本发明涉及柠檬酸、柠檬酸的药学上可接受的盐、或它们的水合物或者它们的混合物在抑制糖尿病肾病中的肾纤维化等中的应用。
背景技术：
慢性肾病(ckd)是提示肾脏损伤的所见、gfr的降低持续3个月以上的病态，是不问原发病的概念。作为进展为终末期肾衰竭的ckd的三大原因疾病，已知有糖尿病肾病、慢性肾小球肾炎、高血压肾硬化症。在这些疾病发展为终末期肾衰竭的过程中，共同地确认到肾纤维化，而且，肾纤维化的程度与肾功能预后显著相关(非专利文献1)，因此，抑制肾纤维化的药剂有望作为ckd的发展抑制剂。
近年来，肾纤维化的机制已被阐明，明确了作为细胞因子的tgf-β1作为肾纤维化的诱导因子起到核心作用(非专利文献2)。实际上，根据动物实验中的肾纤维化抑制效果，针对显示抑制tgf-β1作用的效果的吡非尼酮，以糖尿病肾病患者为对象进行了临床试验，其结果显示，通过1年的给药，肾功能(egfr)得到显著改善(非专利文献3)。
另外，关于引发单核细胞和嗜碱细胞的迁移的趋化因子即mcp1，报告了狼疮肾炎、iga肾病等炎症参与其发作·进展的肾病中尿中浓度上升(非专利文献4)，还报告了通过给予作为mcp1的受体的ccr2的拮抗剂，在小鼠模型中肾纤维化得到抑制，巨噬细胞浸润得到抑制(非专利文献5)。
此外，还报告了通过给予作为缺氧诱导因子的hif1α的抑制剂，在小鼠中肾纤维化得到抑制(非专利文献6)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：nephroldialtransplant16:765-770,2001
非专利文献2：clinsci124:243-254,2013
非专利文献3：jamsocnephrol24:1599-1616,2013
非专利文献4：currmedchemanti-inflammatory&anti-allergy,2:175-190,2003
非专利文献5：jamsocnephrol15:940-948,2004
非专利文献6：amjphysiolrenalphysiol295:f1023-1029,2008
技术实现要素：
本发明的课题在于提供用于抑制糖尿病肾病中的肾纤维化的药剂等。
本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现柠檬酸、柠檬酸的药学上可接受的盐、或它们的水合物或者它们的混合物对抑制糖尿病肾病中的肾纤维化等有用，从而完成了本发明。
在一个方面中，本发明提供一种糖尿病肾病中的肾纤维化的治疗用或预防用组合物，包含柠檬酸、柠檬酸的药学上可接受的盐、或它们的水合物或者它们的混合物。
在一个方面中，本发明提供糖尿病性肾病的患者的肾中的选自tgf-β、hif1和mcp1中的至少1种蛋白质的产生抑制用组合物，包含柠檬酸、柠檬酸的药学上可接受的盐、或它们的水合物或者它们的混合物。
本发明所提供的组合物对抑制糖尿病肾病中的肾纤维化等有用。另外，本发明所提供的组合物的副作用少，安全。
具体实施方式
本发明所提供的组合物可以包含柠檬酸或其水合物、柠檬酸的医药上可允许的盐、或其水合物或者它们的混合物作为有效成分。作为柠檬酸的医药上可允许的盐的例子，可举出柠檬酸碱金属盐。作为柠檬酸碱金属盐的例子，可举出柠檬酸钾和柠檬酸钠，分别可以为稳定的柠檬酸钾的一水合物(c6h5k3o7·h2o)和柠檬酸钠的二水合物(c6h5na3o7·2h2o)等水合物。
作为优选的有效成分的例子，可举出柠檬酸酐、柠檬酸钠、柠檬酸钾或其水合物或者它们的混合物，例如可以为柠檬酸钾的一水合物(c6h5k3o7·h2o)和柠檬酸钠的二水合物(c6h5na3o7·2h2o)的混合物；或者柠檬酸钾的一水合物(c6h5k3o7·h2o)、柠檬酸钠的二水合物(c6h5na3o7·2h2o)和柠檬酸酐的混合物。柠檬酸钾的一水合物(c6h5k3o7·h2o)和柠檬酸钠的二水合物(c6h5na3o7·2h2o)的混合比可以由本领域技术人员适当设定，例如，对于柠檬酸钾的一水合物与柠檬酸钠的二水合物的摩尔比，相对于柠檬酸钾的一水合物1，可以使柠檬酸钠的二水合物为0.01～100。以摩尔比计可以使混合比约为1:1。
柠檬酸钾的一水合物(c6h5k3o7·h2o)、柠檬酸钠的二水合物(c6h5na3o7·2h2o)和柠檬酸酐的混合物中的柠檬酸钾的一水合物(c6h5k3o7·h2o)、柠檬酸钠的二水合物(c6h5na3o7·2h2o)和柠檬酸酐的混合比可以由本领域技术人员适当设定，例如，对于柠檬酸钾的一水合物、柠檬酸钠的二水合物和柠檬酸酐的摩尔比，相对于柠檬酸钾的一水合物1，可以使柠檬酸钠的二水合物为0.01～100，使柠檬酸酐为0.01～100。以摩尔比计可以使混合比约为2:2:1。
另外，优选的有效成分的其它例子可举出柠檬酸钠或其水合物，例如可以为柠檬酸钠的二水合物(c6h5na3o7·2h2o)。
另外，优选的有效成分的其它例子可以为柠檬酸钾或其水合物，例如可以为柠檬酸钾的一水合物(c6h5k3o7·h2o)。
另外，作为有效成分，可以使用碳酸氢钠代替柠檬酸或其水合物、柠檬酸的医药上可允许的盐、或其水合物或者它们的混合物。
在一个实施方式中，本发明所提供的组合物的有效成分是柠檬酸或其水合物、柠檬酸的医药上可允许的盐、或其水合物或者它们的混合物，上述柠檬酸的医药上可允许的盐为柠檬酸铁以外的盐。
在一个实施方式中，本发明所提供的组合物的有效成分可以包含柠檬酸或其水合物、柠檬酸钠或其水合物与柠檬酸钾或其水合物的混合物，也可以仅由柠檬酸或其水合物、柠檬酸钠或其水合物与柠檬酸钾或其水合物的混合物构成。
在一个实施方式中，本发明所提供的组合物的有效成分可以包含柠檬酸钠或其水合物与柠檬酸钾或其水合物的混合物，也可以仅由柠檬酸钠或其水合物与柠檬酸钾或其水合物的混合物构成。
本说明书中，提及柠檬酸或其水合物、柠檬酸的医药上可允许的盐、或其水合物或者它们的混合物(例如，柠檬酸钾的一水合物(c6h5k3o7·h2o)和柠檬酸钠的二水合物(c6h5na3o7·2h2o))的重量时，其重量可以为干燥重量。
本发明所提供的组合物可以为医药品，对抑制糖尿病肾病中的肾纤维化、抑制糖尿病肾病的患者的肾中的与肾纤维化相关的炎症或抑制糖尿病肾病的患者的肾中的tgf-β、hif1和/或mcp1的产生有用。
本说明书中，糖尿病的例子没有限定，可举出1型糖尿病和2型糖尿病。
本发明所提供的医药品即组合物(医药组合物)的给予对象可以由医生适当选择。
在一个实施方式中，本发明所提供的医药组合物的给予对象可以为患有糖尿病肾病的人、有糖尿病肾病的发作风险的人(例如，虽然糖尿病肾病未发作，但患有糖尿病的人)。
在一个实施方式中，通过对糖尿病肾病的患者给予本发明所提供的医药组合物，与给予安慰剂相比，能够抑制肾纤维化的恶化。
在一个实施方式中，通过对糖尿病肾病的患者给予本发明所提供的医药组合物，与给予安慰剂相比，能够抑制肾中的与肾纤维化相关的炎症的恶化。
在一个实施方式中，通过对糖尿病肾病的患者给予本发明所提供的医药组合物，与给予前相比，能够抑制肾纤维化的恶化。
在一个实施方式中，通过对糖尿病肾病的患者给予本发明所提供的医药组合物，与给予前相比，能够抑制肾中的与肾纤维化相关的炎症的恶化。
本发明所提供的医药组合物抑制肾中的选自tgf-β、hif1和mcp1中的至少1种蛋白质的表达。例如，本发明所提供的医药组合物抑制肾中的tgf-β、hif1或mcp1的蛋白质的表达。在一个实施方式中，通过对糖尿病肾病的患者给予本发明所提供的医药组合物，与给予安慰剂相比，肾中的tgf-β的蛋白质的表达得到抑制。
在一个实施方式中，通过对糖尿病肾病的患者给予本发明所提供的医药组合物，与给予安慰剂相比，肾中的hif1的蛋白质的表达得到抑制。
在一个实施方式中，通过对糖尿病肾病的患者给予本发明所提供的医药组合物，与给予安慰剂相比，肾中的mcp1的蛋白质的表达得到抑制。
在一个实施方式中，通过对糖尿病肾病的患者给予本发明所提供的医药组合物，与给予前相比，肾中的tgf-β的蛋白质的表达得到抑制。
在一个实施方式中，通过对糖尿病肾病的患者给予本发明所提供的医药组合物，与给予前相比，肾中的hif1的蛋白质的表达得到抑制。
在一个实施方式中，通过对糖尿病肾病的患者给予本发明所提供的医药组合物，与给予前相比，肾中的mcp1的蛋白质的表达得到抑制。
蛋白质的表达可以通过本领域技术人员公知的方法来评价，例如可以通过使用定量pcr(例如，定量rt-pcr)、elisa、蛋白质印迹、lc-ms/ms的方法等来评价。
肾脏中的纤维化例如可以使用通过肾活检得到的肾组织进行病理学评价。
在一个实施方式中，肾组织中的选自tgf-β、hif1和mcp1中的至少1种蛋白质的表达的抑制可以理解为肾纤维化发展的抑制。
在一个实施方式中，肾组织中的选自tgf-β和mcp1中的至少1种蛋白质的表达的抑制可以理解为与肾纤维化发展相关的炎症的抑制。
在一个实施方式中，本发明所提供的医药组合物被用于慢性肾病患者的尿酸管理，副作用少，安全。
在一个实施方式中，本发明所提供的医药组合物病态特异性地抑制或部分地抑制tgf-β、hif1和mcp1的作用，因此，副作用少，安全。
在一个实施方式中，在给予本发明所提供的医药组合物的情况下，本发明所提供的医药组合物与给予安慰剂相比，不会将选自tgf-β、hif1和mcp1中的至少1种蛋白质的表达抑制50％以上或60％以上。
在一个实施方式中，在给予本发明所提供的医药组合物的情况下，本发明所提供的医药组合物与给予安慰剂相比，不会将tgf-β、hif1和mcp1的各个蛋白质的表达抑制50％以上或60％以上。
在一个实施方式中，在给予本发明所提供的医药组合物的情况下，本发明所提供的医药组合物与给予安慰剂相比，将选自tgf-β、hif1和mcp1中的至少1种蛋白质的表达抑制10～40％。
在一个实施方式中，在给予本发明所提供的医药组合物的情况下，本发明所提供的医药组合物与给予安慰剂相比，将tgf-β、hif1和mcp1的各个蛋白质的表达抑制10～40％。
本发明所提供的医药组合物可以通过口服或非口服对人或其它哺乳动物给予，非口服给予的例子可举出静脉内给予、皮下给予、肌肉内给予、关节内给予、经粘膜给予、经皮给予、经鼻给予、直肠给予、髓腔内给予、腹腔内给予、局部给予。有效成分(例如，柠檬酸或其水合物；柠檬酸钾或其水合物；柠檬酸钠或其水合物；柠檬酸钾的一水合物和柠檬酸钠的二水合物的混合物；柠檬酸、柠檬酸钾的一水合物和柠檬酸钠的二水合物的混合物；或碳酸氢钠)的给予量可以由本领域技术人员适当设定。
本发明所提供的医药组合物可以将有效成分(例如，柠檬酸或其水合物；柠檬酸钾或其水合物；柠檬酸钠或其水合物；柠檬酸钾的一水合物和柠檬酸钠的二水合物的混合物；柠檬酸、柠檬酸钾的一水合物和柠檬酸钠的二水合物的混合物；或碳酸氢钠)直接制备或者与药学上允许的载体例如赋形剂(例如，乳糖、d-甘露醇、结晶纤维素、葡萄糖)、粘合剂(例如，羟丙基纤维素(hpc)、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮(pvp))、润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石)、崩解剂(例如，淀粉、羧甲基纤维素钙(cmc-ca))、稀释剂(例如，注射用水、生理盐水)以及根据需要使用的其它添加剂(例如，ph调节剂、表面活性剂、助溶剂、保存剂、乳化剂、等张剂、稳定剂)混合而制备，可以为片剂、胶囊剂、悬浮剂、注射剂、栓剂等制剂。例如，为了制成片剂，可以将有效成分(例如，柠檬酸或其水合物；柠檬酸钾或其水合物；柠檬酸钠或其水合物；柠檬酸钾的一水合物和柠檬酸钠的二水合物的混合物；柠檬酸、柠檬酸钾的一水合物和柠檬酸钠的二水合物的混合物；或碳酸氢钠)与赋形剂(例如，乳糖、d-甘露醇、结晶纤维素、葡萄糖)、崩解剂(例如，淀粉、羧甲基纤维素钙(cmc-ca))、粘合剂(例如，羟丙基纤维素(hpc)、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮(pvp))、润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石)等混合而制成制剂。片剂可以为素片，也可以为包衣片。
在一个实施方式中，本发明所提供的医药组合物为片剂。本发明所提供的片剂除有效成分(例如，柠檬酸或其水合物；柠檬酸钾或其水合物；柠檬酸钠或其水合物；柠檬酸钾的一水合物和柠檬酸钠的二水合物的混合物；柠檬酸、柠檬酸钾的一水合物和柠檬酸钠的二水合物的混合物；或碳酸氢钠)以外，还可以包含制药领域中惯用的药学上可允许的添加剂。作为这样的添加剂的例子，可举出赋形剂、粘合剂、崩解剂、流化剂、矫味剂、润滑剂、ph调节剂、表面活性剂、稳定剂和香料。
在一个实施方式中，本发明所提供的医药组合物(例如，片剂)的有效成分为柠檬酸的碱金属盐(例如，柠檬酸钾或其水合物(例如，柠檬酸钾的一水合物)；柠檬酸钠或其水合物(例如，柠檬酸钠的二水合物)；柠檬酸钾或其水合物、和柠檬酸钠或其水合物的混合物；或柠檬酸钾的一水合物和柠檬酸钠的二水合物的混合物)时，本发明所提供的医药组合物(例如，片剂)可以包含柠檬酸酐作为稳定剂。
本发明所提供的片剂中的有效成分(例如，柠檬酸或其水合物；柠檬酸钾或其水合物；柠檬酸钠或其水合物；柠檬酸钾的一水合物和柠檬酸钠的二水合物的混合物；柠檬酸、柠檬酸钾的一水合物和柠檬酸钠的二水合物的混合物；或碳酸氢钠)的含量相对于片剂可以为10～95重量％，优选可以为30～90重量％，更优选可以为60～90重量％。
本发明所提供的医药组合物可以通过制药领域中公知的方法来制造。例如，制成片剂时，制造方法可包括:将有效成分(例如，柠檬酸钾或其水合物；柠檬酸钠或其水合物；柠檬酸钾的一水合物和柠檬酸钠的二水合物的混合物；或碳酸氢钠)与添加剂混合的混合工序、造粒工序、压片工序和/或包衣工序。
混合工序可包括将有效成分与赋形剂、稳定剂、崩解剂和/或粘合剂等添加剂混合的工序。另外，可进一步包括；在压片工序之前，将包含有效成分和添加剂的混合物与润滑剂、矫味剂和/或香料混合的工序。混合可以使用v型混合机、w型混合机、容器混合机、转鼓混合机、搅拌混合机等进行。
造粒工序可以通过制药领域中公知的造粒方法来进行。造粒方法的例子可举出干式造粒法、湿式造粒法、流化床造粒法。
作为一个实施方式，混合工序中得到的混合物、造粒工序中得到的造粒物通过适当地粉碎和/或筛分，可制成具有期望的粒径的混合物、造粒物。粉碎例如可以利用球磨机、喷射磨机、锤磨机等制药领域中公知的粉碎机来进行。筛分可以使用16目筛(网孔1000μm)～32目筛(网孔500μm)等进行。
压片工序可以通过制药领域中公知的压片方法来进行。压片方法的例子可举出直接压片法、干式压片法、湿式压片法、外部润滑压片法。例如，可以使用单发式压片机、旋转式压片机等制药领域中公知的压片机进行，可以将上述工序中得到的混合物、造粒物进行压片。使用单发式压片机、旋转式压片机等时，可以采用1kn～30kn的压片压力。
包衣工序可以通过制药领域中公知的方法进行。例如，可以通过将适当包含包衣基剂与增塑剂、着色剂、光泽剂等的包衣液喷雾包衣于素片的外侧来进行。
在一个实施方式中，得到的片剂的硬度可以为10～200n，优选可以为30～150n。
本发明所提供的医药组合物中的有效成分(例如，柠檬酸钾或其水合物；柠檬酸钠或其水合物；柠檬酸钾的一水合物和柠檬酸钠的二水合物的混合物；或碳酸氢钠)的量可适当地设定。
在一个实施方式中，本发明所提供的医药组合物为片剂，每1片片剂中，可以包含作为有效成分的柠檬酸酐、柠檬酸钾一水合物或柠檬酸钠二水合物10mg～1g，优选可以包含100mg～600mg，更优选可以包含400mg～550mg。
在一个实施方式中，本发明所提供的医药组合物为片剂，每1片片剂中，可以包含柠檬酸酐、柠檬酸钾一水合物和柠檬酸钠二水合物分别为10mg～300mg、合计20mg～600mg，优选包含分别为70～250mg、合计400～600mg，更优选包含分别为70～240mg、合计450～550mg。
在一个实施方式中，本发明所提供的医药组合物为片剂，在1片剂中，可以包含作为有效成分的碳酸氢钠10mg～1g，优选可以包含100mg～500mg。
作为一个实施方式，本发明所提供的医药组合物为片剂，以柠檬酸钾一水合物231.5mg和柠檬酸钠二水合物195.0mg为有效成分，可以包含柠檬酸酐、结晶纤维素、部分糊化淀粉、羟丙基纤维素、硬脂酸镁、羟丙甲纤维素、聚乙二醇6000、氧化钛和巴西棕榈蜡作为添加剂。
本发明所提供的组合物可作为食品使用。食品可在不以疾病的治疗或预防为目的的范围内被人或其它哺乳动物(例如，健康的人、健康的哺乳动物)摄取。
通过摄取本发明所提供的食品，能够得到维持肾脏的健康等效果。
本发明所提供的食品可以为特定保健用食品、营养功能食品或功能性标示食品。
作为食品的形态，只要是能够口服摄取的形态就没有特别限定，可以为补充剂，也可以为一般的食品形态。作为一般的食品的例子，可举出饮料(例如，果汁等含有果汁或蔬菜提取物的饮料、红茶饮料、运动饮料、近水饮料、减肥饮料)、饴糖、果冻、软糖和口香糖。本发明所提供的食品可根据食品的种类而由本领域技术人员适当地制造，例如，可以通过在食品原材料中配合柠檬酸或其水合物、柠檬酸的医药上可允许的盐、或其水合物或者它们的混合物来制造。关于食品中所含的柠檬酸或其水合物、柠檬酸的医药上可允许的盐、或其水合物或者它们的混合物的含量，也可以由本领域技术人员适当设定，例如，食品中含有柠檬酸、柠檬酸钾和/或柠檬酸钠水合物时，可以以柠檬酸酐、柠檬酸钾或柠檬酸钠水合物合计每1天摄取1～6g、优选每1天摄取1～3g的方式在食品中含有柠檬酸、柠檬酸钾和/或柠檬酸钠水合物。本发明所提供的食品为片剂时，例如可以以在每1片为300mg～600mg的片剂中包含70～90重量％的柠檬酸或其水合物、柠檬酸的医药上可允许的盐、或其水合物或者它们的混合物(例如，柠檬酸、柠檬酸钾和柠檬酸钠水合物)的方式依据上述医药品的片剂的制造方法来制造。
在一个实施方式中，本发明提供柠檬酸或其水合物、柠檬酸的医药上可允许的盐、或其水合物或者它们的混合物在制造由本发明提供的医药组合物或食品中的应用。
在一个实施方式中，本发明提供柠檬酸或其水合物、柠檬酸的医药上可允许的盐、或其水合物或者它们的混合物在制造糖尿病肾病中的肾纤维化抑制用医药组合物中的应用。
在一个实施方式中，本发明提供柠檬酸或其水合物、柠檬酸的医药上可允许的盐、或者其水合物或它们的混合物在制造维持肾的健康的食品中的应用。
在一个实施方式中，本发明提供碳酸氢钠在制造由本发明提供的医药组合物或食品中的应用。
在一个实施方式中，本发明提供碳酸氢钠在制造糖尿病肾病中的肾纤维化抑制用医药组合物中的应用。
在一个实施方式中，本发明提供碳酸氢钠在制造维持肾的健康的食品中的应用。
作为本发明所提供的实施方式的例子，可举出以下(1-1)～(1-8)、(2-1)～(2-8)、(3-1)～(3-8)。
(1-1)
一种医药组合物，用于抑制糖尿病肾病中的肾纤维化，包含柠檬酸、柠檬酸的药学上可接受的盐、或它们的水合物或者它们的混合物作为有效成分；
(1-2)
根据(1-1)所述的医药组合物，其抑制肾中的炎症；
(1-3)
根据(1-1)或(1-2)所述的医药组合物，其抑制肾中的选自tgf-β、hif1和mcp1中的至少1种蛋白质的表达；
(1-4)
根据(1-1)～(1-3)中任一项所述的医药组合物，其为片剂；
(1-5)
根据(1-1)～(1-4)中任一项所述的医药组合物，其中，柠檬酸、柠檬酸的药学上可接受的盐、或它们的水合物或者它们的混合物为柠檬酸酐、柠檬酸的药学上可接受的盐或其水合物或者它们的混合物；
(1-6)
根据(1-1)～(1-5)中任一项所述的医药组合物，其中，柠檬酸、柠檬酸的药学上可接受的盐、或它们的水合物或者它们的混合物为柠檬酸钠或其水合物与柠檬酸钾或其水合物的混合物；
(1-7)
根据(1-1)～(1-6)中任一项所述的医药组合物，其中，对患有1型糖尿病的患者给予该医药组合物；
(1-8)
一种食品组合物，用于维持肾脏的健康，包含柠檬酸、柠檬酸的药学上可接受的盐、或它们的水合物或者它们的混合物；
(2-1)
作为有效成分的柠檬酸、柠檬酸的药学上可接受的盐、或它们的水合物或者它们的混合物在制造糖尿病肾病中的肾纤维化抑制用医药组合物中的应用；
(2-2)
根据(2-1)所述的应用，其中，医药组合物抑制肾中的炎症；
(2-3)
根据(2-1)或(2-2)所述的应用，其中，医药组合物进一步抑制肾中的选自tgf-β、hif1和mcp1中的至少1种蛋白质的表达；
(2-4)
根据(2-1)～(2-3)中任一项所述的应用，其中，医药组合物为片剂；
(2-5)
根据(2-1)～(2-4)中任一项所述的应用，其中，柠檬酸、柠檬酸的药学上可接受的盐、或它们的水合物或者它们的混合物为柠檬酸酐、柠檬酸的药学上可接受的盐、或其水合物或者它们的混合物；
(2-6)
根据(2-1)～(2-5)中任一项所述的应用，其中，柠檬酸、柠檬酸的药学上可接受的盐、或它们的水合物或者它们的混合物为柠檬酸钠或其水合物与柠檬酸钾或其水合物的混合物；
(2-7)
根据(2-1)～(2-6)中任一项所述的应用，对患有1型糖尿病的患者给予医药组合物；
(2-8)
柠檬酸、柠檬酸的药学上可接受的盐、或它们的水合物或者它们的混合物在制造人的肾脏的健康维持用食品组合物中的应用。
(3-1)
一种哺乳类对象(例如，人)的糖尿病肾病中的肾纤维化抑制方法，包括对需要抑制糖尿病肾病中的肾纤维化的对象给予包含有效量的柠檬酸、柠檬酸的药学上可接受的盐、或它们的水合物或者它们的混合物的医药组合物；
(3-2)
根据(3-1)所述的方法，其进一步抑制肾中的炎症；
(3-3)
根据(3-1)或(3-2)所述的方法，其进一步抑制肾中的选自tgf-β、hif1和mcp1中的至少1种蛋白质的表达；
(3-4)
根据(3-1)～(3-3)中任一项所述的方法，其中，医药组合物为片剂；
(3-5)
根据(3-1)～(3-4)中任一项所述的方法，其中，柠檬酸、柠檬酸的药学上可接受的盐、或它们的水合物或者它们的混合物为柠檬酸酐、柠檬酸的药学上可接受的盐、或其水合物或者它们的混合物；
(3-6)
根据(3-1)～(3-5)中任一项所述的方法，其中，柠檬酸、柠檬酸的药学上可接受的盐、或它们的水合物或者它们的混合物为柠檬酸钠或其水合物与柠檬酸钾或其水合物的混合物；
(3-7)
根据(3-1)～(3-6)中任一项所述的方法，其中，对患有1型糖尿病的患者给予医药组合物；
(3-8)
一种哺乳类对象(例如，人)的肾脏的健康维持方法，包括对需要维持肾脏的健康的对象给予包含有效量的柠檬酸、柠檬酸的药学上可接受的盐、或它们的水合物或者它们的混合物的食品组合物。
以下，通过实施例对本发明进一步进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
实施例
将c57bl/6n雄小鼠随机地分为由一组3只构成的3个组(对照组、柠檬酸盐(-)组、柠檬酸盐(+)组)。使动物绝食24小时后，对照组腹腔内单次给予柠檬酸缓冲液(10mm、ph4.5)，柠檬酸盐(-)组和柠檬酸盐(+)组腹腔内单次给予溶解于柠檬酸缓冲液(10mm、ph4.5)的链脲霉素(stz：streptozocin)(200mg/kg；sigma-aldrich、usa)。在stz给予后第20天，使用血糖仪测定从尾巴得到的血液试样的血糖值，确认糖尿病已发作。
制备包含柠檬酸盐的水溶液(在100ml中包含463mg的柠檬酸钾一水合物和390mg的柠檬酸钠二水合物的水溶液)，使柠檬酸盐(+)组的小鼠自由摄水一周。对照组和柠檬酸盐(-)的小鼠给予自来水饮水。
在饮水给予一周后测定尿的ph，结果柠檬酸盐(-)组的小鼠的尿的ph为5.296，与此相对，柠檬酸盐(+)组的小鼠的尿的ph为5.568，确认已被碱化。
在饮水给予一周后从小鼠摘除肾脏，制备cdna。以其作为模板，进行使用tgf-β、hif1、mcp1和sirt1各自的引物(表2)的定量pcr(扩增产物分别为2191bp、4775bp、175bp、3793bp)，作为相对于内标的相对量，求出肾中的tgf-β、hif1、mcp1和sirt1各自的表达量。
[表1]
stz诱导的糖尿病小鼠中柠檬酸盐对肾脏病理标志物的效果
mean+/-sd，n＝3
ap＞0.9999vs对照且bp＝0.0983vs柠檬酸盐(-)，
cp＝0.0139vs对照且dp＝0.6453vs柠檬酸盐(-)基于tukey检验
ep＝0.0335vs对照且fp＝0.0993vs柠檬酸盐(-)基于student-t检验
[表2]
其结果，与柠檬酸盐非给予组相比，在给予了包含柠檬酸盐的水溶液的糖尿病小鼠中，stz所引发的tgf-β和mcp1的表达量增加得到抑制，而且hif1的表达量降低(表1)。另外，与对照组相比，包含柠檬酸盐的水溶液给予组的hif1的表达量降低(表1)。
根据表1的结果，显示通过给予包含柠檬酸盐的水溶液，病态特异性地抑制或部分地抑制tgf-β、hif1和mcp1的表达。另外，启示通过给予包含柠檬酸盐的水溶液，糖尿病小鼠的肾纤维化、其发展过程中的炎症得到抑制。
产业上的可利用性
通过利用本发明，可提供糖尿病肾病中的肾纤维化抑制用组合物等。
序列表
<110>日本化学药品株式会社
<120>糖尿病肾病中的肾纤维化抑制剂
<130>utu9
<140>jp2018-195826
<141>2018-10-17
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