含有胍衍生物的用于促进生发的组合物的制作方法

文档序号:25996424发布日期:2021-07-23 21:11阅读:248来源:国知局
含有胍衍生物的用于促进生发的组合物的制作方法
本发明涉及一种用于促进生发的组合物,具体涉及一种包含胍衍生物作为有效成分用于促进生发的药物组合物。
背景技术
:毛发要重复三个阶段的周期,即生长阶段的成长期(anagen)、与毛发灭绝连接的退行期(catagen)和停止生长的休止期(telogen)。如果成长期的毛发数量减少,退行期和休止期的比例增加,毛发就会非正常脱落,导致脱发。作为治疗脱发的方法,现有毛发移植手术等外科手术方法或药物疗法等多种尝试。外科手术方法,虽然效果方面非常卓越,但缺点是费用巨大,手术过程艰难,患者的经济和精神负担非常重。另外,这只是临时的处方,不能成为根本的治疗方法。另外,广泛用于药物疗法的美国注册专利4596812中记载的米诺地尔,原本被用作高血压治疗剂,但随着因副作用出现生发现象的报告,开始被用作生发促进剂。但是,米诺地尔具有诸多副作用,如效果不明显,头皮疏松症、红斑、角质等接触皮肤炎等等(journalofthekoreamedicalassociation,56(1),45)。因此,现今需要研发一种既有优秀的防止脱发及促进生发功效又无副作用的安全治疗剂。技术实现要素:[技术问题]本发明人通过使用无毒性的胍衍生物作为有效成分,确立了能够促进生发,促进毛囊再生的促进生发或预防、治疗及改善脱发的组合物,从而完成了本发明。[技术方案]本发明的一个目的在于提供一种包含胍衍生物或其药学上可接受的盐作为有效成分,促进生发或者预防或治疗脱发的药物组合物。本发明的另一个目的在于提供一种包含胍衍生物或其化妆品学上可接受的盐作为有效成分,促进生发或者预防或改善脱发的化妆品组合物。本发明的又一个目的在于提供一种包含胍衍生物或其营养学上可接受的盐作为有效成分,促进生发或者预防或改善脱发的食品组合物。本发明的又一个目的在于提供一种包含胍衍生物或其营养学上可接受的盐作为有效成分,促进生发或者预防或改善脱发的饲料组合物。本发明的又一个目的在于提供一种促进生发或者预防或治疗脱发的方法,包括将胍衍生物或其药学上可接受的盐作为有效成分的药物组合物施用于有需要的受试者。本发明的又一个目的在于提供一种胍衍生物或其药学上可接受的盐或以其作为有效成分的组合物用于促进生发或者预防或治疗脱发的用途。本发明的又一个目的在于提供一种胍衍生物或其药学上可接受的盐或以其作为有效成分的组合物用于制备促进生发或者预防或治疗脱发的药品中的用途。[有益效果]当使用本发明提供的组合物时,与商用化的米诺地尔相比,其提供更优秀的促进生发和毛囊再生的效果。另外,相比于现有的胍衍生物,本发明提供的组合物促进生发的功效更为优秀,并因此可应用于促进生发、预防、治疗及改善脱发的药物、食品、饲料及化妆品组合物等多种领域。附图说明图1示出了胍衍生物化学式。图2是示出小鼠胚胎成纤维细胞到ipsc的重编程相关一系列胍衍生物化合物的促进效果的图。图3是示出人类包皮成纤维细胞到ipsc的重编程相关一系列胍衍生物化合物的促进效果的图。图4是示出维持人类胚胎干细胞的细胞干性的相关一系列胍衍生物化合物的促进效果的图。图5a是示出用肉眼确认的小鼠基于im化合物处理的生发效果的图。图5b是示出小鼠基于im化合物处理的生发效果的图表。图6a示出了小鼠皮肤的纵断面上通过h&e染色确认基于im化合物处理的毛囊周期效果的结果。图6b示出了基于im化合物处理的毛囊周期变化。图6c示出了在鼠标皮肤的横断面上通过h&e染色确认基于im化合物处理的毛囊周期效果的结果。图6d示出了基于im化合物处理的毛囊数量增加效果。图7a示出了im化合物处理第7日的k15、β-连环蛋白和ki67的表达程度。图7b示出了im化合物处理第7日的k15/β-连环蛋白和ki67/shh的facs分析结果。图7c示出了im化合物处理第20日的k15、β-连环蛋白和shh的组织化学分析结果。图7d示出了im化合物处理第20日的k15/β-连环蛋白和ki67/shh的facs分析结果。图8a示出了im化合物和米诺地尔处理第7日的针对k15、pdk、ki67和pdh的组织化学分析进行比较的结果。图8b示出了im化合物和米诺地尔处理第20日的针对k15、pdk、ki67和pdh的组织化学分析进行比较的结果。图8c示出了im化合物和米诺地尔处理第7日的针对k15/pdk和ki67/pdh的facs分析进行比较的结果。图8d示出了im化合物和米诺地尔处理时针对oxphos-相关酶(ndus3和atp5b)、糖酵解作用-相关酶(hk2和ldha)及细胞干性-相关基因(wnt1a,lef-1,gli-1及多功能蛋白聚糖)的表达程度进行比较的结果。图9是示出用肉眼确认的小鼠基于im化合物处理的生发效果的图。图10是示出用肉眼确认的雌性小鼠基于im化合物处理的生发效果的图。图11a是示出用肉眼确认的雄性小鼠基于im化合物处理的生发效果的图。图11b是示出用肉眼确认的雄性小鼠基于im化合物处理的生发效果的图。图12a示出了im化合物处理第20日的k15、pdk、ki67和pdh的组织化学分析结果。图12b示出了im化合物和米诺地尔处理第20日的针对k15/pdh和ki67/pdk的facs分析进行比较的结果。图13a是示出用肉眼进行比较的小鼠基于im化合物和二甲双胍处理的生发效果的图。图13b是示出针对小鼠基于im化合物和二甲双胍处理的生发效果进行比较的图表。图14a是示出基于im化合物处理的耳廓组织修复效果的图。图14b是示出基于im化合物处理的耳廓组织修复效果的图表。具体实施方式根据本发明的一方面,提供一种包含以下化学式1的化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分促进生发或者预防或治疗脱发的药物组合物:[化学式1]其中,在上述化学式1中,a是单键或-c(nh)-nh-,r1是-(ch2)n-,其中n是1至4的整数,r2是未取代的或者被卤素或选自c1-c4烷基中的一个或多个取代基取代的c6-c10芳基。例如,该化合物可以是以下化学式2至4的化合物中的任一种:[化学式2][化学式3][化学式4]化学式2至4的化合物是含有胍或双胍核心的疏水性阳离子小分子,其化学名分别是(n-1-(2-甲基)苯乙基双胍、n-1-(3,4-二氯)苯乙基双胍和1-(3,4-二甲基苯乙基)胍。在以下实施例中,这些化合物分别命名为“im176out05”(或“im”)、“im176out04”和“im177out02”。根据本发明提供的化学式1的化合物或其药学上可接受的盐,可以促进包括人类在内的动物体细胞的重编程,维持细胞干性,进而促进毛囊周期的进行,加速毛囊再生,增加毛囊数量,从而带来促进生发、预防或治疗脱发的效果。例如,据悉细胞的干细胞能,尤其通过β-连环蛋白信号转导过程,针对生发及/或毛囊的形成起着重要的作用,从而赋予干细胞性,并维持这种状态,是调节生发、毛发再生及/或毛囊形成的因素(naturecellbiology,2017,19:1017-1027;invivo,2019,33:1209-1220)。与此相关,在本发明的具体实施例中,已确认胍衍生物化合物能够促进体细胞的重编程,维持干细胞的细胞干性,即,这些化合物通过调节生发、毛发再生及/或毛囊的形成,带来了可以促进生发、预防或治疗脱发的效果。进而,为了更具体地确认这些,通过将这些化合物应用于细胞水平和动物模型,确认了在毛囊中增加β-连环蛋白的表达、增加毛囊数量、实际能够促进生发及/或生发的效果。本说明书中使用的术语“促进生发”是指毛发生成,用于表达毛发生成速度和生成数量的增加。另外,意味着发根功能得到强化,或毛发脱落和生成周期缩短,从而毛囊中生长的毛发数量增加,进而毛囊数量增加。与现有作为生发促进剂使用的米诺地尔相比,所述药物组合物能够缩短生发和脱落周期中的休止期,促进成长期的进入,对促进生发有卓越的功效。另外,所述组合物包括皮肤问题在内,没有出现任何副作用。在本发明的一个实施方式中,所述药物组合物可以以1至5%的浓度包含化学式1的化合物或其药学上可接受的盐,特别是以1至4%或1至3%的浓度。在本发明的一个实施方式中,所述药物组合物,可以促进细胞重编程或维持细胞干性。另外,所述药物组合物,能够促进毛囊再生,促进生发。在本发明的一个实施方式中,所述组合物增加由β-连环蛋白、shh(音速刺猬蛋白)、hk2(己糖激酶2)、ldha(乳酸脱氢酶a)、ndus3(nadh脱氢酶铁硫蛋白3)、atp5b(atp合酶亚基β)、wnt1a、lef-1(淋巴增强子结合因子1)、gli-1(gli家族锌指1)、多功能蛋白聚糖(versican)、pdh(丙酮酸脱氢酶)和pdk(丙酮酸脱氢酶激酶)组成的组中的一种或多种的表达。具体而言,所述药物组合物能够增加传播毛囊再生及发育的β-连环蛋白和shh、糖酵解作用-相关酶hk2和ldha、oxphos-相关酶ndus3和atp5b、以及参与毛囊发育的细胞干性-相关基因wnt1a、lef-1、gli-1及多功能蛋白聚糖的表达,并且能够增加促进糖酵解作用转换的酵素pdk和针对线粒体oxphos反应的酵素pdh的表达。相比现有作为生发促进剂使用的米诺地尔,能够以更好的效果促进上述因子的表达,从而给促进生发带来卓越的功效。所述药物组合物能够促进毛囊发育相关基因的表达,并激活用于毛发再生的各种信号。另外,通过直接刺激干细胞代谢,促进糖酵解作用,能够进一步促进oxphos。从而,所述药物组合物能够为生发所需的活性能量代谢做出贡献。所述药物组合物可以以药学上有效量施用,而上述“药学上有效量”是指以适用于医学治疗的合理受惠/危险比率足以治疗疾病的剂量。这可以根据患者的疾病种类、重症度、年龄、性别、药物活性度、对药物的敏感度、施用时间、施用路径及排出比率、治疗时间、同时使用的药物等因素及其他医学领域众所周知的因素来决定。所述药物组合物可单独或与其他治疗剂并用,可与现有的治疗剂依次或同时投入。考虑上述因素,以无副作用的最低剂量获得最大效果的剂量的施用至关重要,这可以由本
技术领域
的人员轻松决定。例如,可根据施用路径、疾病重症度、性别、体重、年龄等进行增减,因此,上述施用剂量并不以任何方法来限制本发明范围。本说明书中使用的术语“药学上可接受的盐”是指保留上述化合物中期望的生物学和/或生理学活性且不期望的毒理效果则呈现最小的所有盐。可以是利用有机酸或无机酸形成的加成盐,上述有机酸例如可包括甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、丁酸、异丁酸、三氟乙酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、富马酸、丁二酸、丁二酸单酰胺、谷氨酸、酒石酸、乙二酸、柠檬酸、羟基乙酸、葡萄糖醛酸、维生素c、苯甲酸、邻苯二甲酸、水杨酸、邻氨基苯甲酸、二氯乙酸、氨基羟基乙酸、苯磺酸、对甲苯磺酸及甲磺酸类盐。另外,上述无机酸例如可包括盐酸、溴酸、磺酸、磷酸、硝酸、碳酸及硼酸类盐,理想的是盐酸盐或乙酸盐形态,更理想的是盐酸盐形态。例如,根据本发明提供的组合物还可包括通常用于制造药物组合物的适当的载体、赋形剂和稀释剂。所述组合物为灭菌或无菌性,这种溶液为灭菌或无菌性,当适用于水、缓冲剂、等张剂或动物或人时,可包括不引起过敏或其他有害反应且本
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的熟练者众所周知的其他成分。本说明书中使用的术语“药学上可接受的载体”,包括任意所有溶剂、分散介质、覆盖物、抗菌剂、抗真菌剂和等张剂等。作为药学活性物质使用上述介质和制剂,在本
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是众所周知的。除活性成分和非混合性常规介质或制剂外,还考虑在治疗学组合物中使用它。另外,还可将补充性活性成分混入该组合物中。所述组合物可制备为液剂、乳剂、悬浮剂或乳霜剂等剂型,可用于非口服。所述组合物的使用量可按照预防及治疗脱发的常规使用量来使用,最好是根据患者的年龄、性别、状态、体内活性成分的吸收度、不活性率及并用药物等适宜使用。在本发明的一个实施方式中,所述药物组合物最好是制备为非口服制剂,可制备为期望生发的部位局部使用的皮肤外用剂或皮下注射剂。在本发明的一个实施方式中,上述皮肤外用剂可制备为是选自由霜剂、凝胶剂、贴剂、喷雾剂、软膏剂、硬膏剂、乳液剂、擦剂、糊剂及泥敷剂组成的组中的制剂中的任一种。另外,所述药物组合物可作为皮下注射剂使用,上述皮下注射剂可利用常规注射针进行皮下注射。另外,也可利用直径为数十~数百μm,长度为数十~数千μm大小的多个微针排列在一起的微针阵列,直接注射到期望生发的部位。根据本发明的另一方面,提供一种将上述化学式1的化合物或其化妆品学上可接受的盐作为有效成分,促进生发或者预防或改善脱发的化妆品组合物。本说明书中使用的术语“化妆品学上可接受的盐”,相同于上述“药学上可接受的盐”所定义。上述化妆品组合物,可制备为生发油、发乳、护发乳液、洗发露、护发素、润发精、发胶、发膜、焗油膏、香皂、眉毛生发剂、眉毛营养剂、眼睫毛生发剂和眼睫毛营养剂等。另外,上述化妆品组合物根据各个剂型,可包含表面活性剂、维生素、防腐剂、增粘剂、ph调节剂、香料、色素等配合常规化妆品组合物的各种成分。根据本发明的另一方面,提供一种将上述化学式1的化合物或其营养学上可接受的盐作为有效成分,促进生发或者预防或改善脱发的食品组合物。本说明书中使用的术语“营养学上可接受的盐”,相同于上述“药学上可接受的盐”所定义。本发明提供的食品组合物可作为健康功能食品使用。上述“健康功能食品”是指根据健康功能食品相关法律使用对人体有用的功能性原料或成分制造加工而成的食品,“功能性”是指针对人体结构及功能调节营养素,或以获得生理学功效等保健用途有用的效果为目的摄入。本发明提供的食品组合物可包括常规食品添加物,上述作为“食品添加物”的适宜与否,除非有其他规定,根据食品医药品安全处批准的食品添加物准则的总则及一般实验法等,基于该品种相关的规格及标准来进行判断。上述“食品添加物准则”中所记载的品种包括:酮类、甘油、柠檬酸钾、烟酸、桂皮酸等化学合成物、感色素、甘草提取物、结晶纤维素、高粱色素、胍胶等天然添加物、l-谷氨酸钠制剂、面类添加碱剂、保存剂制剂、焦油色素制剂等混合制剂类。本发明提供的食品组合物,相对组合物总重量,可包含胍衍生物或其营养学上可接受的盐0.01至95重量%,理想为1至80重量%。并且,本发明提供的食品组合物所含有的胍衍生物或其营养学上可接受的盐,可通过与所述药物组合物制备中提到的提取方法相同或相似的方法获得,但并不限于此。另外,本发明提供的食品组合物,以促进生发及/或改善脱发为目的,可以制备加工为片剂、胶囊、粉末、颗粒、液态、丸等形态。例如,上述片剂形态的健康功能食品,可通过常规方法将胍衍生物或其营养学上可接受的盐、赋形剂、粘合剂、崩解剂及其他添加剂的混合物颗粒化,然后,加入润滑剂等进行压缩成型,或直接压缩成型上述混合物。另外,上述片剂形态的健康功能食品可根据需要含有矫味剂等,也可根据需要以适当的涂层剂涂层。胶囊形态的健康功能食品中,硬质胶囊剂可在常规硬质胶囊中填充粉状胍衍生物或其营养学上可接受的盐、及赋形剂等添加剂的混合物或其颗粒物或涂层的颗粒物制备而成,软质胶囊剂可在明胶等胶囊基剂中填充胍衍生物或其营养学上可接受的盐及赋形剂等添加剂的混合物制备而成。上述软质胶囊剂可根据需要含有甘油或山梨糖醇等可塑剂、着色剂、保存剂等。丸状健康功能食品,可通过胍衍生物或其食品上可接受的盐、赋形剂、粘合剂、崩解剂等混合物以适当的方法成型调制而成,并可根据需要用白糖或其他适当的涂层剂涂层,或用淀粉、滑石粉或适当的物质包衣。颗粒状的健康功能食品,可通过胍衍生物或其营养学上可接受的盐、赋形剂、粘合剂、崩解剂等混合物以适当的方法制备为粒状,并可根据需要含有香料、矫味剂等。颗粒状的健康功能食品,可利用12号(1680μm)、14号(1410μm)及45号(350μm)筛子,在进行下一次颗粒分析实验时,使其全部通过12号筛子,留在14号筛子上的占总量的5.0%以下,另外通过45号筛子的占总量的15.0%以下。上述赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、香料等相关术语的定义,可包含本
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众所周知的文献中所记载且其功能等相同或相似的内容(大韩药典解说篇,文成社,韩国药学大学协议会,第5修订版,p33-48,1989)。上述食品的种类不特别限制,可添加本发明提供的提取物的食品包括:饮料、口香糖、维生素复合剂、饮料剂等,通常意义上包括所有健康功能食品。根据本发明的另一方面,提供一种将上述化合物或其营养学上可接受的盐作为有效成分,促进生发或者预防或改善脱发的饲料组合物。本说明书中使用的术语“饲料”是指动物摄取的食物,具体意味着维持动物的生命或供给生产肉、奶等所需的有机或无机营养素的物质。上述材料可包括饲料添加剂,可以本
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众所周知的多种形态制备。上述饲料的种类不特别限制,可使用本
技术领域
通常使用的饲料。上述饲料的非限制性例子包括:谷物类、根茎类、食品加工副产品类、禽类、纤维类、油脂类、淀粉类、粕类或谷物副产品类等植物性饲料;蛋白质类、无机物类、油脂类、矿物性类、油脂类、单细胞蛋白质类、动物性浮游生物类或食物等动物性饲料。这些可单独使用或混合使用2种以上。另外,上述本发明提供的化合物或其营养学上可接受的盐,可用作添加于饲料组合物的饲料添加剂使用。上述饲料添加剂可以是为了提高对象动物的生产率或增进健康,但并限于此。上述饲料添加剂可属于饲料管理法中的辅助饲料。本说明书中的饲料添加剂,可追加混合使用柠檬酸、富马酸、脂肪酸、乳酸等有机酸或多酚、儿茶酚、维生素e、维生素c、绿茶提取物、壳聚糖、单宁酸等天然抗氧化剂中一种以上成分,并可根据需要添加缓冲剂、抑菌剂等其他常规添加剂。另外,根据需要可制备为液态、胶囊、颗粒或片剂。上述饲料或饲料添加剂还可追加包括含有补充营养素及预防体重减少、增进饲料内纤维素的消化利用性、改善油质、预防繁殖障碍及提高受孕率、预防夏季高温压力等多种效果的物质。例如,氨基酸、无机盐类、维生素、抗氧化、抗霉素、微生物制剂等各种辅助剂及粉碎或破碎的小麦、大麦、玉米等植物蛋白质饲料、血粉、肉粉、鱼粉等动物性蛋白质饲料、动物性脂肪及植物性脂肪等主要成分外,还可与营养补充剂、生长促进剂、消化吸收促进剂、疾病预防剂一起使用。本说明书的饲料及饲料添加剂可达到包括哺乳类、家禽类在内的多数动物的级别。例如,为了维持或改善美观,可用于牛、山羊等家畜;狗、猫等宠物,但并不限于此。根据本发明的另一方面,提供一种包括将上述化学式1的化合物或其药学上可接受的盐作为有效成分的药物组合物施用于有需要的受试者,促进生发或者预防或治疗脱发的方法。本发明中的术语“预防”是指通过施用本发明提供的组合物,抑制或延迟脱发的发生、扩散和复发的所有行为,“治疗”是指通过施用本发明提供的组合物,导致上述症状好转或有利变更的所有行为。本发明中的术语“个体”是指包括已发生或可能会发生上述脱发的人类在内的猴子、牛、马、羊、猪、鸡、火鸡、鹌鹑、猫、狗、小鼠、老鼠、兔子或天竺鼠等所有动物,通过向个体施用本发明提供的药物组合物,可有效预防或治疗上述疾病。本发明提供的药物组合物可与现有治疗剂并行施用。本发明中的术语“施用”是指以任何适当的方法向患者提供所定的物质,本发明提供的组合物的施用途径只要能达到目的组织,就可以通过任何常规途径进行施用。腹腔内施用、静脉内施用、肌肉内施用、皮下施用、血液内施用、口服施用、局部施用、脾内施用、肺内注射、直肠内施用,但并不限于此。另外,本发明提供的药物组合物还可通过供活性物质移动到目标细胞的任意设备施用。根据本发明的另一方面,提供一种上述化学式1的化合物、其药学上可接受的盐或将其作为有效成分的药物组合物的促进生发或者预防或治疗脱发的用途。本发明的甚至另一方面提供一种上述化学式1的化合物、其药学上可接受的盐或将其作为有效成分的药物组合物用于制备促进生发或者预防或治疗脱发的药品的用途。以下,通过以下实施例进一步详细说明本发明。但是,这些实施例仅用于示例目的,并且本发明的范围并旨在受这些实施例的限制。试剂准备作为胍衍生物,合成了(n-1-(2-甲基)苯乙基双胍(以下称为“im176out05”或“im”)、n-1-(3,4-二氯)苯乙基双胍(以下称为“im176out04”)及1-(3,4-二甲基苯乙基)胍(以下称为“im177out02”)。所述合成各自与韩国专利公开号10-2016-0146852(2016.12.21)的实施例22、实施例1及实施例133相同。另外,从hyundaipharm(seoul,republicofkorea)购买米诺地尔,并从caymanchemical(annarbor,mi,usa)购买二甲双胍。本发明的胍衍生物、米诺地尔和二甲双胍的化学结构式如图1所示。实施例1.胍衍生物的重编程效果实施例1.1.小鼠细胞中胍衍生物重编程效果的比较经确认,当鱼藤酮(etc复合物i抑制剂)的亚毒性剂量(10nm)的时候,促进有效的体细胞重编程,针对生成ipsc的鱼藤酮和本发明的胍衍生物的效果进行了如下比较(图2)。在小鼠胚胎成纤维细胞(mef)中导入oskm重编程因子,重编程为ipsc的期间,以标记的浓度处理了鱼藤酮、本发明的胍衍生物和苯乙双胍。14日后,完成碱性磷酸酶(ap)染色(图2a),并定量ap+菌落数的结果(图2b),im156和苯乙双胍并没有显示出促进重编程的效果,相反,由于im176out05、im176out04和im177out02的处理,反而增加了ap+菌落数。尤其,将im176out05(以下简称im)以10nm、20nm和50nm浓度处理时,分别显示了以16.8倍、13.9倍和13.7倍的效率提高重编程的效果,此后,实验只使用了上述有效提高重编程效果的3种化合物,并进行了追加的功效评价。实施例1.2.人类细胞中胍衍生物重编程效果的确认在人类包皮成纤维细胞(hff)中导入oskm重编程因子,重编程为ipsc的期间,针对通过上述实施例1.1.已确认对小鼠细胞的重编程效果的im176out05、im176out04和im177out02,以标记的浓度进行了处理。28日后,完成ap染色(图3a),并定量ap+菌落数的结果(图3b),3种化合物都是以10nm浓度处理时显示出了最优秀的重编程效果,尤其,经确认,以10nm、100nm和500nm浓度处理im176out05时,显示出了都以2.4倍以上的效率提高重编程的效果。实施例1.3.胍衍生物的细胞干性维持效果的确认另外,已确认本发明提供的化合物对维持人类胚胎干细胞(hesc)的细胞干性的功效(图4)。具体而言,如果将hesc培养在非条件培养基(um),就会失去细胞干性,削弱ap活性,相反,(图4a),im176out05,im176out04和im177out02处理时,能够从低容量增加ap染色。尤其,经确认,以10nm和100nm浓度处理im176out05时,分别显示出以7.6倍和8.2倍提高的细胞干性维持效果(图4b)。通过以上实施例1.1.至1.3.的结果可知,在小鼠和人类的ipsc生成过程中,10nm的im176out05不仅最有效地提高了重编程效率,还显示了人类胚胎干细胞的细胞干性维持效果,此后实施例利用上述条件进行后续研究。实施例2.im176out05的毛发再生效果实验实施例2.1.毛发再生模型7周龄c57bl/6小鼠(daehanbiolink,chungbuk,republicofkorea)的毛发休止期(telogen)时,使用动物用剪具和发蜡(veet,oxyrecritbenckiser,seoul,republicofkorea)对背部皮肤毛进行除毛。自第二天,用已除菌的棉棒,每天将200μl安慰剂(对照群)、1%im、1%米诺地尔或1%二甲双胍适用于除毛部位。每天捕捉各动物的形象,利用imagejprogram,在同一领域(1.6x3cm)针对背部颜色的黑暗程度进行定量化。牺牲小鼠,获得第0、7、14和20日的皮肤组织。组织的一半用于rna分离,剩下的一半则为了组织化学分析,用4%多聚甲醛固定一整夜。实施例2.2.组织学分析将上述实施例1.1.中固定的组织沉积到30%的蔗糖后,插入(embedded)在oct化合物(sakurafinetekusainc,torrance,ca,usa)中。使用低温维持装置(cryostatsection)(leica,wetzlar,germany),获得冻结切片,并利用苏木精(sigma)和伊红(sigma)(h&e)或以下表1中提出的各个抗体,进行染色。完成免疫组织化学分析,并用olympus显微镜(olympus)拍摄荧光图像。表1抗体目录编号公司名称稀释比例抗角质蛋白15ab52816abcam1:100抗β-连环蛋白cab32572abcam1:200抗β-连环蛋白(facs)ab22656abcam1:500抗ki67ab15580abcam1:200抗shh(ihc)sc-9024santacruz1:80抗shh(facs)ab135240abcam1:300抗pdksc-7140santacruz1:50抗pdh(兔免疫球蛋白g)sc-292543santacruz1:50抗pdh(小鼠免疫球蛋白g)sc-377092santacruz1:50正常兔免疫球蛋白g#2729cellsignalingtechnology1:500抗组蛋白抗体h3#4620cellsignalingtechnology1:50抗三甲基组蛋白h3(lys4)04-745millipore1:200抗三甲基组蛋白h3(lys27)07-449millipore1:200抗二甲基组蛋白h3(lys9)07-441millipore1:200抗nanoga300-397abethyllab1:250抗ssea1mab2155r&dsystems1:200实施例2.3.组织形态定量测试根据正确分类毛发周期阶段的方针,通过各个小鼠(n>10)的纵断面上的h&e染色显微镜照片,对每个毛囊进行分类,使毛发周期定量化。计算各群毛发成长期(anagen)的百分比。用各小鼠(n>10)横断面上的h&e染色显微镜照片,计数同一领域(1300μm宽度)中的毛囊。实施例2.4.facs分析将pbs灌入小鼠,去除血液后,获取皮肤组织,切成小块。将组织在37℃下用胰蛋白酶分解150分钟后,用75μm尼龙网状物过滤,再用30μm网状物(bdbiosciences)过滤。将单一细胞根据免疫染色协议固定、透析化、阻断。将细胞染色为特定抗体(上述表1),用bdaccuritmc6(bdbiosciences)进行分析。实施例2.5.耳廓穿孔(punch)分析为了进行耳廓组织修复分析,利用穿孔器具(解剖针(finesciencetools),britishcolumbia,canada),在每个耳朵上穿三个2mm直径的孔。每天用已杀菌的棉棒适用指定浓度的im。用数显卡尺(digitalcalipers)(vwr,radnor,pa,usa)测量孔面积。统计学分析所有的数据都代表重复实验的3个以上独立生物学数据。所有动物实验,在n>5的处理群中独立重复实验6次。用于比较群间的student'st-test,p<0.05表示统计显著性。实施例3.im176out05的毛发再生效果的确认实施例3.1.小鼠基于im176out05的生发促进效果通过小鼠实验,确认im化合物在不显示毒性或其他副作用的情况下,是否能够促进生发。7周龄c57bl/6小鼠通过除毛休止期阶段的毛发来实现同步,并每天将多种浓度的im涂抹于小鼠背部皮肤上。第9日,在使用1%im的部位,黑色色素沉着和生发得到了显著的确认(图9)。另外,对比im和现有生发促进剂米诺地尔的功效的结果显示,在雄性和雌性小鼠中均可促进生发。尤其,im在雌性小鼠中对生发表现出强力的促进效果。具体而言,im处理的第8日,相比对照群或米诺地尔-处理的小鼠,im-处理的小鼠中的肤色明显变暗。另外,第10日,通过im处理,毛发的生长得到了明显的促进(图5)。与此相反,追加进行独立实验的结果显示,对于雌性小鼠,im比米诺地尔效果更优秀(图10)。相反,对于雄性小鼠,im的效果与米诺地尔相似(图11a和图11b)。此外,针对生发,对比im和其他双胍衍生物二甲双胍的结果显示,从第8日开始,相比对照群,二甲双胍-处理的小鼠的背部皮肤的黑暗强度有所增加,但并未显现显著效果(图13a和图13b)。实验期间,im-处理的小鼠没有观察到包括皮肤问题在内的任何副作用。实施例3.2.小鼠基于im176out05的毛囊再生促进效果通过组织形态测量分析组织的结果显示,im能够刺激毛囊周期的进行(图6a)。第20日,在纵断面上,在对照群小鼠中,毛囊的大部分定量出现在成长期iii中,而在im-处理的小鼠中,毛囊的大部分主要出现在成长期后期的成长期v和vi阶段(图6b)。另外,第7日,在横断面上,相比对照群,im-处理的小鼠的毛囊数量明显增加(图6c),第20日,相比对照群,im-处理的小鼠或米诺地尔-处理的小鼠的毛囊数量明显更多(图6d)。进一步,第7日,毛囊干细胞的标记角蛋白15(k15),相比对照群或米诺地尔-处理的小鼠,在im-处理的小鼠的毛囊突出部领域表达更强(图7a)。另外,第7日,毛囊再生为媒介的β-连环蛋白的表达,在im-处理的小鼠中显示增加。此时,在im-处理的小鼠中发现了ki67-阳性增殖细胞,这表明毛囊周期和增殖前体细胞的追加增殖(expansion)因im而得到了增加(图7a)。通过facs分析定量化k15+/β-连环蛋白+群的结果显示,在对照群、im-处理的小鼠及米诺地尔-处理的小鼠皮肤的单一细胞中,分别占据了3.2%、11.7%和6.0%的细胞群(图7b)。这表明,相比对照群,在im-处理的小鼠中增加了3.7倍(图7b)。到20日为止,k15和β-连环蛋白在所有小鼠群中被明确检测出(图7c),k15+/β-连环蛋白+群在所有群中均检测出24%以上(图7d)。用于毛囊发育的另一个必需因素shh(音速刺猬蛋白),在im-处理的小鼠或米诺地尔-处理的小鼠中被明确检测出(图7c)。第7日,在所有小鼠群中,ki67+/shh+群显示为不足5%(图7b),但到了第20日,对照群、im-处理或米诺地尔-处理的小鼠皮肤的单一细胞中,分别增加到13.8%,36.7%和34%(图7d)。第20日,ki67+/shh+群,相比对照群,在im-处理的小鼠中增加了2.7倍(图7d)。实施例3.3.在毛囊再生初期阶段基于im176out05的干细胞代谢及增殖前体细胞的增殖活性效果众所周知,k15阳性毛囊干细胞表达促进糖酵解作用转换的酵素—丙酮酸脱氢酶激酶(pdk),而ki67-阳性增殖细胞则强烈表达对线粒体oxphos反应的酶素—纤维素脱氢酶(pdh)。第7日,pdk的表达从im-处理的小鼠的k15-阳性干细胞中检测出,但是未从对照群或米诺地尔-处理的小鼠中检测出(图8a)。第7日,进行facs分析的结果显示,虽然k15+/pdk+群未从对照群或米诺地尔-处理的小鼠中检测出,但在im-处理的小鼠皮肤的单一细胞中可以确认以5.9%的细胞群占有(图8c)。从而,可确认im-处理的小鼠相比对照群,至少增加了6.6倍以上糖酵解作用干细胞群(k15+/pdk+)。第7日,在im-处理的小鼠的ki67-阳性增殖细胞中明确确认pdh表达,(图8a),第20日,在所有群的增殖细胞中检测到很高(图8b)。另外,第7日,ki67+/pdh+群在im-处理的小鼠中增加13.7%,而在对照群和米诺地尔-处理的小鼠忠分别只增加5.0%和8.3%(图8c)。进而,对各标记的相互表达模式进行分析的结果显示,第20日,从im-处理的小鼠中分别独立检测出k15/pdh和ki67/pdk的表达(图12a),这表明pdk表达糖酵解作用k15-阳性毛囊干细胞和pdh表达oxphos-依赖性ki67-阳性增殖细胞相互明确区分。进一步,通过facs分析可确认,pdk+细胞群和ki67+细胞群明确分离,各个群在第20日通过im-处理或米诺地尔-处理得以增加(图12b)。另外,还可检测出pdh+细胞和k15+细胞分离的群在第20日通过im-处理或米诺地尔-处理得以增加(图12b)。实施例3.4.基于im176out05的代谢及毛发再生相关基因的表达效果通过各个小鼠群的皮肤组织分析了代谢及毛发再生相关基因表达程度。糖酵解作用-相关酶(hk2及ldha)的表达,第7日,在im-处理的小鼠中明显诱导,第20日,相比对照群,在im-处理及米诺地尔-处理的小鼠中均显著增加。在此阶段,oxphos-相关酶(ndus3和atp5b)的表达,相比对照群,在im-处理的小鼠和米诺地尔处理的小鼠中均有所增加。这表明im能够促进毛囊再生初期阶段的糖酵解作用,进一步促进之后阶段的oxphos,从而为生发所需的活性能量代谢做出贡献。参与毛囊发育的细胞干性-相关基因(wnt1a,lef-1,gli-1和蛋白聚糖(versican)的表达,第7日,在im-处理的小鼠皮肤上明显得到提升,米诺地尔-处理的小鼠也比对照群有所增加了(wnt1a,lef-1和gli-1)的表达。第20日,im-处理的小鼠和米诺地尔处理的小鼠均比对照群显著诱导了上述细胞干性-相关基因(图8d)。实施例3.5.基于im176out05的组织再生效果im对组织再生的影响,通过耳廓组织修复来进行了观察。结果显示,im依赖容量来减少耳廓的伤口面积。从而可知,除了激活生发外,im还可以激活组织再生(图14)。基于这些结果,im可以修复因脱发而受损的毛囊组织,从而可提前预防可能会发生的损伤。本领域技术人员将认识到,在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下,本发明可以以其他特定形式实施。所描述的实施方式在所有方面仅应被认为是说明性的而非限制性的。因此,本发明的范围由所附的权利要求书而不是前面的说明书指示。落入权利要求书的等同含义和范围内的所有改变均应包含在本发明的范围内。当前第1页12
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