在基于干细胞的疗法中使用交变电场预防和治疗畸胎瘤形成

文档序号:25996791发布日期:2021-07-23 21:11阅读:511来源:国知局
在基于干细胞的疗法中使用交变电场预防和治疗畸胎瘤形成

相关申请的交叉参考

本申请要求2018年10月23日提交的美国临时申请62/749,305的权益,其通过参考以其全部结合至本文中。

背景

再生医学为改变游戏规则的医学领域,其涉及创建活的功能性组织以修复或替换由于年龄、疾病、损害或先天性缺陷而丧失的组织或器官功能的过程。该领域有望通过引入外部细胞、组织或者甚至整个器官来整合并成为组织的一部分或替换整个器官,从而修复或替换体内受损的组织和器官。重要的是,对于需要挽救生命的器官移植的患者,再生医学具有解决供体器官短缺的潜力。

再生医学策略成功的一个关键为能够分离和产生包括多能干细胞在内的干细胞。多能干细胞,包括胚胎干细胞(esc或es细胞)和诱导性多能干细胞(ipsc或ips细胞),由于其无限自我更新的能力及其分化成体内任何细胞类型(包括替换因疾病或损伤而受损的组织所需的任何细胞类型)的能力,而为基于细胞疗法的领先候选者。例如,这种类型的治疗可用于替换由中风、脊髓损伤、阿尔茨海默病、帕金森病或其他神经系统障碍而受损的神经元。生长产生胰岛素的胰腺细胞可治疗患有糖尿病的人,和心脏细胞可修复心脏病发作之后的损伤。可以想到的是,该列表可包括损伤或患病的任何组织。干细胞治疗还可用于经通过干细胞工程改造抗击癌症的免疫系统来帮助身体自身的细胞抗击癌症。

尽管有其治疗前景,但对于人类多能干细胞的临床实施而言,重要的安全性问题为其在体内形成畸胎瘤的可能性。畸胎瘤为由逃逸分化过程的残留多能干细胞污染治疗性干细胞衍生的细胞而引起的复杂肿瘤。甚至将少量未分化的多能干细胞注射到组织中(例如将10,000个es细胞注射到骨骼肌中)也可能导致畸胎瘤。参见例如lee等人(2009)cellcycle8:2608-2612。因此,在干细胞疗法变为被接受用于人类用途之前,必须克服这一障碍。

已经进行了一些尝试,以从移植前的细胞中选择性地去除残留未分化的多能干细胞,同时保留其分化的后代细胞。这些方法包括使用细胞毒性抗体(tan等人,2009;choo等人,2008)、特异性抗体细胞分选(tang等人,2011;fong等人,2009)、遗传操纵(包括引入自杀基因)(blum等人,2009;schuldiner等人,2003)、药理学方法(lee等人,2013;ben-david等人2013;lin等人,2017)和放射疗法(lee等人,2017)。然而,这些方法中的每一种均具有显著缺点,比如成本高(细胞毒性抗体和特异性抗体细胞分选)、不同批次之间的差异(细胞毒性抗体和特异性抗体细胞分选)、非特异性结合(细胞毒性抗体)、需要遗传操纵和稳定整合毒性基因(遗传操纵)、耗时程序(遗传操纵、特异性抗体细胞分选和细胞毒性抗体)以及电离辐射的使用(放射疗法)。尽管许多研究试图防止从残留的多能干细胞形成畸胎瘤,但尚未开发出临床上可行的消除畸胎瘤形成的策略。

发明概述

本发明的一个方面涉及通过从一批分化的后代细胞中消除残留的多能干细胞,而在基于干细胞的癌症疗法中预防医源性畸胎瘤的第一种方法。第一种方法包括使这批分化的后代细胞和残留的多能干细胞暴露于交变电场一段时间。交变电场具有频率和场强,使得(a)由于暴露于交变电场所述时间段,多能干细胞相继死亡,从而产生纯化批次的分化的后代细胞,使得其安全地随后用于基于干细胞的疗法中,和(b)暴露于交变电场所述时间段的分化细胞保持基本上未受损害。第一种方法还包括在暴露之后,使用所述纯化批次的分化的后代细胞治疗癌症。

在第一种方法的某些情况下,基于干细胞的癌症疗法为用于白血病的基于干细胞的疗法。在第一种方法的某些情况下,基于干细胞的癌症疗法为用于淋巴瘤的基于干细胞的疗法。

本发明的另一方面涉及从一批分化的后代细胞中消除残留的多能干细胞,以防止在基于干细胞的疗法中形成畸胎瘤的第二种方法。第二种方法包括使这批分化的后代细胞和残留的多能干细胞暴露于交变电场一段时间。交变电场具有频率和场强,使得(a)由于暴露于交变电场所述时间段,多能干细胞相继死亡,从而产生纯化批次的分化的后代细胞,使得其安全地随后用于基于干细胞的疗法中,和(b)暴露于交变电场所述时间段的分化的细胞保持基本上未受损害。

在第二种方法的某些情况下,纯化的批次含有少于100,000个多能干细胞。在第二种方法的某些情况下,纯化的批次含有少于10,000个多能干细胞。在第二种方法的某些情况下,纯化的批次含有少于1,000个多能干细胞。第二种方法的某些情况下,纯化的批次含有少于100个多能干细胞。在第二种方法的某些情况下,时间段为至少12小时。在第二种方法的某些情况下,时间段为至少2天。在第二种方法的某些情况下,交变电场具有在所述时间段内于至少两个不同方向之间不时切换的取向。

在第二种方法的某些情况下,交变电场的频率在50khz-500khz之间。在这些情况中的某些情况下,交变电场的场强为至少1v/cm。

在第二种方法的某些情况下,交变电场的频率在250khz-350khz之间和场强为至少1v/cm。在第二种方法的某些情况下,交变电场的频率在50khz-500khz之间和场强为至少1v/cm,且时间段为至少12小时。在第二种方法的某些情况下,交变电场的频率在250khz-350khz之间和场强为至少1v/cm,且时间段为至少3天。

第二种方法的某些情况进一步包括在暴露之后,将该批分化的细胞用于治疗或诊断目的。

在第二种方法的某些情况下,在暴露之前,通过扩繁多能干细胞并使扩繁的多能干细胞分化成这批分化的后代细胞来获得这批分化的后代细胞。

在第二种方法的某些情况下,暴露步骤在体外进行。在第二种方法的某些情况下,暴露步骤在体内进行。在第二种方法的某些情况下,多能干细胞包括诱导性多能干细胞、胚胎干细胞、癌症干细胞和胚胎生殖细胞中的一种或多种。在第二种方法的某些情况下,分化的后代细胞包含心肌细胞或心肌细胞祖细胞。在第二种方法的某些情况下,多能干细胞和分化的后代细胞为人类细胞。

附图简述

图1为描绘用于基于干细胞的疗法的显著降低畸胎瘤形成风险的一种示例性方法的步骤的流程图。

图2a描绘暴露于不同频率的交变电场的随着时间推移并与非暴露的对照进行比较的h7人类胚胎干细胞(h7-esc)如通过台盼蓝细胞染色评价的细胞数量计数。

图2b为暴露于不同频率的交变电场的随着时间推移的h7-esc的图2a中所示数据的放大版本。

图3描绘当暴露于不同频率的交变电场并与非暴露的对照进行比较时人类esc(h7品系)随着时间推移的细胞生存力。发光输出与细胞数量成正相关(r2=0.942)。rlu代表相对发光单位。

图4描绘在暴露于不同频率的交变电场之后并且与非暴露的对照心肌细胞进行比较的esc衍生的心肌细胞如通过台盼蓝细胞染色评价的细胞计数。对于所测试的5种频率中的任何一种,在施加交变电场前后心肌细胞计数均无显著差异。

图5a描绘测量在暴露于交变电场之后并且与非暴露的(未处理的)对照进行比较的esc衍生的心肌细胞的搏动率的收缩性测定的结果。在暴露于交变电场的esc-cm和未暴露的那些之间搏动率没有显著差异。

图5b描绘测量在暴露于交变电场之后并且与非暴露的(未处理的)对照进行比较的esc衍生的心肌细胞的收缩速度的收缩性测定的结果。在暴露于交变电场的esc-cm和未暴露的那些之间收缩速度没有显著差异。

图5c描绘测量在暴露于交变电场之后并且与非暴露的(未处理的)对照进行比较的esc衍生的心肌细胞的加速度的收缩性测定的结果。在暴露于交变电场的esc-cm和未暴露的那些之间加速度没有显著差异。

图6a-6c描绘在活小鼠中于h7-esc的细胞注射后3个不同时间处的bli信号。注意到,在经交变电场处理的esc注射侧与非处理的esc注射侧之间bli信号存在巨大差异。在用经交变电场处理的esc注射的小鼠的左胁腹中完全未检测到bli信号。

7a-7b描绘未暴露于交变电场的对照esc(图7a)以及在300khz下经历3天交变电场处理的esc(图7b)的细胞周期分析结果。

以下参考附图详细描述各种实施方案,其中相同的参考数字代表相同的要素。

优选实施方案的描述

消除先前基于干细胞的疗法中残留的多能干细胞(其可能引起畸胎瘤)的风险在先前是极为困难的。本文描述的实施方案使用新颖的方法来克服这一困难。

“多能性”和多能干细胞意指这种细胞具有分化成生物体中所有细胞类型的能力。术语“诱导性多能干细胞”涵盖多能细胞,就像胚胎干(es)细胞一样,其可长时间培养,同时保持分化成生物体中所有细胞类型的能力,但是与es细胞(衍生自囊胚的内细胞团)不同,其衍生自分化的体细胞,即具有更窄、更确定的潜力并且在没有实验操纵的情况下不能产生生物体中所有细胞类型的细胞。ips细胞具有esc样形态学,生长为具有大核质比、确定边界和突出的细胞核的扁平集落。另外,ips细胞表达一种或多种本领域普通技术人员已知的关键多能性标志物,包括(但不限于)碱性磷酸酶、ssea3、ssea4、sox2、oct3/4、nanog、tra160、tra181、tdgf1、dnmt3b、foxd3、gdf3、cyp26a1、tert和zfp42。另外,ips细胞能够形成畸胎瘤。另外,其能够在活生物体中形成或助于外胚层、中胚层或内胚层组织。

图1为描绘用于基于干细胞的疗法的显著降低畸胎瘤形成风险的一种示例性方法的步骤的流程图。(缩写:esc-胚胎干细胞,ipsc-诱导性多能干细胞,ppsc-多能干细胞)前4个步骤(即步骤20-26)类似于基于干细胞的疗法的现有技术方法中的相应步骤。其余步骤(即步骤30-35)提供了相对于现有技术方法的改进。

图1流程图的进入点取决于该过程是依赖于诱导性多能干细胞(ipsc)还是胚胎干细胞(esc)。如果过程依赖于ipsc,则该过程开始于步骤20,其中从受试者中分离细胞以获得初始细胞群体,该初始细胞群体将被重编程以生成多能干细胞,从该多能干细胞中衍生出治疗性细胞用于基于干细胞的疗法。或者,可从不同的供体中提取/分离细胞。最初可例如通过皮肤样品或通过从该人抽血来从受试者(或其他供体)中分离细胞。

“起始细胞群体”或“初始细胞群体”是指经历针对多能性的核重编程的体细胞,通常为原代或非转化的体细胞。起始细胞群体可属于任何哺乳动物物种,但特别是包括人类细胞。起始细胞群体的来源包括希望进行细胞疗法的个体、具有用于研究的目标遗传缺陷的个体等。

在一些实施方案中,出于再生目的从受试者获得的人类细胞可选自任何人类细胞类型,包括成纤维细胞、脂肪组织细胞、间充质细胞、骨髓细胞、胃细胞、肝细胞、上皮细胞、鼻上皮细胞、粘膜上皮细胞、滤泡细胞、结缔组织细胞、肌肉细胞、骨细胞、软骨细胞、胃肠道细胞、脾细胞、肾细胞、肺细胞、睾丸细胞、神经组织细胞等。在一些实施方案中,人类细胞类型为成纤维细胞,其可通过打孔活检便利地从受试者获得。

接下来,在步骤22中,对初始细胞群体进行重编程以生成诱导性多能干细胞(例如ipsc)。这可使用对相关领域的技术人员显而易见的多种方法中的任何一种来实施。如本文使用的“重编程因子”是指生物活性因子中的一种或多种(即混合物),其作用于细胞以改变转录,从而将细胞重编程为多能性或多潜能性。可将重编程因子单独或作为重编程因子的单个组合物(即作为预混合的组合物)提供给细胞,例如来自具有心脏病家族史或目标遗传组成的个体的细胞,比如成纤维细胞、脂肪细胞等。可以相同的摩尔比或以不同的摩尔比提供因子。可在培养细胞的过程中一次或多次提供因子。在一些实施方案中,重编程因子为转录因子,非限制性地包括oct3/4、sox2、klf4、c-myc、nanog和lin-28。

使体细胞与如上定义的重编程因子以足以将细胞重编程为多能性的组合和数量接触。可将重编程因子单独或作为重编程因子的单个组合物(即作为预混合的组合物)提供给体细胞。在一些实施方案中,重编程因子作为载体上的多个编码序列提供。

任选地,可出于多种目的将基因引入到体细胞或从其衍生的ips细胞中,例如以替换具有功能失活突变的基因、提供标志物基因等。或者,引入表达反义mrna或核酶的载体,从而阻断不期望的基因的表达。基因疗法的其他方法为引入耐药基因以使正常祖细胞能够具有优势并承受选择压力,例如多重耐药基因(mdr)或抗细胞凋亡基因,比如bcl-2。如上所述,可使用本领域已知的各种技术将核酸引入到靶细胞中,例如电穿孔、钙沉淀的dna、融合、转染、脂质转染、感染等。其中引入dna的具体方式并不关键。

注意到,代替以已经从受试者或其他供体中分离出来并重编程以形成诱导性多能干细胞的体细胞开始(如上结合步骤20-22所述),可使用备选方法来获得在随后的步骤中使用的多能干细胞。实例包括使用任何常规方法获得胚胎干细胞以获得这种细胞。在这种情况下,图1流程图的进入点为其中分离esc的步骤20’。

在如上所述获得多能干细胞(ppsc)(即在诱导性多能干细胞的情况下使用步骤20-22,或者在胚胎干细胞的情况下使用步骤20’)之后进行步骤24。在该步骤24中,使用相关领域技术人员将意识到的多种方法中的任何一种来扩繁初始数量的多能干细胞。例如,可培养初始数量的多能干细胞并供给适当的营养培养基直至获得一批多至足够用于预期应用的多能干细胞。

接下来,在步骤26中,使这批多能干细胞分化以形成一批具有期望的分化类型的特化细胞,这将取决于最终需要的治疗的性质。例如,如果最终目标为将心肌细胞引入到患有心脏病的患者中,则步骤26中的分化过程应将多能干细胞分化成心肌细胞。

分化细胞的实例包括来自外胚层(例如神经元和成纤维细胞)、中胚层(例如心肌细胞)或内胚层(例如胰腺细胞)谱系的任何分化细胞。分化细胞可为以下一种或多种:胆碱能、血清素能、gaba能、谷氨酸能神经元细胞、胰腺β细胞、神经干细胞、神经元(例如多巴胺能神经元)、视网膜神经节细胞、感光细胞(视杆细胞和视锥细胞)、视网膜色素上皮细胞、少突胶质细胞、少突胶质细胞祖细胞、肝细胞、肝干细胞、软骨细胞、骨细胞、结缔组织细胞、神经胶质细胞、星形胶质细胞、肌细胞、造血细胞、卵或精细胞、起搏细胞或心肌细胞。

尽管本文描述的方法不限于产生心肌细胞,但是出于说明性目的提供以下将一批多能干细胞分化成一批心肌细胞的实例。多能细胞可分化成体细胞,非限制性地包括心肌细胞。骨形态发生蛋白(bmp)信号传导的抑制可导致心脏肌肉细胞(或心肌细胞)的产生,参见例如yuasa等人,(2005),nat.biotechnol.,23(5):607-11。因此,在一个实施方案中,将多能细胞在允许形成胚状体之前,于存在头蛋白的情况下培养约2-约6天,例如约2、约3、约4、约5或约6天,并将胚状体培养约1周-约4周,例如约1、约2、约3或约4周。

心肌细胞分化可通过在培养物中包含亲心性剂来促进,比如激活素a和/或骨形态发生蛋白4(参见本文中的实例,xu等人regenmed.2011jan;6(1):53-66;mignone等人circj.201074(12):2517-26;takei等人amjphysiolheartcircphysiol.2009296(6):h1793-803,各自通过参考特别地结合至本文中)。这种方案的实例还包括例如任选地在存在细胞因子比如bmp4、vegf和激活素a的情况下添加wnt激动剂比如wnt3a;然后在存在wnt拮抗剂比如可溶性卷曲蛋白的情况下进行培养。然而,可使用任何合适的诱导心肌细胞分化的方法,例如由fujiwara等人plosone.20116(2):e16734;dambrot等人biochemj.2011434(1):25-35描述的环孢菌素a;由foldes等人jmolcellcardiol.201150(2):367-76描述的等轴周期性拉伸、血管紧张素ii和去氧肾上腺素(pe);由wang等人scichinalifesci.201053(5):581-9描述的抗坏血酸、二甲基亚砜和5-氮杂-2’-脱氧胞苷;由chen等人jcellbiochem.2010111(1):29-39描述的内皮细胞等,所述文献通过参考特别地结合至本文中。

在适当的发育阶段收获细胞,这可基于期望的细胞类型的标志物的表达和表型特征来确定(例如在约1-4周)。可通过形态学确定等经针对目标标志物的存在的染色凭经验测试培养物。通过药物选择、淘选、密度梯度离心等在阳性选择步骤前或后任选地富集细胞。

“心肌细胞前体”定义为能够产生包括心肌细胞的后代的细胞。可以区分在哺乳动物心脏发育期间出现的心肌细胞表型:原代心肌细胞、节心肌细胞、传导心肌细胞和工作心肌细胞。所有心肌细胞均具有肌节和肌浆网(sr),通过缝隙连接进行耦合,并显示自律性。原始心管的细胞的特征为高自律性、低传导速度、低收缩性和低sr活性。该表型主要持续存在于节细胞中。相比之下,心房和心室工作心肌细胞几乎不显示自律性,在细胞间耦合良好,具有发育良好的肌节,并且具有高sr活性。来自房室束、束支和周围心室传导系统的传导细胞具有发育差的肌节,sr活性低,但耦合良好且显示高自律性。

对于α-mhc、β-mhc和心脏肌钙蛋白i和慢速骨骼肌钙蛋白i,在分化的es细胞培养物中已观察到发育过渡。mlc2v和anf的表达通常分别用于区分es细胞培养物中的心室样细胞和心房样细胞,尽管在es衍生的细胞(esdc)中anf表达并不专门鉴定心房心肌细胞,并且可能是工作心肌细胞的一般标志物。

在该过程的这一点上(即步骤26的结尾),我们有一批期望类型的分化的后代细胞(例如心肌细胞)。但是由于分化的后代细胞使用涉及多能干细胞的过程产生,因此很有可能并非所有的多能干细胞均已分化成期望的细胞类型。这意味着残留的多能干细胞很有可能仍与这批分化细胞混合在一起。因此,在将这批分化的后代细胞用于治疗目的之前,应通过消除仍与这批分化细胞混合在一起的残留的多能干细胞(优选地尽最大可能)来纯化这批分化的后代细胞。当这批分化的后代细胞最终用于基于干细胞的疗法时,这将防止畸胎瘤的形成。

步骤30为其中进行这种纯化的地方。更具体地讲,在步骤30中,使这批分化的后代细胞以及其中混合的任何残留的多能干细胞暴露于交变电场一段时间。交变电场具有频率和场强特征。交变电场的频率和场强使得由于暴露于交变电场所述时间段,多能干细胞相继死亡,从而产生纯化批次的分化的后代细胞,使得其安全地随后用于基于干细胞的疗法中。同时,交变电场的频率和场强还使得暴露于交变电场所述时间段的分化细胞保持基本上未受损害。

重要的是,不必杀伤所有多能干细胞以使得纯化的批次安全。相反,可保留少量的多能干细胞,只要该数量足够小,使得在基于干细胞的疗法中使用纯化批次的分化的后代细胞不会导致畸胎瘤形成的不适当风险。在小鼠的情况下,用数字表示的这方面的一个实例为少于10,000个多能干细胞被注射到骨骼肌中和少于100,000个多能干细胞被注射到心肌中。在一些优选的实施方案中,多能干细胞的数量尽最大可能地减少(例如至少于1000或少于100个多能干细胞)。

进行了一组实验以确定用于电场的合适的示例性频率和场强。那些实验表明,在50khz-500khz之间的频率和1-4v/cm的场强可有效地用于通过从起始纯化前批次中消除快速分裂的多能干细胞来纯化分化的后代细胞。

肿瘤治疗电场(ttfields)为fda批准的一种用于实体瘤的疗法,其通过向肿瘤传递中频范围(例如50-500khz)内低强度(例如1-4v/cm)交变电场而运作。并且,可使用任何已知的将ttfields体外施加于培养物或体内施加于受试者的方法,以将交变电场施加于这批在残留的多能干细胞中混合的分化的后代细胞,以纯化这批分化细胞,从而防止畸胎瘤的形成。由于ttfields为交变电场,因此可用于从一批含有残留的多能干细胞的分化的后代细胞中消除多能干细胞的方法的一个实例为使用novocureinovitro™系统。inovitro™系统包含经软件控制的ttfields发生器和带有超高介电常数陶瓷培养皿的基板。inovitro™系统允许研究人员在每个陶瓷皿中设置目标ttfields强度和频率,并用于进行本文所述的体外实验。

ttfields体外施加系统的核心单元为高介电常数陶瓷(即铌镁酸铅-钛酸铅[pmn-pt])培养皿。两对电极垂直印制于胶粘于ttfields陶瓷皿底部的电路板上,以允许从平行于皿平面的两个垂直方向施加电场。这种配置优化在中期传播中将暴露于交变电场的细胞比例。由于细胞分裂随时可能发生,因此需要长时间暴露于电场以发挥最大作用。

通过将陶瓷皿安装到基板上来获得通过电极的电流,基板又钩接于连接于正弦波形发生器和放大器的电源盒上。这种设置使得ttfields能够以50-500khz的频率范围和1-4v/cm的电场强度施加。为了散发过多的热量,将ttfields皿保持于预先设定为20-27℃的温度调控的温育器内。陶瓷皿孔内培养基的温度通过不断地经印制到皿底部电路板上的温度探头监测皿温度来控制。通过计算机控制的由inovitro™系统施加于电路板底部的电压和电流的调整,使温度和电场强度保持恒定。

现将描述使用inovitro™系统进行心脏干细胞疗法实验的典型工作流程。根据实验的性质,将(a)esc衍生的心肌细胞或(b)esc接种到matrigel包被的盖玻片上。接下来将盖玻片转移至预先装有适当培养基(~2ml)的陶瓷皿中。在ttfields实验期间,将盖子置于陶瓷皿上以减轻蒸发。然后将陶瓷皿安装到ttfields基板上。将置于基板上的实验皿转移至用于交变电场条件的特殊温育器中。然后将基板用扁平电缆连接器连接于ttfields发生器。在使用inovitro™软件设定处理设置之后,开始实验。通过inovitro™功率发生器施加设置在1-4v/cm范围内任何值的ttfields。所选的ttfields频率包括50khz、100khz、200khz、300khz、400khz和500khz。施加ttfields时,陶瓷皿的温育温度范围为20-27℃,目标温度为37℃。在整个实验中,每24小时手动更换培养基。处理时间持续3-4天的任何天数,之后去除盖玻片并进行细胞计数或细胞生存力测定。将对照皿置于设置为37℃、95%空气和5%co2的单独的组织培养温育器中。除非另外说明,否则所有实验均按每条件一式三份样品进行。

对于每个实验,将相同数量的细胞接种到每个盖玻片上。根据个别实验,每盖玻片使用的设定接种密度为50,000-500,000个细胞。

重要的是,尽管使用inovitro™系统进行本文所述的体外实验,但是本文所述的方法不限于使用inovitro™系统施加交变电场。相反,可使用多种备选方法中的任何一种来施加交变电场,这些方法包括(但不限于)与inovitro™系统类似但是其规模按比例放大以增加对其施加交变电场的细胞数量的系统。

多能干细胞属包括胚胎干细胞(esc)和诱导性多能干细胞(ipsc)两者。并且,尽管本文所述的实验对胚胎干细胞进行,但结果也应适用于其他类型的多能干细胞。

在某些实验中,用在ef1a启动子下表达萤光素酶和番茄红的慢病毒载体转染h7-esc。用该慢病毒载体转染胚胎干细胞为有利的,因为当用适当波长的光照射时,番茄红导致esc变得可见,而当萤光素可用于细胞时,荧光素酶导致esc变得可见。

图2a和2b描绘第一实验的结果,该实验测量h7人类胚胎干细胞在暴露于50khz、100khz、200khz、300khz、400khz和500khz的交变电场时随着时间推移的细胞数量计数以及其中没有施加交变电场的对照的细胞数量计数。(图2a和2b以不同的y轴刻度描绘相同的数据。)在温育器中3天之后,非处理的对照esc的细胞数量增加>3600%(即从第0天[基线]的~45,000个esc跃升至第3天的~170万个细胞)。(图2b)在所测试的频率中,显示出最高esc杀伤的频率为300khz。认为长时间暴露于交变电场会根除几乎所有esc。

图3描绘当暴露于不同频率的交变电场时esc随着时间推移的细胞生存力。在交变电场疗法开始之前的基线处和交变电场疗法开始之后3天时,基于从celltiterglo测定获得的发光信号确定生存力。在温育器中3天之后,非处理的对照esc的发光输出增加>450%。然而,在所有5种所示频率下对其施加了3天交变电场的esc几乎完全根除。(注意的是,图3中100khz、200khz、300khz、400khz和500khz的数据点均以非常接近于零的数值重叠。)显示出最高esc杀伤的频率为300khz(与其基线起始值相比较细胞杀伤>99.9%)。细胞数量与发光输出相关(r2=0.942)。rlu代表相对发光单位。

在另一个实验中,明场图像还用于观察交变电场对胚胎干细胞的影响。在该实验中,在实验开始之前的基线处获得esc皿的明场图像。一些皿在300khz的频率下暴露于交变电场3天,而其他皿(即对照皿)在同一时间段内没有暴露于交变电场。在实验结束时,对皿的明场图像的目视观察表明,没有暴露于交变电场的皿中胚胎干细胞的数量快速增加,但在暴露于交变电场的皿中却似乎被完全根除。

这些实验表明,使多能干细胞以上述频率暴露于交变电场会导致多能干细胞死亡。

进行了另外的实验,以确定当使衍生自多能干细胞的分化细胞暴露于相同频率的交变电场时会发生什么。更具体地讲,在这些实验中,在以5种不同频率(50、100、200、300和400khz)将交变电场施加于那些细胞3天前和后目视观察esc衍生的心肌细胞(esc-cm)的皿。另外,在其期间没有施加交变电场的3天时间段前和后目视观察对照皿。皿的目视观察没有显示在施加交变电场前和后在心肌细胞孔方面有显著差异。

除目视观察之外,还进行了细胞计数,并且图4描绘了esc衍生的心肌细胞(esc-cm)在暴露于不同频率的交变电场之后的细胞计数结果。在3天时间段结束时使用台盼蓝细胞计数测定进行细胞计数。细胞计数表明,对于所测试的5种频率中的任何一种,施加交变电场前和后的心肌细胞计数上的差异均没有统计学限制性。

在施加交变电场前和后两者还观察到esc衍生的心肌细胞搏动,表明完整的功能表型(即没有由交变电场引起的有害作用)。

还观察到esc衍生的心肌细胞在暴露于交变电场之后的逐搏变化减少,表明观察到的改善的机电性能可能指示更成熟的心肌细胞特征。

图5a-5c描绘测量在300khz下暴露于交变电场之后esc衍生的心肌细胞以及没有暴露于交变电场的对照esc-cm的搏动率、收缩速度和加速度的收缩性测定的结果。在暴露于交变电场的esc-cm与没有暴露的那些之间,在心肌细胞的搏动率、收缩速度和加速度方面均未发现统计学上的显著差异。这提供另外的心肌细胞不受交变电场伤害的证据。

总而言之,这些实验表明,使一批干细胞衍生的分化细胞(例如心肌细胞)暴露于上述频率的交变电场,使那些细胞基本上未受损害。值得注意的是,对于分化的后代细胞(其没有受交变电场的损害,参见例如图4)观察到的结果与对于干细胞(其当暴露于交变电场时死亡,参见例如图3)观察到的结果形成鲜明对比。

图6a-6c描绘在小鼠右胁腹中于~500,000人类h7-esc的细胞注射后3个不同时间点处的bli信号(图6a:第1天,图6b:第3天,和图6c:第7天)。还对在小鼠的左胁腹中注射的经交变电场处理的esc(以300khz进行交变电场处理3天)和在小鼠的左侧肩胛骨中的仅matrigel注射(用作我们的对照)显示了3个不同时间点处的bli信号。注意的是,在经交变电场处理的esc注射侧与非处理的esc注射侧之间bli信号存在巨大差异。在用经交变电场处理的esc注射的小鼠的左胁腹中完全没有检测到bli信号。发光信号以光子每秒每平方厘米每球面度(光子/sec/cm2/sr)的辐射亮度单位量化。这表明,使多能干细胞暴露于交变电场会使多能干细胞的数量减少至其中它们在体内不形成畸胎瘤的程度。

图7a-7b描绘细胞周期分析结果,显示与非处理的对照esc(图7a)相比较,在300khz下经历3天交变电场处理的esc(图7b)被阻滞于细胞周期的g2/m检查点中。这为交变电场对快速分裂的细胞(比如干细胞和肿瘤细胞)的作用机制提供重要见解。

“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防备性措施两者。需要治疗的那些包括已经患有障碍的那些以及其中要预防障碍的那些。

用于治疗目的的“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物,包括人类、家养和农场动物,以及动物园、运动或宠物动物,比如狗、马、猫、牛等。在一些优选的实施方案中,哺乳动物为人类。

该申请描述从一批分化的后代细胞中消除残留的多能干细胞,以防止在基于干细胞的疗法中形成畸胎瘤的方法。在一些实施方案中,将通过本文所述的方法纯化的细胞群体纯化至其中107个细胞中少于1个细胞具有多能细胞特性的程度。在一些实施方案中,将通过本文所述的方法纯化的细胞群体纯化至其中存在少于100,000个多能干细胞的程度。在一些实施方案中,将通过本文所述的方法纯化的细胞群体纯化至其中存在少于10,000个多能干细胞的程度。在一些实施方案中,将通过本文所述的方法纯化的细胞群体纯化至其中存在少于1,000个多能干细胞的程度。在一些实施方案中,将通过本文所述的方法纯化的细胞群体纯化至其中存在少于100个多能干细胞的程度。

对于体外实施方案,细胞群体可包括怀疑包含分化的和多能细胞的混合物的任何群体。特别令人感兴趣的是制备为治疗剂的分化细胞的培养物,例如分化成目标途径的细胞,其中分化细胞衍生自干细胞,并且其中在这批分化细胞中可能存在残留的干细胞。

为了从一批分化的后代细胞中消除多能细胞,可将适当的溶液用于分散或悬浮。这种溶液通常为平衡盐溶液,例如生理盐水、pbs、hank平衡盐溶液等,可便利地补充胎牛血清或其他天然存在的因子,以及可接受的低浓度缓冲液(通常为5-25mm)。便利的缓冲液包括hepes、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液等。

通过使细胞悬浮于培养基中,并任选地允许细胞粘附于表面,可从细胞的复杂混合物中消除多能细胞。然后将细胞承受在中频范围(50-500khz)内的低强度交变电场一段时间。

在一些实施方案中,交变电场的频率为约200khz-约400khz、约250khz-约350khz,并且可为大约300khz。在一些实施方案中,电场为至少1v/cm。在一些实施方案中,电场在1-4v/m之间。在其他实施方案中,施加场强的组合,例如同时组合两种或更多种频率,和/或在不同时间施加两种或更多种频率。

暴露可持续至少12小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时或至少72小时或更长时间。

在一些实施方案中,细胞培养物包含体外培养的人工器官,例如其中一种或多种不同组织类型或组织层被共培养,其中在将器官植入体内之前通过暴露于交变电场处理人工器官以消除多能细胞。

在一些实施方案中,交变电场与有效剂量的靶向分裂细胞的物质组合,所述物质非限制性地包括烷化剂等。已知烷化剂通过大分子比如癌细胞的dna的烷基化起作用,并且通常为强亲电试剂。这种活性可破坏dna的合成和细胞分裂。适合用于本文的烷基化试剂的实例包括氮芥类及其类似物和衍生物,包括环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、雌莫司汀(estramustine)、盐酸氮芥(mechlorethaminehydrochloride)、美法仑(melphalan)和尿嘧啶氮芥(uracilmustard)。烷化剂的其他实例包括烷基磺酸酯类(例如白消安(busulfan))、亚硝基脲类(nitrosoureas)(例如卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)和链佐星(streptozocin))、三氮烯类(triazenes)(例如达卡巴嗪(dacarbazine)和替莫唑胺(temozolomide))、乙撑亚胺类(ethylenimines)/甲基蜜胺类(methylmelamines)(例如六甲蜜胺(altretamine)和塞替派(thiotepa))和甲基肼(methylhydrazine)衍生物(例如丙卡巴肼(procarbazine))。烷化剂组中包括烷基化样含铂药物,包括卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)。

另外的物质可包括(但不限于)叶酸、嘧啶、嘌呤和胞苷的类似物和衍生物。适合用于本文的物质的叶酸组的成员包括(但不限于)甲氨蝶呤(methotrexate)(氨甲蝶呤(amethopterin))、培美曲塞(pemetrexed)及其类似物和衍生物。适合用于本文的嘧啶类物质包括(但不限于)阿糖胞苷(cytarabine)、氟尿苷(floxuridine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil))、卡培他滨(capecitabine)、吉西他滨(gemcitabine)及其类似物和衍生物。适合用于本文的嘌呤类物质包括(但不限于)巯基嘌呤(mercaptopurine)(6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine))、喷司他丁(pentostatin)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、克拉屈滨(cladribine)及其类似物和衍生物。适合用于本文的胞苷类物质包括(但不限于)阿糖胞苷(cytarabine)(胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosinearabinodside))、阿扎胞苷(azacitidine)(5-氮杂胞苷(5-azacytidine))及其类似物和衍生物。

适合用于本文的抗有丝分裂剂包括(但不限于)长春花生物碱(vincaalkaloids)(如长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)及其类似物和衍生物)和鬼臼毒素(podophyllotoxins)(包括(但不限于)依托泊苷(etoposide)、替尼泊甙(teniposide)及其类似物和衍生物)。适合用于本文的抗肿瘤剂包括(但不限于)博来霉素(belomycin)、放线菌素d(dactinomycin)、多柔比星(doxorubicin)、伊达比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、喷司他丁(pentostatin)、普卡霉素(plicamycin)及其类似物和衍生物。喜树碱(camptothecin)类似物和衍生物适合用于本文并且包括喜树碱、拓扑替康(topotecan)和伊立替康(irinotecan)。

可评价群体中剩余的多能细胞的数量,例如在群体的等分试样中针对畸胎瘤形成细胞的存在进行培养,或通过分析多能性标志物,例如通过对标志物(例如oct-4、sox2、nanog、klf4、tra-1-60/tra-1-81/tra-2-54、ssea1、ssea4等)的存在进行染色。例如,可用与指示多能性的一种或多种这种标志物结合的抗体对细胞的等分试样进行染色。将抗体添加至细胞悬液中,并温育足以结合可用的细胞表面抗原的一段时间,并对与这种抗体结合的细胞进行定量。

如以上所定义的,暴露于交变电场的分化的后代细胞保持基本上未受损害。但是注意到,这要从整体角度进行分析,并且一小部分分化的后代细胞可能会死亡。优选地,少于5%分化的后代细胞将死亡。在备选实施方案中,少于10%、15%或25%分化的后代细胞将死亡。换句话说,可能存在对分化的后代细胞的某种杀伤,但是期望在纯化过程后具有至少75%、至少85%、至少90%、至少95%或更高的分化的后代细胞生存力。

可使缺少残留的多能干细胞的分化的后代细胞的纯化批次重悬于任何适当的保持细胞生存力的培养基中。各种培养基为可商购的,并且可根据细胞的性质使用,包括dmem、hbss、dpbs、rpmi、iscove培养基等,通常补充胎牛血清。

分化的后代细胞的纯化批次可立即使用。或者,可将细胞在液氮温度下冷冻并长时间储存,解冻并能够重新使用。在这种情况下,通常将细胞在10%dmso、50%血清、40%缓冲培养基或如本领域中常用的一些其他这种溶液中冷冻,以在这种冷冻温度下保存细胞,并以如本领域中通常已知用于解冻冷冻细胞的方式解冻。

返回图1,分化的后代细胞的纯化批次可在步骤35中在治疗上用于治疗受试者或用于诊断目的。该疗法可针对治疗疾病的原因;或者,该疗法可为治疗疾病或病症的影响。诱导的细胞可被转移至或接近于受试者的损伤部位;或者可以允许细胞迁移或归巢至损伤部位的方式将细胞引入到受试者中。转移的细胞可有利地替换受损或损伤的细胞,并允许改善受试者的整体状况。在某些情况下,转移的细胞可刺激组织再生或修复。

分化的后代细胞可转移至患有广泛范围的疾病或障碍的受试者。退化性心脏病比如缺血性心肌病、传导疾病和先天性缺陷可受益于再生细胞疗法,参见例如janssens等人,(2006),lancet,367:113-121。

在一些实施方案中,分化的后代细胞的纯化批次包括体外从多能干细胞群体中分化出来的心肌细胞。发现在用交变电场处理之后,esc衍生的心肌细胞的逐搏变化减少,表明改善的机电性能,指示更成熟的心肌细胞特征。在一些实施方案中,相对于没有暴露于交变电场的类似分化的心肌细胞,心肌细胞显示出增强的结构和功能成熟。

在涉及心肌细胞的那些实施方案中,可通过注射将纯化批次的分化的心肌细胞或心肌细胞祖细胞群体给予需要它的受试者的心脏。在一个实施方案中,注射为心肌内的。本领域的技术人员将充分意识到通过心肌内注射递送心脏干细胞的优势,因为心脏是起作用的肌肉。心肌内注射使由于心脏收缩运动而导致的注射细胞的损失最小化。或者,可通过经心内膜或经心外膜注射来给予经处理的细胞。在一个实施方案中,基于导管的方法用于递送经心内膜注射。导管的使用排除其中将需要打开胸腔的更具侵入性的递送方法。如本领域技术人员将意识到的,通过更微创的手术将允许最佳恢复时间。导管方法可涉及使用技术比如noga导管或类似系统。noga导管系统通过提供目标区域的机电图以及可用于递送靶向注射或用治疗剂对目标区域进行沐浴的可伸缩针来促进引导式给予。可通过使用这种系统以输送注射来进行本文所述的方法。本领域技术人员将认识到备选系统,该备选系统还提供通过可与本文所述的方法一起使用的成像与导管递送系统的集成来提供靶向治疗的能力。关于noga和类似系统的使用的信息可在例如sherman(2003)basicappl.myol.13:11-14;patel等人(2005)thejournalofthoracicandcardiovascularsurgery130:1631-38;和perrin等人(2003)circulation107:2294-2302中找到。在另一个实施方案中,可通过冠状动脉内给予途径来给予干细胞衍生的心脏细胞。本领域技术人员将认识到可与本文所述的方法一起使用的其他有用的递送或植入方法,包括在dawn等人(2005)proc.natl.acad.sci.usa102,3766-3771中描述的那些方法。

患有神经系统疾病或障碍的受试者受益于再生细胞疗法。在一些方法中,分化的后代细胞的纯化批次为移植到损伤部位以治疗神经系统病症的神经干细胞或神经细胞,所述神经系统病症例如阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、脑梗塞、脊髓损伤或其他中枢神经系统障碍,参见例如morizane等人,(2008),celltissueres.,331(1):323-326;coutts和keirstead(2008),exp.neurol.,209(2):368-377;goswami和rao(2007),drugs,10(10):713-719。

内皮细胞可用于例如在外周动脉疾病中改善血管结构和功能,增强血管生成和改善灌注。可将胰岛细胞(或朗格汉斯岛的原代细胞)移植到患有糖尿病(例如1型糖尿病)的受试者中,参见例如burns等人,(2006)curr.stemcellres.ther.,2:255-266。在一些实施方案中,将胰腺β细胞移植到患有糖尿病(例如1型糖尿病)的受试者中。在其他实例中,将肝细胞或祖细胞移植到患有肝病例如肝炎、肝硬化或肝衰竭的受试者中。

可将造血细胞或造血干细胞(hsc)移植到患有血液癌症或者其他血液或免疫障碍的受试者中。造血细胞或hsc可能治疗的血液癌症的实例包括:急性成淋巴细胞性白血病、急性成髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病(cml)、霍奇金病、多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。通常,患有这种疾病的受试者必须经历放射和/或化学治疗性治疗,以杀伤快速分裂的血细胞。将衍生自本文所述方法的hsc引入到这些受试者中可助于再生耗尽的细胞储库。在某些情况下,通过转分化衍生的造血细胞或hsc也可用于直接抗击癌症。例如,同种异体hsc的移植在肾癌的治疗中已显示出希望,参见例如childs等人,(2000),n.engl.j.med.,343:750-758。在一些实施方案中,可将衍生自诱导性细胞的同种异体或者甚至自体hsc引入到受试者中,以治疗肾脏或其他癌症。也可将衍生自诱导性细胞的造血细胞或hsc引入到受试者中,以产生或修复除血细胞以外的细胞或组织,例如肌肉、血管或骨。这种治疗对于多种障碍可能是有用的。

对受试者的治疗给予次数可以变化。将分化的后代细胞的纯化批次引入到受试者中可为一次性事件;但在某些情况下,这种治疗可能会在有限的时间段内引发改善,并且需要持续进行一系列重复治疗。在其他情况下,可能需要多次给予细胞才能观察到效果。确切的方案取决于疾病或病症、疾病的阶段以及所治疗的个体受试者的参数。

可经任何以下途径将细胞引入到受试者中:胃肠外、静脉内、动脉内、肌内、皮下、经皮、气管内、腹膜内或进入脊髓液中。

分化的后代细胞的纯化批次可在任何生理学上可接受的培养基中给予。它们可单独或者与合适的基底或基质一起提供,例如以支持其在要移植它们的组织中的生长和/或组织。可通过注射、导管等引入细胞。可将细胞在液氮温度下冷冻并长时间储存,能够在解冻时使用。如果冷冻,细胞通常将被储存于10%dmso、50%fcs、40%rpmi1640培养基中。一旦解冻,可通过使用与祖细胞增殖和分化相关的生长因子和/或基质细胞来扩繁细胞。

尽管使用上述频率、场强和持续时间进行了上述体外实验,但那些参数可以变化。例如,频率可在50-500khz之间,电场强度可在0.5-5v/cm之间;和持续时间可为长于12小时的任何时间。

在使用本文所述的inovitro™系统进行的体外实验中,交变电场的方向以一秒间隔在两个垂直方向之间切换。但是在备选实施方案中,交变电场的方向可以较快的速率(例如以1-1000ms之间的间隔)或以较慢的速率(例如以1-100秒之间的间隔)来切换。

在使用本文所述的inovitro™系统进行的体外实验中,通过将ac电压以交替顺序施加于在2d空间中彼此间隔90°布置的两对电极上,而在两个垂直方向之间切换交变电场的方向。但是在备选实施方案中,可通过重新安置电极对而在不垂直的两个方向之间或者在三个或更多个方向之间(假设提供另外的电极对)切换交变电场的方向。例如,交变电场的方向可在三个方向之间切换,其每个方向由其自身电极对的放置确定。任选地,可安置这三对电极,使得在3d空间中将生成的电场彼此间隔90°布置。在其他备选实施方案中,电场的方向保持恒定。

在使用本文所述的inovitro™系统进行的体外实验中,电场被电容耦合到培养物中,因为inovitro™系统使用布置于皿侧壁外表面上的导电电极,并且侧壁的陶瓷材料起电介质作用。但是在备选实施方案中,可将电场直接施加于细胞而无需电容耦合(例如通过修改inovitro™系统配置,使得导电电极布置于侧壁的内表面而不是侧壁的外表面上)。

本文所述的方法还可通过将交变电场施加于活受试者身体的目标区域以防止畸胎瘤形成或治疗已经开始形成的畸胎瘤而应用于体内情况。例如,这可使用novocureoptune系统(或其变体)将交变电场施加于活受试者的身体上来实现。参见例如美国专利7,565,205,其通过参考结合至本文中。在这种情况下,将电极安置于受试者的身体上或植入受试者的身体中(例如在受试者皮肤的正下方或目标区域附近),并在那些电极之间施加ac电压以在受试者身体的目标区域中施加交变电场。任选地,交变电场的取向可在两个或更多个不同方向之间周期性地切换。

在这种体内情况下,在体内消除多能干细胞以防止畸胎瘤的形成或治疗现有的畸胎瘤。这通过使多能干细胞暴露于交变电场一段时间来实现,交变电场具有频率和场强。交变电场的频率和场强使得由于暴露于交变电场所述时间段,多能干细胞相继死亡,直至多能干细胞的数量足够少,以(a)防止畸胎瘤的形成或(b)治疗已经形成的畸胎瘤。交变电场的频率和场强使得受试者体内暴露于交变电场的分化细胞保持基本上未受损害。

实验

提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供关于如何实施本文所述方法的完整公开和描述,并且它们既不旨在限制发明人视为其发明的范围,也不旨在表示以下实验为全部或所进行的唯一实验。已经尽力确保关于所用数字(例如数量、温度等)的准确性,但是应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指明,否则份数为按重量计的份数,分子量为重均分子量,温度为摄氏度,和压力为大气压或接近大气压。

实施例1

将细胞接种到盖玻片上.将人类多能干细胞(包括人类胚胎干细胞[esc]和人类诱导性多能干细胞[ipsc])保持在补充有10μmrock抑制剂y-27632的essential8(e8)培养基中。将esc(wa07[h7]品系)或ipsc接种到6孔板中直径22mm的玻璃或塑料盖玻片的中央。盖玻片事先已在常规组织培养温育器(37℃,95%空气,5%co2)中于37℃下,用在dmem/f12中按1:200稀释的matrigel包被至少1小时。一旦细胞粘附于盖玻片上,就向每孔中添加总共2ml补充有10μmrock抑制剂y-27632的e8培养基。随着细胞的恢复,每天更换培养基持续1-2天,然后将盖玻片转移至inovitro™ttfields装置(novocureinc.,haifa,israel)的陶瓷皿。

用于接种人类esc或ipsc衍生的心肌细胞(esc-cm或ipsc-cm)的程序与多能干细胞的程序相似,除了接种之后的恢复期持续更长时间(~5天)直至观察到明显的自发性搏动之外。esc-cm和ipsc-cm也保持在含有b27补充剂加胰岛素的rpmi1640培养基中。在开始肿瘤治疗电场实验之前,在盖玻片上目视观察到单层搏动的心脏细胞。细胞成像使用leicadmilled倒置荧光显微镜(leicamicrosystems,buffalogrove,il)或revolve显微镜(echolaboratories,sandiego,ca)进行。

使用自动细胞计数器进行台盼蓝细胞计数测定。除两次2mlpbs洗涤之外,通过去除培养基而准备陶瓷皿中的盖玻片用于细胞计数。然后将盖玻片转移至6孔板上,接着加入0.5ml胰蛋白酶-le(tryple)。将脱离的细胞悬浮于15mlfalcon管中,其中含有4.5ml补充有10μmrock抑制剂y-27632的e8培养基(对于esc和ipsc)或含有b27补充剂加胰岛素的rpmi1640培养基(对于esc-cm和ipsc-cm)。将细胞在室温下以300g离心5分钟。一旦获得沉淀,就吸出上清液,并将细胞重悬于10mlessential8或rpmi1640培养基中以进行细胞计数。

在混合细胞培养悬液之后,取10μl等分试样并置于1.5mleppendorf管中。然后将10μl的0.4%台盼蓝溶液添加至细胞培养物等分试样中,通过上下吸液混合,并加载到细胞计数载玻片的其中一个孔中。使用luna-fl双荧光自动细胞计数器(logosbiosystems,annandale,va,usa)对细胞进行计数。针对每种实验条件(例如对照[无ttf]、50khz、100khz、200khz、300khz、400khz和500khz),从3个技术重复中计算出总的活和死的细胞计数并取平均值。基于初始细胞悬液的1:10稀释因子外推总细胞计数。

使用celltiter-glo2.0测定对细胞生存力进行定量测量.使用celltiter-glo2.0测定(promega,madison,wi,usa)定量测量人类多能干细胞和干细胞衍生的心肌细胞的细胞生存力。celltiter-glo2.0测定提供一种均质方法,以通过定量存在的atp的量来确定培养物中活细胞的数量,存在的atp表明存在代谢活性细胞。在存在mg2+、atp(由活细胞贡献)和分子氧的情况下,萤光素酶催化萤光素的单加氧化。加入等于每孔中存在的细胞培养基体积的celltiter-glo2.0试剂体积(例如将0.5mlcelltiter-glo2.0试剂添加至0.5ml含有细胞的培养基中)。将内容物在定轨振荡器上混合2分钟以诱导细胞裂解。使6孔板在室温下温育10分钟以稳定发光信号。之后,将来自每孔的50μl一式三份转移至白色96孔板中。在synergyhtx多模式读板器(biotek,winooski,vt,usa)上使用1秒积分时间记录发光。使用biotekgen53.03软件分析发光信号。

收缩性测定.在施加肿瘤治疗电场前和后,通过sonysi8000活细胞成像系统(sonybiotechnology,sanjose,ca)评价干细胞衍生的心肌细胞的收缩性测量。在各种交变电场频率(例如50khz、100khz、200khz、300khz、400khz和500khz)下处理esc-cm或ipsc-cm持续72小时。对照皿没有对其施加的任何交变电场。使用高性能摄像机获取数据,摄像机利用独特的运动矢量软件以高时空保真度捕获细胞的运动。图像获取后,使用由sonybiotechnology开发的运动检测算法来计算细胞运动的位移和幅度。将目标区域(roi)定位于心脏细胞的单个细胞或簇上,并计算各种收缩和舒张参数。

荧光激活细胞分选(facs)和细胞周期分析.为了进行facs和细胞周期分析研究,我们在指定的交变电场实验条件之后收获h7esc,并用pbs对其进行洗涤。然后,我们将细胞在冰冷的70%乙醇中于-20℃下固定2小时。固定之后,我们通过离心收集细胞,并用1.0ml含有10μg/ml碘化丙啶(pi)、100μg/mlrnasea和0.05%tritonx-100的pbs染色。将细胞在pi溶液中于室温下和黑暗中温育15分钟,并用pbs洗涤一次,重悬于0.5mlpbs中,且使用guavafacs分析仪(emdmillipore,burlington,ma)中的incyte软件评价活和死的细胞,和使用guava细胞周期分析软件评价细胞周期状态。我们使用flowjo软件(treestar,ashland,or)分析了结果,以衡量活/死细胞和细胞周期状态。

人类多能干细胞(hesc和hipsc)的培养和维持

ipsc的产生.使用携带以下转录因子的非整合型仙台病毒载体将来自健康人类供体的真皮成纤维细胞重编程为ipsc:oct4、sox2、nanog和cmyc。

esc培养和维持.这些实验中使用的人类esc品系为用慢病毒载体转染的wa07(h7)品系,该载体在ef1a启动子下表达萤光素酶和番茄红。使用如先前所述的化学上确定的e8培养基,使esc在matrigel包被的板(esqualified,bdbiosciences,sandiego,ca)上生长至90%汇合。每天更换培养基,并且每3-4天用edta(thermofisherscientific,ca)传代细胞。在铺板之前,向解离的细胞中补充10μmrock抑制剂y-27632,以防止细胞凋亡。

心脏分化.使人类多能干细胞生长至90%汇合,并随后分化成搏动的心肌细胞,如先前burridge等人(2014);burridge等人(2015)中所述。基于流式细胞术获得的心脏细胞纯度为80-90%,其中细胞对心脏标志物比如肌钙蛋白t和α肌动蛋白进行染色。简而言之,在第0天,对细胞补充基础培养基(rpmi1640[thermofisherscientific]和2%b27无胰岛素型补充剂[thermofisherscientific]),并添加6μm糖原合酶激酶3β的选择性抑制剂chir-99021[selleckchemicals],糖原合酶激酶3β激活经典的wnt信号传导途径。在第2天,将培养基替换为没有补充chir99021的基础培养基。在第3天,将细胞用5μmwnt拮抗剂iwr-1[selleckchemicals]处理2天。在第5天及随后每隔一天直至收获,将培养基替换为新鲜的基础培养基。将10xtryple在37℃下添加至心肌细胞10分钟以解离成单个细胞。解离后,将esc-cm或ipsc-cm重新铺板在新鲜matrigel包被的6孔板上补充有10%敲除血清补充剂、b27补充剂(含有胰岛素)和1μmthiazovivin的rpmi1640培养基中。

小鼠中的细胞注射.用2%异氟烷麻醉雌性免疫缺陷裸(nu/nu)小鼠,并皮下注射约500,000h7esc。将h7esc悬浮于100μlmatrigel中,之后使用28规注射器针注射到小鼠的右胁腹中。此外,将经交变电场处理的h7esc(即以300khz处理3-4天的那些esc)皮下注射到小鼠的左胁腹中。将在左侧肩胛骨中的仅matrigel注射用作我们的对照。注射之前将注射器保持在冰上,以防止matrigel在室温下固化。斯坦福实验室动物护理行政小组(stanfordadministrativepanelonlaboratoryanimalcare)(aplac)批准了所有动物程序。

移植细胞的生物发光成像(bli),以评价细胞存活和畸胎瘤的形成.在这项研究过程期间进行了bli以追踪细胞增殖。细胞注射后,在ivisspectrum成像系统(xenogencorporation,alameda,ca)上进行长达5周的体内bli。在细胞移植后第0、1、3、7天以及每7天直到35天监测细胞存活和增殖。将1克d-萤火虫萤光素钾盐在23mlpbs中稀释,并使用28规胰岛素注射器针腹膜内给予300μl该混合物。腹膜内注射之后10分钟,使用1秒-5分钟的采集窗口对动物成像20分钟。使用livingimage软件(caliperlifesciences,版本4.3.1)分析不同时间点的生物发光图像。在细胞注射部位和对照区域上绘制roi。发光信号以光子每秒每平方厘米每球面度(光子/sec/cm2/sr)的辐射亮度单位量化。

畸胎瘤的外植和组织学.在畸胎瘤生长至直径约15mm大小之后,对小鼠实施安乐死并切除畸胎瘤,用4%多聚甲醛固定,并发送至病理核心实验室进行石蜡切片和h&e染色。

统计分析.使用graphpadprism(版本7.04)和spss(ibm,版本21)进行统计分析。显著性α水平设置为p<0.05的测试被认为是显著的。除非另外指明,否则数据作为平均值±标准差报告。

材料清单.以下材料用于本文所述的实验中:falcon6孔透明平底板(corning,目录号:353046);essential8™培养基(thermofisherscientific,目录号:a1517001);rpmi1640培养基(thermofisherscientific,目录号:11875093);磷酸盐缓冲盐水,10x溶液,fisherbioreagents™(thermofisherscientific,目录号:bp3994);chir-99021(selleck,目录号:s2924);iwr-1(selleck,目录号:s7086);b-27™补充剂(50x),无血清(thermofisherscientific,目录号:17504044);b-27™补充剂,无胰岛素型(thermofisherscientific,目录号:a1895601);corningmatrigel生长因子减少型(thermofisherscientific,目录号:356231);tryple™select酶(10x),无酚红(thermofisherscientific,目录号:a1217701);bdlo-doseu-100胰岛素注射器0.5ml(thermofisherscientific,目录号:329461);celltiter-glo2.0(promega,目录号:g9242);多聚甲醛20%溶液em级(electronmicroscopysciences,目录号:15713-s);碘化丙啶(sigma-aldrich,目录号:p4170);rnasea(thermofisherscientific,目录号:en0531);tritonx-100(sigma-aldrich,目录号:x100);xenolightd-萤光素钾盐(perkinelmer,目录号:122799);dmilled倒置荧光显微镜(leicamicrosystems,buffalogrove,il);revolve显微镜(echolaboratories,sandiego,ca);sonysi8000活细胞成像系统(sonybiotechnology,sanjose,ca);synergyhtx多模式读板器(biotek,winooski,vt,usa);luna-fl双荧光自动细胞计数器(logosbiosystems,annandale,va,usa);guavaeasycyteht流式细胞仪(emdmillipore,burlington,ma);inovitro™体外ttfield装置(novocureinc.,haifa,israel)。

参考文献

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尽管已经参考某些实施方案公开了本发明,但是可对所描述的实施方案进行多种修改、改变和变化而不背离如所附权利要求所定义的本发明的界限和范围。因此,旨在本发明不限于所描述的实施方案,而是具有由以下权利要求的语言及其等同物所定义的全部范围。

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