本申请依据35u.s.c§119(e)要求2018年10月15日提交的美国申请第62/745,805号的优先权，该申请援引加入本文。本公开涉及用于治疗由纳屈酮改善的疾病的纳屈酮缓释微粒递送系统。注射用微粒递送系统包含包封在生物降解性微粒中的纳屈酮，其在药学可接受的溶媒(vehicle)中给药。
背景技术：
：：药物滥用是在整个社会中仍然普遍存在的疾病。阿片类药物滥用问题通常被认为是1960年代和1970年代海洛因流行期间的内城问题，其在全国各地变得越来越普遍，从内城传播到农村社区。在过去几十年中，药物滥用者的数量急剧增加，特别是就阿片类药物，包括药物制剂和违禁的街头药物而言。虽然纳屈酮每日口服给药是有效的，但其主要问题是依从性非常低或不依从。已证明每月给药的要求在治疗开始60天后具有高流失率(25-36％)[garbutt等人，efficacyandtolerabilityoflong-actinginjectablenaltrexoneforalcoholdependence；arandomizedcontrolledtrial.jama.293(13):1617-1625,2005；hulseimprovingclinicaloutcomesfornaltrexoneasamanagementofproblemalcoholuse.br.j.clin.pharmacol.76(5)632-641,2013]。因此，更长效纳屈酮制剂有望改善患者依从性，减少复发，并产生更稳定的随时间推移的患者结局。已经表征了多种缓释纳屈酮载药微粒。ehrich(us7,919,499,naltrexonelongactingformulationandmethodsofuse)和brittain等人(us7,279,579b2,polymorphicformsofnaltrexone)教导了聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)中的纳屈酮长效制剂，其包含约310mg至约480mg的持续约4周的释放纳屈酮。tice等人(us6,306,425b1,injectablenaltrexonemicrospherecompositionsandtheiruseinreducingconsumptionofheroinandalcohol)教导了在聚(d,l-丙交酯)(pdll)基质中的注射用缓释纳屈酮制剂，其在4周时间内每周释放初始纳屈酮量的约10-40％。nuwayser(us7,157,102b1,muli-layeredmicrocapsulesandmethodofpreparingsame)教导了1个月递送的具有高纳屈酮载药量(>40％w/w)的多层微胶囊。所有公开的基于纳屈酮的微粒制剂均显示出约4周或1个月的最大释放曲线。因此，本领域需要制备用于递送超过4周或1个月的长效微粒制剂。已经开发了基于缓释纳屈酮植入物的长效递送系统，其递送超过4周或1个月。kuo和kuzma(us8,343,528,longtermdrugdeliverydeviceswithpolyurethanebasedpolymersandtheirmanufacture)、saxena和saxena(wo/2017/033208,implantablenaltrexonetablets)以及o'neil和liu(us7,914,804,slowreleasepharmaceuticalpreparationandmethodofadministeringthesame)均公开了基于长效纳屈酮植入物的递送系统。这些基于植入物的制剂通常需要门诊外科手术来放置植入物。虽然在某些情况下，这些系统可以显示出比基于微粒的纳屈酮制剂更长的释放曲线，但所需的外科手术和患者自我移除的风险可能超过获益。(alkermes,inc)当前用于预防阿片类药物解毒约7-10天后阿片类药物依赖的复发。推荐剂量为380mg肌内递送，每4周一次或每月一次。注射液由悬浮在稀释剂(水性溶媒)中的聚合物微粒组成，其使用20号(g)针头来注射。需要20g针头的原因是注射为臀部的肌内注射，微粒和稀释剂的量，以及最后是微粒粒度和粒度分布。据报道，微粒的d50,volume为108.49μm且d50,population为58.46μm(andhariya等人，acceleratedinvitroreleasetestingmethodofnaltrexoneloadedplgamicrospheresint.j.pharm.520(1-2)79-85,2017)，其中d50,volume是50体积％颗粒的直径大于108.49μm，而50体积％颗粒的直径小于108.49μm。d50,population值为58.46表明50数量％颗粒的直径大于58.46μm，而50数量％颗粒的直径小于58.46μm。因此，在现有技术中需要制备具有较小微粒粒度的纳屈酮负载的微粒，以便为给药目的而给患者提供较小的针头直径或较高规格的针头。在两例患者中，已证明血清纳屈酮水平为2.8ng/ml足以阻断高达500mg的纯二乙酰吗啡的剂量(c.brewer.serumnaltrexoneand6-beta-naltrexollevelsfromnaltrexoneimplantscanblockverylargeamountsofheroin:areportoftwocases.addict.biol.,7:321-323,2002)，2.4ng/ml完全拮抗25mg海洛因(verebey等人，naltrexone:disposition,metabolism,andeffectsafteracuteandchronicdosing.clin.pharmacol.ther.,20:315-328,1976)，且1-2ng/ml的水平已经足以提供对致死性阿片类药物过量的保护(hulse等人，reducinghospitalpresentationsforopioidoverdoseinpatientstreatedwithsustainedreleasenaltrexoneimplants.drugalcoholdepend.,79:351-357,2005和comer等人，depotnaltrexone:long-lastingantagonismoftheeffectsofheroininhumans.psychopharmacology,159:351-360,2002)。在小规模研究中，在第二次注射前，平均血浆纳屈酮谷浓度为1.23ng/ml(±0.83ng/ml)，并且在研究的剩余时间内保持相对恒定；平均纳屈酮谷浓度为1.33ng/ml(±1.74ng/ml)(johnson等人，apilotevaluationofthesafetyandtolerabilityofrepeatdoseadministrationoflong-actinginjectablenaltrexoneinpatientswithalcoholdependence.alcoholclinexpres.28:1356-1361,2004)。在大鼠模型中，于“吗啡诱导镇痛热板测试”中，证明血浆纳屈酮浓度为约1-2ng/ml有效的(thepreclinicaldevelopmentofmedisorbnaltrexone,aonceamonthlong-actinginjectionforthetreatmentofalcoholdependence.frontiersinbioscience10:643-655,2005)。因此，在现有技术中，需要提供快速治疗水平的纳屈酮，其具有最小的初始突释和最小化的最大浓度，从而提供更稳定的治疗性纳屈酮水平，以持续超过1个月，并且作为注射用形式的剂型。较低的纳屈酮剂量，称为低剂量纳屈酮(ldn)(每日口服1至5mg)、极低剂量纳屈酮(vldn)(1mg至1mg)和超低剂量纳屈酮(uldn)(小于1mg)显示与每日口服的经典处方剂量50mg不同的药效学应答(toljan和vrooman,low-dosenaltrexone(ldn)-reviewoftherapeuticutilization,medsci.6,82,2018)。ldn作为神经胶质调节剂，对诸如纤维肌痛、克罗恩病、多发性硬化、复杂区域疼痛综合征和癌症的病症提供潜在益处。uldn机制似乎与对阿片类药物的双峰细胞应答有关，阿片类药物已用于术后镇痛控制，减少阿片类药物的总量。因此，在现有技术中需要提供稳定治疗浓度的低剂量纳屈酮水平(如ldn、vldn、uldn等)。对具有理想性质的制剂施加了许多限制：药物的释放必须在较长时间内发生，载药量必须足够，聚合物基质必须具有生物降解性和生物相容性，残留化学品和溶剂应低于最大可接受水平，且微球必须足够小并且能够通过患者友好的针头等。微粒的理化性质对药物性质、聚合物基质性质、释放改性剂性质以及微粒制备所遵循的加工步骤敏感。关于如何以微粒形式包封化合物，已经公开了多种方法。在这些方法中，通常使用搅拌器、均质机或其他动态混合元件使药物或其他活性化合物在溶剂(通常是有机溶剂)中溶解、分散或乳化，以形成含基质材料的溶液。然后在萃取和/或额外的清洗步骤期间，从药物基质材料中除去有机溶剂，之后获得微粒产物。微粒制备中使用的许多参数影响所得微粒的性质。本领域中中需要微粒的制备方法，所述微粒可以释放纳屈酮超过一个月。本公开(其描述详见下文)解决了对提供超过一个月的纳屈酮释放的制剂的需求。附图说明图1显示说明用于制备微粒的方法的一个实施方案的流程图。图2示出来自实施例1的制剂的体内外释放曲线(图2a)和体内药代动力学曲线(图2b)。图3示出来自实施例5的载药量范围为37-40％(w/w)的制剂的纳屈酮体外释放。图4示出在实施例12中表10的制剂12-3(图4a)、12-4(图4b)、12-5(图4c)和12-7(图4d)的体内药代动力学曲线。具体实施方式本公开涉及持续时间超过一个月的注射用控释(或缓释)纳屈酮微粒制剂，其包含纳屈酮和生物降解性聚合物如聚(丙交酯-共-乙交酯)，也称为聚(乳酸-共-羟基乙酸)(plga)。微粒(微球)可以容易地皮下或肌内注射。更具体地，本公开涉及用于制备具有持续超过4周，优选约8周至约12周，更优选至多100天的独特纳屈酮释放曲线的注射用微粒的方法。通过水包油乳液的溶剂萃取/蒸发来制备微粒，分散的油相是通过使用有机溶剂形成的溶液，其主要包含纳屈酮和生物降解性生物相容性聚合物。详细描述本公开的实施方案，包括某些优选和任选的实施方案，以便可以更充分地了解和理解本公开的各个方面。本文公开了注射用纳屈酮微粒制剂，其提供活性药物控释超过4周，尤其是约8周至约12周(或100天)。可以通过喷雾干燥、基于乳液的技术、挤出、基于微制造的技术、凝聚和制备具有控释性质的药物-聚合物微粒的其他方法来制备长效制剂。在一个实施方案中，提供用于形成用作控释递送系统的微粒的方法。用于制备注射用微粒制剂的方法包括：(a)混合第一相和第二相以制备混合物，所述第一相包含聚乙烯醇(pva)和第一溶剂，并且所述第二相包含生物降解性聚合物、纳屈酮和第二溶剂；和(b)用水或水溶液对所述混合物进行萃取过程以获得微粒。优选地，所述方法包括在萃取过程后对微粒的干燥过程。在另一实施方案中，所述方法任选地包括(c)在(b)进行萃取过程后，使用乙醇水溶液对所述微粒进行进一步的萃取过程。当所述方法包括进一步萃取过程时，在进一步萃取过程之前和/或之后对微粒进行干燥过程。例如，在(b)进行萃取过程后，在(c)进行进一步萃取过程后，或者在(b)和(c)每项后进行颗粒的干燥。参考图1详细描述根据本发明的实施方案的方法。在本公开中，使用术语“第一”或“第二”仅是为了更方便地解释本公开，但这些术语并不代表或暗示它们之间存在特定的顺序或重要性程度。此外，在整个本公开中，单数形式的表达也包括复数意义，除非在上下文中明确存在差异。第一相和第二相的混合以任何顺序进行。在一个方面，但不限于此，可以将第一相加入第二相的顶部，然后混合以制备混合物。该过程可以是乳化，且混合物是聚合物、纳屈酮和一种或多种溶剂的水包油乳液。通过本公开的后续过程，混合物(乳液)中的油颗粒变成微粒。混合可以是形成所需粒度范围的微粒的过程，这可以取决于混合条件如转速、功率等。在本公开中，第一相也可以称为连续相。第一相包含聚乙烯醇和第一溶剂，其中第一溶剂包含选自水、二氯甲烷(dcm)、苯甲醇(ba)和乙酸乙酯(ea)中的至少一种。在一个方面，第一溶剂必须包含水。例如，第一溶剂可以是水，且可以通过向水中加入pva来形成第一相。在另一方面，第一溶剂可以进一步包含有机溶剂，其是选自二氯甲烷、苯甲醇和乙酸乙酯中的至少一种。当第一溶剂包含水和一种或多种有机溶剂时，在制备第一相时，有机溶剂可以与聚乙烯醇和水混合在一起。在其他方面，当第一溶剂包含水和一种或多种有机溶剂时，在制备第一相时，可以在将聚乙烯醇和水混合后立即将有机溶剂与包含聚乙烯醇和水的溶液混合。在另一方面，当第一溶剂包含水和一种或多种有机溶剂时，可以将有机溶剂与包含聚乙烯醇和水的溶液混合，然后立即将第一相与第二相混合。优选地，可以将一种或多种有机溶剂与包含聚乙烯醇和水的溶液混合，然后立即与第二相混合。在一个方面，连续相(第一相)包含在水中约0.1-5％(w/v)的聚乙烯醇(pva)。在另一方面，连续相可以进一步包含0-1.8％(w/v)的二氯甲烷(dcm)和/或0-3.3％(w/v)的苯甲醇。在本公开中，第二相也可以称为有机相。第二相包含生物降解性聚合物、纳屈酮和第二溶剂，其中第二溶剂包含选自二氯甲烷、苯甲醇和乙酸乙酯中的至少一种。在一个方面，第二溶剂包含二氯甲烷和苯甲醇、乙酸乙酯或其组合。在另一方面，对于微粒的制备，第二相包含溶于有机溶剂如二氯甲烷(dcm)(也称为亚甲基氯)中的约1-40％(w/w)的生物降解性聚合物和溶于另一有机溶剂如苯甲醇中的1-50％(w/w)的纳屈酮。在该方法中，纳屈酮可以以游离碱、盐、溶剂化物、共晶或其组合的形式使用。生物相容性、生物降解性聚合物可以是均聚物、共聚物或三元共聚物或通过诸如酯基的基团连接的重复单体单元。聚合物可以是聚酯，其可以由约一个或多个羟基羧酸残基组成，其中单元的分布可以是无规的、嵌段的、成对的或顺序分布的。当生物降解性聚合物是聚酯时，聚酯包括聚丙交酯、聚乙交酯和plga。在一个方面，生物降解性聚合物是聚丙交酯、plga或其组合。优选地，合适的生物降解性聚酯具有50:50至100:0，优选65:35至90:10，更优选75:25至85:15的丙交酯:乙交酯(l:g)(摩尔)比。优选地，合适的生物降解性聚酯是60:40至95:5的plga。更优选地，合适的生物降解性聚酯是70:30至90:10的plga。甚至更优选地，合适的生物降解性聚酯是75:25至85:15的plga。最优选地，合适的生物降解性聚酯是85:15的plga。在一个方面，生物降解性聚合物的平均分子量为50,000至150,000道尔顿。对混合物(乳液)进行适当的溶剂萃取过程以获得微粒，最终将溶剂水平降低至可接受水平。本公开中的术语“萃取(extract，extracting和extraction)”是指将包含聚乙烯醇、生物降解性聚合物、纳屈酮和一种或多种溶剂的混合物或乳液与萃取相接触。在溶剂萃取过程中，从混合物(乳液)的油颗粒中去除一种或多种有机溶剂，从而得到包含聚合物和纳屈酮的微粒。溶剂萃取过程包括至少一个萃取过程。萃取过程(首先)使用萃取相对混合物(乳液)进行，以获得微粒，其中萃取相为水或水溶液。水溶液可以包含选自聚乙烯醇、二氯甲烷、苯甲醇和乙酸乙酯中的至少一种。优选地，萃取相可以是含0-3％(w/v)的选自聚乙烯醇、二氯甲烷、苯甲醇和乙酸乙酯中的至少一种的水。更优选地，萃取相可以是含0-2％(w/v)聚乙烯醇、0-1.8％(w/v)二氯甲烷、0-2％(w/v)苯甲醇或0-3％(w/v)乙酸乙酯的水。当溶剂萃取过程包括两个萃取过程时，可以使用乙醇水溶液(在本公开中也称为乙醇萃取相或乙醇溶液)对微粒进行进一步的萃取过程(第二)。乙醇萃取相是约1-50％(v/v)乙醇的水溶液。每各萃取过程的温度范围可以为4-30℃。优选地，第一(水)萃取过程可以在约4至10℃的温度范围内进行。优选地，第二(乙醇)萃取过程可以在约20至30℃的温度范围内进行。萃取时间范围可以为2至8小时。在一个方面，在进行溶剂萃取过程后，任选地对微粒进行干燥。干燥可以是在约4-30℃的温度范围内真空下进行，也可以是其他干燥过程如冻干。当溶剂萃取过程包括两个萃取过程时，任选在两个萃取过程之间进行进一步的干燥过程。中间干燥可以在约4-30℃的温度范围内真空下进行。在每个干燥过程之前，该方法包括从混合物(乳液)、溶液、分散体等中收集微粒的收集过程。使用具有多种孔径的筛网进行收集过程。筛网孔径范围为10-200μm。该方法也可以任选地包括溶剂萃取过程后的清洗过程。当该方法包括收集过程时，清洗过程可以在收集后但在干燥前进行。在本公开中，清洗过程可以是除去残留物如溶剂、未反应物质等的过程。在一个实施方案中，提供了注射用微粒制剂。在一个方面，注射用微粒制剂根据本发明的方法制备。本公开的注射用微粒制剂包含含有纳屈酮和生物降解性聚合物的微粒。微粒具有纳屈酮的缓释曲线。在一个方面，纳屈酮的缓释长于4周并至多100天。在另一方面，纳屈酮的缓释为约8周至12周。微粒包含约20-40％(w/w)的纳屈酮。纳屈酮可以是游离碱、盐、溶剂化物、共晶或其组合的形式。生物降解性聚合物包括聚丙交酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)或其组合。优选地，生物降解性聚合物的丙交酯:乙交酯(l:g)(摩尔)比可以是50:50至100:0，优选65:35至90:10，更优选75:25至85:15。生物降解性聚合物的分子量可以是50,000道尔顿至150,000道尔顿。在优选的实施方案中，注射用纳屈酮微粒包含在85:15的plga中的纳屈酮，plga的分子量为至少50,000道尔顿，如以下实施例中所述的那些。优选地，plga的分子量是50,000道尔顿至150,000道尔顿。在优选的实施方案中，纳屈酮在长效制剂中的存在量为至少约20重量％，优选至少约30重量％，更优选至少约35重量％，如制剂总重量的约40重量％的纳屈酮。在一个方面，纳屈酮在长效制剂中的存在量为约20-40％(w/w)。微粒可以制备为在适于使用小于20g的针头皮下和/或肌内注射的粒度分布范围内。可以控制微粒直径、形状、形态和孔隙率，从而控制释放特征并允许通过注射器和针头。纳屈酮负载微粒的粒度分布范围可以为1至200μm。更优选地，粒度分布范围可以为约10-125μm。甚至更优选地，粒度分布范围可以为约25-100μm。在一个方面，微粒的平均粒度范围为25至125μm。在一个实施方案中，提供了注射生物降解性微粒的方法。该方法包括在可接受的(生物相容性)溶媒中注射包含生物降解性微粒的流动组合物。可接受的(生物相容性)溶媒包括水基溶媒、油基溶媒或其组合。优选地，可接受的溶媒是水基系统。水基系统包含张度剂如氯化钠，粘度增强剂如羧甲基纤维素钠，润湿剂如聚山梨酯，或其组合。在一个方面，水基系统可以由润湿剂如聚山梨酯20和粘度增强剂如羧甲基纤维素钠、透明质酸等组成。另一种可接受的溶媒可以是油基溶媒，其也可以作为吸水速率限制器和/或扩散屏障，从而通过限制初始释放或降低稳态速率而改变释放速率。生物相容性油溶媒包括花生油、蓖麻油、芝麻油、葵花油、大豆油、玉米油、棉籽油或其任何组合。在一个方面，适当的可接受的溶媒可以是水基溶媒和油基溶媒的组合。微粒可以皮下或肌内给药。在一个实施方案中，控释制剂为个体提供治疗有效量的纳屈酮，持续至少4周，优选至少6周，更优选至少8周或更多周的时间。在一个优选的实施方案中，使用与vivitrol中相同剂量的纳屈酮(380mg纳屈酮)的作用持续时间提供治疗有效量的纳屈酮，持续大于4周，优选6周，更优选8周，并且甚至更优选12周。在一个实施方案中，提供了通过纳屈酮或代谢物治疗或预防与阿片类药物滥用或用药过量、酒精依赖或疼痛相关疾病的方法。该方法包括对需要此类治疗或预防的患者(个体)给药有效量的包含纳屈酮的微粒、包含该微粒的微粒制剂或者包含该微粒或微粒制剂的组合物。在另一实施方案中，提供了包含注射用微粒制剂的组合物。该组合物可以包含生物相容性溶媒，其中所述生物相容性溶媒包括水基溶媒、油基溶媒或两者兼有。在一个方面，将组合物配制为注射剂。在一个实施方案中，提供了包含注射用微粒制剂的组合物，其用于治疗或预防与阿片类药物滥用或用药过量、酒精依赖或疼痛相关的疾病。该组合物可以包含生物相容性溶媒，其中所述生物相容性溶媒包括水基溶媒、油基溶媒或两者兼有。在一个方面，将组合物配制为注射剂。在其他实施方案中，提供了注射用微粒制剂用于治疗或预防与阿片类药物滥用或用药过量、酒精依赖或疼痛相关疾病的用途。在另一实施方案中，提供了注射用微粒制剂在制备用于治疗或预防与阿片类药物滥用或用药过量、酒精依赖或疼痛相关疾病的药物中的用途。释放曲线可以因l:g比、分子量、末端基团以及生物降解性、生物相容性plga聚合物的多分散性、残留溶剂含量、生产方法等因素而变。其次，释放曲线可以在体外和体内条件之间由于诸如体外和体内实验之间的温差、释放介质与间质液的差异和/或用于给药的溶媒的因素而变。通过提供释放能力超过4周，尤其是约8至12周(或100天)的微粒，个体会接受更少的注射，并且需要更少次拜访医生办公室。本公开的微粒显示纳屈酮在体内和体外条件下的示例性缓释。为了提供更好的患者依从性，可以改变微粒的粒度和/或纳屈酮的量。通过说明的方式提供以下实施例，且不应通过限制的方式进行解读。实施例实施例1plga75:25处理的影响通过称量40g聚乙烯醇(pva)(mowiol40-88,sigmaaldrich,st.louis,mo)并与4l去离子水混合来制备连续相。有机相由置于20ml闪烁瓶中的溶于1.333g二氯甲烷(dcm)(fisherscientific,fairlawn,nj)和623mg苯甲醇(fisherscientific,fairlawn,nj)的500mgplga75:25(resomerrg756s)和267mg纳屈酮游离碱(tecolandcorporation,irvine,ca)组成，或者由置于20ml闪烁瓶中的溶于1.333g二氯甲烷(dcm)(fisherscientific,fairlawn,nj)和623mg苯甲醇(fisherscientific,fairlawn,nj)的500mgplga75:25(resomerrg756s)和294mg纳屈酮游离碱(tecolandcorporation,irvine,ca)组成。将10ml连续相加入有机相顶部，并使用配备s25n-10g发生器的ikat25均质机(ikaworks,inc.wilmington,nc)以7,000rpm均质化60秒。然后将混合物转移至萃取相中，萃取相为380ml1％(w/v)pva水溶液，并在4℃下搅拌8h。然后用25μm筛网收集微粒。筛网保留的产物在22℃下脱水15min，并真空干燥约16h。然后将微粒在200ml25％(v/v)乙醇溶液中于22℃下悬浮并清洗8h，以除去微粒中的乳化剂(pva)和任何残留溶剂。然后将清洗后的微粒收集在25μm筛网上，并真空干燥48h。在sprague-dawley大鼠的药代动力学研究中，在38mg/kg剂量下评价这两种制剂。所得载药量和残留苯甲醇含量如表1所示。两种制剂均提供约90％的包封效率，但释放仅约4-5周，载药量越高，动力学越快。图2显示f.1-1的a级体外-体内相关性，而体外试验预测的体内应答快于就f.1-2所观察到的。表1.实施例1的制剂总结载药量(％w/w)表示微粒中所含纳屈酮的量，而ee(％)表示与制备微粒时的起始纳屈酮相比最终剩余纳屈酮的量。实施例2plga75:25分子量和供应商的影响通过称量40g聚乙烯醇(pva)(mowiol40-88,sigmaaldrich,st.louis,mo)并与4l去离子水混合来制备连续相。有机相由置于20ml闪烁瓶中的溶于1.333g二氯甲烷(dcm)(fisherscientific,fairlawn,nj)和623mg苯甲醇(fisherscientific,fairlawn,nj)的500mgplga75:25和267mg纳屈酮游离碱(tecolandcorporation,irvine,ca)组成。将10ml连续相加入有机相顶部，并使用配备s25n-10g发生器的ikat25均质机(ikaworks,inc.wilmington,nc)以7,000rpm均质化60秒。然后将混合物转移至萃取相中，萃取相为380ml去离子水，并在4℃下搅拌8h。然后用25μm筛网收集微粒。筛网保留的产物在22℃下脱水15min，并真空干燥约16h。然后将微粒在200ml25％(v/v)乙醇溶液中于22℃下悬浮并清洗8h，以除去微粒中的乳化剂(pva)和任何残留溶剂。然后将清洗后的微粒收集在25μm筛网上，并真空干燥48h。所得载药量和残留苯甲醇含量如表2所示。resomerrg750和756的载药量和释放曲线相似，可能是由于比浓对数粘度(inherentviscosity)相似，rg750的范围更宽。具有几乎相似比浓对数粘度规范的resomerrg755和lactelb6007-1也导致相似的载药量和释放曲线。虽然导致的载药量与检测的其他plga相似，但lactelb6007-2导致的释放曲线动力学更快。制剂f.2-1至f.2-5提供约30-35天的药物释放曲线。表2.使用75:25plga制备的制剂的制剂总结实施例3纳屈酮微粒的制备：制剂3通过称量40g聚乙烯醇(pva)(mowiol40-88,sigmaaldrich,st.louis,mo)并与4l去离子水混合来制备连续相。有机相由置于20ml闪烁瓶中的溶于2.0g二氯甲烷(dcm)(fisherscientific,fairlawn,nj)和467mg苯甲醇(fisherscientific,fairlawn,nj)的500mgplga85:15(resomerrg858sevonikcyro,parsippany,nj)和294mg纳屈酮游离碱(tecolandcorporation,irvine,ca)组成。将连续相进一步与dcm混合，并将10ml含1.8％(w/v)dcm的连续相加入有机相顶部，并使用配备s25n-10g发生器的ikat25均质机(ikaworks,inc.wilmington,nc)以7,000rpm均质化60秒。然后将混合物转移至萃取相中，萃取相为380ml含0.5％w/vdcm的水溶液，并在4℃下搅拌8h。然后用25μm筛网收集微粒。筛网保留的产物在22℃下脱水15min，并真空干燥约16h。然后将微粒在200ml25％(v/v)乙醇溶液中于22℃下悬浮并清洗8h，以除去微粒中的乳化剂(pva)和任何残留溶剂。然后将清洗后的微粒收集在25μm筛网上，并真空干燥48h。所得载药量为28.1％(75.9％ee)，而残留苯甲醇为0.55％。体外药物释放曲线导致约50天的接近于零级的释放动力学。实施例4纳屈酮微粒的制备：制剂4通过称量40gpva并与4l去离子水混合来制备连续相。有机相由置于20ml闪烁瓶中的溶于2.0gdcm和623mg苯甲醇的500mgplga85:15(resomerrg858s)和294mg纳屈酮游离碱(tecolandcorporation,irvine,ca)组成。将连续相进一步与dcm混合，并将10ml含1.8％(w/v)dcm的连续相加入有机相顶部，并使用配备s25n-10g发生器的ikat25均质机(ikaworks,inc.wilmington,nc)以7,000rpm均质化60秒。然后将混合物转移至萃取相中，萃取相为4℃下380ml含0.66％(w/v)dcm的水。然后将微粒搅拌8h，然后用23μm筛网收集。筛网保留的产物在22℃下脱水15min，并真空干燥约16h。然后将微粒在200ml25％(v/v)乙醇溶液中于22℃下悬浮并清洗8h，以除去微粒中的乳化剂(pva)和任何残留溶剂。然后将清洗后的微粒通过125μm筛网，收集在23μm筛网上，并真空干燥48h。所得载药量为21.7％(58.6％ee)，而残留苯甲醇为0.83％。萃取相中dcm含量较高(0.66％(w/v))以及有机相中苯甲醇起始含量较高大大降低了制剂的载药量。体外药物释放曲线导致约60天的接近于零级的释放动力学。实施例5纳屈酮微粒的制备：乳化介质中溶剂的影响通过称量40gpva并与4l去离子水混合来制备连续相。有机相由置于20ml闪烁瓶中的溶于4.0gdcm和1.908g苯甲醇的1.0gplga85:15(resomerrg858s)和818mg纳屈酮游离碱(specgx,llc)或置于20ml闪烁瓶中的溶于4.0gdcm和1.04g苯甲醇的1.0gplga85:15(resomerrg858s)和818mg纳屈酮游离碱(specgx,llc)组成。将15ml连续相或与dcm或苯甲醇(ba)进一步混合的连续相(如表3所述)加入有机相顶部，并使用配备s25n-10g发生器的ikat25均质机(ikaworks,inc.wilmington,nc)以7,000rpm均质化60秒。然后将混合物转移至760ml萃取相(如表3所述)中，并在4℃下搅拌4h。然后用25μm筛网收集微粒。筛网保留的产物在22℃下脱水15min，并真空干燥约16h。然后将微粒在400ml25％(v/v)乙醇溶液中于22℃下悬浮并清洗8h，以除去微粒中的乳化剂(pva)和任何残留溶剂。然后将清洗后的微粒通过125μm筛网，收集在23μm筛网上，并真空干燥48h。所得载药量和残留苯甲醇含量可见于表3中。随着苯甲醇起始量增加，观察到残留苯甲醇增加。可以获得80-90％的包封效率。对于该实施例，萃取介质中的二氯甲烷导致残留苯甲醇含量最低，但纳屈酮在该过程中也有损失。药物释放曲线似乎未显示在1％pva中的3.3％ba(苯甲醇)与仅1％pva之间的释放差异。在1％pva中的1.8％dcm显示初始释放速率略低，可能是由于载药量较低所致。表3.连续相和萃取相组合物对所得载药量、残留苯甲醇(ba)和包封效率(ee)的影响实施例6纳屈酮微粒的制备：油/水比的影响通过称量40gpva并与4l去离子水混合来制备连续相。有机相由20ml闪烁瓶中的溶于3.15g乙酸乙酯(fisherscientific,fairlawn,nj)和1.17g苯甲醇的0.630gplga85:15(resomerrg858s)和370mg纳屈酮游离碱(specgx,llc)组成。将连续相进一步与乙酸乙酯混合，并使用s25n-10g发生器的ikat25均质机(ikaworks,inc.wilmington,nc)在4,000或7,000rpm下将20ml含6.525％(w/v)乙酸乙酯的连续相与有机相乳化30秒。然后将混合物转移至萃取相中，萃取相为250ml在水中的2.5％(w/v)乙酸乙酯，并在4℃下搅拌2或4h。然后用10μm筛网收集微粒，并在4℃下真空干燥约16h。然后将微粒在150ml25％(v/v)乙醇溶液中于22℃下悬浮并清洗8h，以除去微粒中的乳化剂(pva)和任何残留溶剂。然后将清洗后的微粒通过150μm筛网，收集在10μm筛网上，并真空干燥48h。所得载药量和残留苯甲醇含量可见于表4中。包封效率似乎低于在相似条件下用二氯甲烷制备的制剂。观察到三种制剂的体外释放曲线的微小差异，所有制剂的持续时间均略长于约55天。表4.o/w比、均质化速度和溶剂萃取时间对所得载药量、残留苯甲醇(ba)和包封效率(ee)的影响实施例7使用凝胶渗透色谱四元检测器的plga分子量测定将resomerrg858s和lactelb6006-2p的样品溶于丙酮中，使浓度为约2.5mg/ml，通过0.22μmptfe过滤器过滤，并收集至hplc自动进样器小瓶中以用于进样。使用gpc-4d分析样品。gpc-4d系统由连接至dawnheleosii(malls)的agilent1260infinityiihplc(通过光缆连接到dynapronanostardls)、optilabt-rex(ri检测器)和由astra7软件操作的viscostariii粘度计组成。通过进样50.0μl聚合物溶液进行gpc分析。使用线性梯度柱(tosohbiosciencellc,tskgelgmhhr-l,7.8mmx30cm)以0.6ml/min丙酮流速进行分离，运行时间为60分钟。聚合物样品的分子量如表5所示。表5.mn(数均分子量)、mw(重均分子量)、mz(高平均分子量)、mavg(平均分子量)和多分散性实施例8纳屈酮微粒的制备：85:15分子量和萃取时间的影响通过称量40gpva并与4l去离子水混合来制备连续相。有机相由置于20ml闪烁瓶中的溶于2.0gdcm和623mg苯甲醇的500mgplga85:15(resomerrg858s(iv1.3-1.7dl/g，批号d161000568，evonikcyro，parsippany，nj)或lactelb6006-2p(iv0.76-0.85dl/g，批号a17-068，durect，cupertino，ca))和267mg纳屈酮游离碱(specgx,llc)组成。将连续相进一步与dcm混合，并将10ml含1.8％(w/v)dcm的连续相加入有机相中，并使用配备s25n-10g发生器的ikat25均质机(ikaworks,inc.wilmington,nc)以7,000rpm乳化60秒。然后将混合物转移至萃取相(380ml在水中的0.5％(w/v)二氯甲烷)中，并在4℃下搅拌2、4或7h。然后用25μm筛网收集微粒，并在4℃下真空干燥约16h。然后将微粒在200ml25％(v/v)乙醇溶液中于22℃下悬浮并清洗8h，以除去微粒中的pva和任何残留溶剂。然后将清洗后的微粒通过125μm筛网，收集在25μm筛网上，并真空干燥48h。所得载药量、残留苯甲醇含量和包封效率可见于表6中。在两种类型的plga及其各自的载药量之间观察到最小的萃取时间影响。lactel批次的残留苯甲醇似乎略高于resomer批次。萃取时间似乎对释放速率没有影响，而两种聚合物之间的释放曲线存在明显差异。与lactel批次相比，resomer批次的滞后期似乎较短，导致与lactel批次相比，60天体外更大的稳态释放。表6.plga和萃取时间对所得载药量、残留苯甲醇(ba)和包封效率(ee)的影响实施例9纳屈酮微粒的制备：无乙醇清洗与25％乙醇清洗的影响通过称量40gpva并与4l去离子水混合来制备连续相。有机相由置于20ml闪烁瓶中的溶于2.0gdcm和623mg苯甲醇的500mgplga85:15(resomerrg858s)和267mg纳屈酮游离碱(specgx,llc)组成。将连续相进一步与dcm混合，并将10ml含1.8％(w/v)dcm的连续相加入有机相中，并使用配备s25n-10g发生器的ikat25均质机(ikaworks,inc.wilmington,nc)以7,000rpm乳化60秒。然后将混合物转移至萃取相(380ml在水中的0.5％(w/v)dcm)中，并在4℃下搅拌2h。然后用25μm筛网收集微粒，并在4℃下真空干燥约16h。然后将微粒在200ml25％(v/v)乙醇溶液中于22℃下悬浮并清洗8h，以除去微粒中的pva和任何残留溶剂，或通过125μm筛网并真空干燥48h。然后将清洗后的微粒通过125μm筛网，收集在25μm筛网上，并真空干燥48h。所得载药量、残留苯甲醇含量和包封效率可见于表7中。乙醇清洗导致微粒具有较低的残留苯甲醇含量和较高的载药量，这可能是由苯甲醇萃取所致。清洗后的颗粒和未清洗的颗粒之间的初始10天释放相似，但未清洗的颗粒在10天后的速率比清洗后的颗粒快。表7.plga和萃取时间对所得载药量、残留苯甲醇(ba)和包封效率(ee)的影响实施例10纳屈酮微粒的制备：乙醇清洗浓度的影响通过称量40gpva并与4l去离子水混合来制备连续相。有机相由置于20ml闪烁瓶中的溶于2.0gdcm和467mg苯甲醇的500mgplga85:15(resomerrg858s)和305mg纳屈酮游离碱(specgx,llc)组成。将连续相进一步与dcm混合，并将10ml含1.8％(w/v)dcm的连续相加入有机相中，并使用配备s25n-10g发生器的ikat25均质机(ikaworks,inc.wilmington,nc)以7,000rpm乳化60秒。然后将混合物转移至萃取相(380ml在水中的0.33％(w/v)dcm)中，并在4℃下搅拌8h。然后用25μm筛网收集微粒，并在4℃下真空干燥约16h。然后将微粒在200ml6.25％(v/v)、12.5％(v/v)、25％(v/v)或50％(v/v)乙醇溶液中于22℃下悬浮并清洗8h，以除去微粒中的pva和任何残留溶剂。然后将清洗后的微粒通过125μm筛网，收集在25μm筛网上，并真空干燥48h。所得载药量、残留苯甲醇含量和包封效率可见于表8中。6.25％(v/v)、12.5％(v/v)和25％(v/v)的载药量未导致任何显著差异或趋势。在该条件下，残留苯甲醇含量随着乙醇清洗浓度的增加而降低。在50％(v/v)时，清洗过程中损失了大量纳屈酮，相对于6.25％、12.5％和25％条件，纳屈酮释放快得多。表8.乙醇清洗浓度对所得载药量、残留苯甲醇(ba)和包封效率(ee)的影响实施例11纳屈酮微粒的制备：乙醇清洗温度的影响通过称量40gpva并与4l去离子水混合来制备连续相。有机相由置于20ml闪烁瓶中的溶于2.0gdcm和467mg苯甲醇(fisherscientific,fairlawn,nj)的500mgplga85:15(resomerrg858s)和294mg纳屈酮游离碱(specgx,llc)组成。将连续相进一步与二氯甲烷混合，并将10ml含1.8％(w/v)二氯甲烷的连续相加入有机相中，并使用配备s25n-10g发生器的ikat25均质机(ikaworks,inc.wilmington,nc)以7,000rpm乳化60秒。然后将混合物转移至萃取相(380ml在水中的1％(w/v)pva)中，并在4℃下搅拌8h。然后用25μm筛网收集微粒，并在4℃下真空干燥约16h。然后将微粒在200ml25％(v/v)乙醇溶液中于4℃或22℃下悬浮并清洗8h，以除去微粒中的乳化剂(pva)和任何残留溶剂。然后将清洗后的微粒通过125μm筛网，收集在25μm筛网上，并真空干燥48h。所得载药量、残留苯甲醇含量和包封效率可见于表9中。22℃下乙醇清洗导致微粒具有较低的残留苯甲醇含量和较高的载药量，这可能是由苯甲醇萃取所致。从22℃下清洗的微粒释放纳屈酮导致直至10天的较快的释放速率。从4℃的微粒释放纳屈酮导致最初10天后较快的体外释放速率并且仅持续约35天，而22℃下清洗后的颗粒提供约50天的纳屈酮释放。表9.乙醇清洗浓度对所得载药量、残留苯甲醇(ba)和包封效率(ee)的影响实施例12制剂的体内应答用sprague-dawley大鼠在药代动力学研究中评价了纳屈酮(游离碱)载药量为约20％至约40％的七种制剂。在七种制剂中，f.12-1、f.12-2、f.12-4和f.12-6的制备方式与f.3-5、f.4-1、f.8-6和f.5-4相同，而f.12-3、f.12-5和f.12-7如下所述制备。f.12-3通过称量40g聚乙烯醇(pva)(mowiol40-88,sigmaaldrich,st.louis,mo)并与4l去离子水混合来制备连续相。有机相由溶于2.0g二氯甲烷(dcm)(fisherscientific,fairlawn,nj)和467mg苯甲醇(fisherscientific,fairlawn,nj)的500mgplga85:15(resomerrg858s)和294mg纳屈酮游离碱(tecolandcorporation,irvine,ca)组成。将10ml连续相加入有机相顶部，并使用配备s25n-10g发生器的ikat25均质机(ikaworks,inc.wilmington,nc)以7,000rpm均质化60秒。然后将混合物转移至萃取相中，萃取相为380ml在水中的1％(w/v)pva，并在4℃下搅拌8h。然后用25μm筛网收集微粒。筛网保留的产物在22℃下脱水15min，并真空干燥约16h。然后将微粒在200ml25％(v/v)乙醇溶液中于22℃下悬浮并清洗8h，以除去微粒中的乳化剂(pva)和任何残留溶剂。然后将清洗后的微粒收集在25μm筛网上，并真空干燥48h。f.12-5通过称量40g聚乙烯醇(pva)(mowiol40-88,sigmaaldrich,st.louis,mo)并与4l去离子水混合来制备连续相。有机相由置于20ml闪烁管中的溶于2.0g二氯甲烷(dcm)(fisherscientific,fairlawn,nj)和623mg苯甲醇(fisherscientific,fairlawn,nj)的500mgplga85:15(resomerrg858s)和409mg纳屈酮游离碱(tecolandcorporation,irvine,ca)组成。将连续相进一步与二氯甲烷混合，将10ml含1.8％(w/v)dcm的连续相加入有机相顶部，并使用配备s25n-10g发生器的ikat25均质机(ikaworks,inc.wilmington,nc)以7,000rpm均质化60秒。然后将混合物转移至萃取相中，萃取相为380ml在水中的0.5％(w/v)dcm，并在4℃下搅拌4h。然后用25μm筛网收集微粒。筛网保留的产物在22℃下脱水15min，并真空干燥约16h。然后将微粒在200ml25％(v/v)乙醇溶液中于22℃下悬浮并清洗8h，以除去微粒中的乳化剂(pva)和任何残留溶剂。然后将清洗后的微粒收集在25μm筛网上，并真空干燥48h。f.12-7通过称量40g聚乙烯醇(pva)(mowiol40-88,sigmaaldrich,st.louis,mo)并与4l去离子水混合来制备连续相。有机相由置于20ml闪烁管中的溶于2.0g二氯甲烷(dcm)(fisherscientific,fairlawn,nj)和623mg苯甲醇(fisherscientific,fairlawn,nj)的500mgplga85:15(resomerrg858s)和267mg纳屈酮游离碱(tecolandcorporation,irvine,ca)组成。将连续相进一步与二氯甲烷混合，将10ml含1.8％(w/v)dcm的连续相加入有机相顶部，并使用配备s25n-10g发生器的ikat25均质机(ikaworks,inc.wilmington,nc)以7,000rpm均质化60秒。然后将混合物转移至萃取相中，萃取相为380ml在水中的0.5％(w/v)dcm，并在4℃下搅拌7h。然后用25μm筛网收集微粒。筛网保留的产物在22℃下脱水15min，并真空干燥约16h。然后将微粒在200ml25％(v/v)乙醇溶液中于22℃下悬浮并清洗8h，以除去微粒中的乳化剂(pva)和任何残留溶剂。然后将清洗后的微粒收集在25μm筛网上，并真空干燥48h。评价了载药量、溶剂系统和溶剂浓度对纳屈酮释放的影响。相对于制剂稳态释放，最低载药量样品(f.12-2)似乎产生似乎是最大的突释。随着载药量从约28％增加至38％，从约第2天至第20天观察到较高浓度，但制剂在第20天后观察到相似的稳态血浆浓度，约1.5-4ng/ml，直至约第60天。0.5ng/ml的纳屈酮浓度维持约100天。表10.体内表征的制剂的制剂总结载药量(％w/w)基于微粒重量测试程序从测试制剂的纳屈酮体外释放将介质(20ml含0.05％吐温20(sigmaaldrich,st.louis,mo)的ph7.4磷酸盐缓冲盐水)和0.0625％(w/v)的抗坏血酸钠(sigmaaldrich,st.louis,mo)和约5mg测试物置于具塞的50ml锥形瓶中，并置于37℃水浴中，转速为100rpm。在不同时间点取样，并使用新鲜释放介质进行替换。通过高效液相色谱法(hplc)测定缓冲液中的纳屈酮含量。用于对纳屈酮进行定量的反相hplchplc的条件如下：流动相：65:35甲醇:磷酸钾缓冲液，ph6.6；流速：1.0ml/min；自动进样器温度：室温；柱温：30℃；检测：210nm(uv)；总运行时间：7min；进样量：10μl；柱：zorbaxsb-c18150×4.6mm，5μm；纳屈酮的近似保留时间：4.8min。体内药代动力学研究所有大鼠临床前研究均在sprague-dawley大鼠中进行。每种测试制剂3-5只大鼠在颈后颈背中或在肩胛区中皮下注射纳屈酮，剂量范围为50mg/kg至100mg/kg，在1ml由0.9％氯化钠、0.02％吐温20和0.5％羧甲基纤维素钠组成的水基溶媒中。在研究过程中，观察动物的明显毒性和任何存在的测试部位异常，包括注射部位发红、肿胀、出血、分泌物和瘀伤。此外，在给药时和研究结束时测量并记录体重。在选定时间点，麻醉大鼠并通过尾静脉或下颌下静脉采血(约250μl)。将血液采集至贴标的乙二胺四乙酸钾试管中。将血液在4℃下以4,000rpm离心10min。将血浆部分转移至标记的1ml塑料管中，并在分析前储存在-80℃下。当前第1页12当前第1页12