显的处理相关反应。然而，这些反应是瞬时的，动物确实显示出恢复的迹象。推测这些反应是与施用相对高剂量的人源nk细胞有关的小鼠特异性问题，因此不可能转化到人类中。

实例9：生产atgfβ/pd-l1car修饰的细胞

将由tgfβrii的细胞外结构域的单链二聚体组成的tgfβ阱克隆到四顺反子质粒载体中，该四顺反子质粒载体还含有pd-l1car、cd16和eril-2转基因(图21)。将四顺反子质粒电穿孔到ank细胞中，以产生经修饰的nk-92细胞。通过il-2缺乏培养基选择经修饰的细胞，因为依赖il-2的未转化ank细胞不能在il-2缺乏培养基中存活。图22显示atgfβ/pd-l1car修饰的细胞共表达高水平的pd-l1car和cd16。

限制性稀释克隆

将多克隆atgfβ/pd-l1t-hank^tm库培养物的等分试样在不添加il-2的生长培养基中稀释至3个细胞/ml的密度。将此细胞悬浮液以每孔200μl的体积等分在96孔板中，这相当于每孔平均0.6个细胞。将板在37℃下孵育10天，然后目视检查细胞生长。挑选克隆物并将其转移到更大的容器中进一步扩增和表征。

生物分析方法

细胞培养：

将多克隆和克隆atgfβ/pd-l1t-hank^tm细胞在补充有5％热灭活的人ab血清且不含il-2的生长培养基中培养。

将ank细胞在补充有5％热灭活的人ab血清和500iu/ml重组人il-2的生长培养基中培养。

将hank细胞在补充有5％热灭活的人ab血清且不含il-2的生长培养基中培养。

将k562和mda-mb-231细胞在补充有10％热灭活的胎牛血清和抗生素/抗真菌剂混合物的rpmi-1640中培养。每2-5天或每当培养基出现黄色时就将k562细胞传代。

将sup-b15^pd-l1+和sup-b15^cd19ko/cd20+细胞在补充有20％热灭活的胎牛血清、55umβ-巯基乙醇和抗生素/抗真菌剂混合物的rpmi-1640中培养。另外如以上的k562细胞那样将细胞传代。

用于流式细胞术分析的抗体染色：

通过离心收集细胞，在facs缓冲液(5％fbs在1xd-pbs中的溶液)中洗涤两次，并重悬于1mlfacs缓冲液中。为进行表面蛋白的直接荧光团缀合的抗体染色，将细胞与适当的缀合抗体(或同种型对照)在4℃下在黑暗中一起孵育20分钟，然后用facs缓冲液洗涤两次。为了检测car蛋白，将细胞与生物素化的抗f(ab′)2片段抗体一起孵育，随后与链霉亲和素-apc抗体一起孵育。在macsquant流式细胞仪上分析样品。

细胞毒性：

通过将细胞培养物上下移液使悬浮生长的细胞系再悬浮。通过自动计数(台盼蓝排除法)测定细胞活力。用cfse染料标记靶细胞，并在补充有10％热灭活的fbs和抗生素/抗真菌剂的rpmi-1640中将靶细胞和效应细胞稀释至所需的细胞浓度。将效应细胞和靶细胞以不同的效应子与靶标(e∶t为20∶1、10∶1、5∶1、2.5∶1、1.25∶1、0.62∶1、0.31∶1和0.15∶1)比率在96孔板中混合，并在5％co2气氛和37℃下的培养箱中共孵育4h。然后添加pi以对死细胞进行荧光标记，并在macsquant流式细胞术装置上分析该测定。

adcc：

通过将细胞培养物上下移液使悬浮生长的细胞系再悬浮。通过自动计数(台盼蓝排除法)测定细胞活力。用pkh67-gl染料标记靶细胞，并在补充有10％热灭活的fbs和抗生素/抗真菌剂的rpmi-1640中将靶细胞和效应细胞稀释至所需的细胞浓度。在室温下将靶细胞与单克隆抗体曲妥珠单抗、利妥昔单抗一起或无抗体预孵育30min。然后将抗体标记的靶细胞(和无抗体对照)和效应细胞以不同的效应子与靶标比率(e∶t为20∶1、10∶1、5∶1、2.5∶1、1.25∶1、0.62∶1、0.31∶1和0.15∶1)在96孔板中混合，并在5％co2气氛和37℃下的培养箱中共孵育4h。然后添加pi以对死细胞进行荧光标记，并在macsquant流式细胞术装置上分析该测定。

对由atgfβ/pd-l1t-hank细胞分泌的tgfβ阱的定量

通过在500xg下5min的第一离心步骤去除细胞，随后通过2000xg下5min的第二离心步骤去除细胞碎片来制备用于分析的样品上清液。将样品上清液在-80℃下冷冻直至分析。将来自500xg离心步骤的细胞沉淀重新悬浮，一式三份地汇集并记录细胞密度。使用人tgfβriielisa检测试剂盒，根据制造商的说明测量样品上清液中的tgfβ阱浓度，并与提供的标准品比较。将tgfβ阱浓度对细胞数目进行归一化，并表示为pg/ml/10⁶个细胞。图23显示，所有atgfβpd-l1t-hank克隆物均分泌了大量的tgfβ阱(在～6至～13ng/ml/10⁶个细胞之间)。

atgfβ/pd-l1t-hank^tm细胞对靶细胞系的细胞毒性

atgfβ/pd-l1t-hank^tm细胞的细胞毒性通过将其与靶细胞k562细胞、sup-b15^pd-l1+细胞和mda-mb-231细胞一起孵育来分析。图24显示在杀伤k562细胞(靶细胞)时，atgfβ/pd-l1t-hank^tm细胞维持与亲本ank细胞同等的细胞毒性。

图25显示atgfβ/pd-l1t-hank^tm细胞展示对ank^tm抗性、pd-l1阳性的sup-b15细胞系的特异性杀伤增强-在效应子与靶标比率为8时，相对于仅约10％的细胞被ank细胞杀伤，约70％的细胞被atgfβ/pd-l1t-hank^tm细胞杀伤。

图26显示atgfβ/pd-l1t-hank^tm细胞展示对mda-mb-231细胞系的特异性杀伤增强-在效应子与靶标比率为8时，相对于仅约40％的细胞被ank细胞杀伤，约90％的细胞被atgfβ/pd-l1t-hank^tm细胞杀伤。

图27显示atgfβ/pd-l1t-hank^tm细胞与抗cd20利妥昔单抗单克隆抗体或抗her2-neu曲妥珠单抗单克隆抗体组合对sup-b15^cd19ko/cd20+细胞(cd19-、cd20+、her2-neu-、nk抗性)的adcc活性。在4h的细胞毒性测定中，当与抗cd20抗体利妥昔单抗组合时，atgfβ/pd-l1t-hank细胞能够有效靶向并杀伤抗性sup-b15^cd19ko/cd20+。当与抗her2/neu对照抗体曲妥珠单抗组合时，和atgfβ/pd-l1t-hank^tm克隆物均无法杀伤靶sup-b15^cd19ko/cd20+细胞。

实例10：经修饰的细胞分泌的tgfβ阱抑制tgfβ活性

荧光素酶报告基因的tgfβ应答元件(smad结合启动子)直接表达的工程化hek293细胞在用tgfβ处理时，显示出荧光素酶活性呈剂量依赖性增加(图28)。

图29显示，通过与atgfβ/pd-l1t-hank细胞的培养上清液共孵育可以抑制hek293报告细胞中tgfβ对荧光素酶活性的诱导，而来自hank对照细胞的培养上清液对荧光素酶活性的影响有限。

实例11：经修饰的细胞产生il-12

用编码呈单链多肽形式的功能性il-12p70二聚体的p35-p40方向或p40-p35方向的慢病毒构建体转导nk-92细胞(图30)。新霉素选择后，经转导的nk-92细胞能够分泌可检测水平的p70il-12。在il-12二聚体的c末端添加2a肽不会影响蛋白质的分泌。

il-12/pd-l1car修饰的细胞的产生

将il-12的单链二聚体(scil-12p70)克隆到四顺反子质粒载体中，该四顺反子质粒载体还含有pd-l1car、cd16和eril-2转基因。将四顺反子质粒(图31)电穿孔到ank细胞中，以产生经修饰的nk-92细胞。通过il-2缺乏培养基选择经修饰的细胞，因为依赖il-2的未转化ank细胞不能在il-2缺乏培养基中存活。图33显示il-12/pd-l1car修饰的细胞能够分泌大量的scil-12p70细胞因子。

应了解本文所述的实例和实施例仅出于说明的目的，并且将对本领域技术人员建议鉴于此的各种修改或变化且包括在本申请案的精神和范围内及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、序列登录号、专利和专利申请均据此通过援引整体并入以用于所有目的。

对于本领域技术人员应当清楚的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外的更多修改是可能的。因此，本发明主题仅受限于所附权利要求的范围。此外，在解释本说明书和权利要求时，所有术语都应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式来解释。具体而言，术语“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应当解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，表明所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或利用、或组合。在本说明书的权利要求提及选自由a、b、c......和n组成的组的某物中的至少一种的情况下，该文本应当被解释为仅需要该组中的一种要素，而不是a加n或b加n等。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种经修饰的nk-92细胞，该经修饰的nk-92细胞包含与启动子可操作地连接的编码归巢受体的核酸，并且进一步包含与启动子可操作地连接的编码抗原结合蛋白的核酸，其中该抗原结合蛋白包含嵌合抗原受体(car)，并且其中该car特异性结合cd19，或具有与seqidno：25具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的经修饰的nk-92细胞，其中该归巢受体是g蛋白偶联受体(gpcr)、趋化因子受体、细胞因子受体、细胞粘附分子、选择素或整合素。

3.如权利要求2所述的经修饰的nk-92细胞，其中该趋化因子受体选自ccr7、cxcr2、或cxcl14受体，并且该细胞粘附分子选自l-选择素(cd62l)、α4β7整合素、lpam-1和lfa-1。

4.如权利要求3所述的经修饰的nk-92细胞，其中编码ccr7的核酸与seqidno：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

5.取消

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8.取消

9.取消

10.如权利要求1-3中任一项所述的经修饰的nk-92细胞，其中该经修饰的nk-92细胞进一步包含与启动子可操作地连接的编码细胞因子的核酸。

11.如权利要求10所述的经修饰的nk-92细胞，其中该细胞因子是il-2、eril-2、il-15、eril-15或它们的组合。

12.如权利要求10所述的经修饰的nk-92细胞，其中该细胞因子是eril-2，并且编码eril-2的核酸与seqidno：14具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

13.如权利要求10所述的经修饰的nk-92细胞，其中该细胞因子是eril-15，并且编码eril-15的核酸与seqidno：67具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

14.如权利要求1-3和10-13中任一项所述的经修饰的nk-92细胞，其中该经修饰的nk-92细胞进一步包含与启动子可操作地连接的编码fc受体的核酸。

15.如权利要求14所述的经修饰的nk-92细胞，其中该fc受体是cd16或高亲和力cd16(seqidno：12)，或是与seqidno：13具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸。

16.如权利要求1-3和10-15中任一项所述的经修饰的nk-92细胞，其中该归巢受体、抗原结合蛋白、car和/或fc受体在该经修饰的nk-92细胞的细胞表面上表达。

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32.一种产生经修饰的nk92细胞系的方法，该方法包括在特定基因座处的靶向同源重组，其中该基因座是aavs1，并且其中该aavs1基因座与seqidno：7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

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58.一种经修饰的nk-92细胞，该经修饰的nk-92细胞包含与启动子可操作地连接的编码转化生长因子(tgf)-β阱和嵌合抗原受体(car)的核酸，该嵌合抗原受体特异性结合程序性细胞死亡1配体1(pd-l1)。

59.如权利要求58所述的经修饰的nk-92细胞，其中该经修饰的nk-92细胞进一步包含与启动子可操作地连接的编码c-x-c趋化因子受体4型(cxcr4)或抗原结合蛋白的核酸，并且其中该抗原结合蛋白特异性结合肿瘤相关抗原。

60.如权利要求59所述的经修饰的nk-92细胞，其中该肿瘤相关抗原选自cd19、cd20、nkg2d配体、cs1、gd2、cd138、epcam、her-2、ebna3c、gpa7、cd244、ca-125、muc-1、eta、mage、cea、cd52、cd30、muc5ac、c-met、egfr、fap、wt-1、psma、ny-eso1、cspg-4、igf1-r、flt-3、cd276、cd123、bcma、cd33、b7-h4或4-1bb。

61.如权利要求59所述的经修饰的nk-92细胞，其中该抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(car)的一部分。

62.如权利要求58所述的经修饰的nk-92细胞，其中该经修饰的nk-92细胞进一步包含与启动子可操作地连接的编码细胞因子的核酸。

63.如权利要求62所述的经修饰的nk-92细胞，其中该细胞因子是il-2、eril-2、il-15、eril-15、il-12或它们的组合。

64.如权利要求62所述的经修饰的nk-92细胞，其中该细胞因子是eril-2。

65.如权利要求58所述的经修饰的nk-92细胞，其中该经修饰的nk-92细胞进一步包含与启动子可操作地连接的编码fc受体的核酸。

66.如权利要求65所述的经修饰的nk-92细胞，其中该fc受体是具有seqidno：12的序列的cd16或高亲和力cd16，或是与seqidno：13具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸。

67.如权利要求58所述的经修饰的nk-92细胞，其中该tgf-β阱包含tgf-β受体ii胞外域的单链二聚体。

68.如权利要求58所述的经修饰的nk-92细胞，其中特异性结合该pd-l1的该car由与seqidno：68具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸编码。

说明或声明(按照条约第19条的修改)

根据第19条第1款的声明

对权利要求1进行了修改以符合权利要求9，审查机构认为权利要求9具有新颖性、创造性和工业实用性。类似地，对权利要求32进行了修改以符合权利要求34，审查机构认为权利要求34具有新颖性、创造性和工业实用性。因此，选定的从属权利要求被取消或修改以反映适当的从属关系。

独立权利要求17-20、21、22、23、24、28、3、48、49、50、51、52和56及其所有从属权利要求被取消，因此对这些权利要求的驳回无实际意义。

新的权利要求58-68规定：经修饰的nk-92细胞包含与启动子可操作地连接的编码转化生长因子(tgf)-β阱和嵌合抗原受体(car)的核酸，该嵌合抗原受体特异性结合程序性细胞死亡1配体1(pd-l1)，这既没有在现有技术中传授也没有暗示。

至少基于以上内容和本文的修改，申请人相信所有未决的权利要求均满足pct细则的所有要求。

结论

权利要求1-4、10-16、32和58-68在本申请中未决。申请人请求准许所有未决的权利要求。