用于细胞识别和整合的核酸

交叉引用

本申请要求于2019年7月18提交的美国临时专利申请号62/875,887以及于2018年9月25日提交的62/736,323的权益，这些申请出于所有目的通过引用以其整体并入本文。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ascii格式电子提交，并且通过引用以其整体并入本文。所述ascii副本创建于2019年9月23日，命名为54774-702_601_sl.txt，大小为793,770字节。

背景技术：

转座元件(te或转座子)是一种dna序列，其可以改变其在基因组中的位置，有时会产生或逆转突变并改变细胞的遗传同一性和基因组大小。转座元件先前已与包括癌症在内的各种疾病相关，但需要更好地了解它们与疾病发作的关系(如果存在)。例如，癌症是美国第二大最常见的死亡原因，每天有1,600多例与癌症相关的死亡，每年接近600,000例。2015年诊断出约165万的新癌症病例，并且由于人口因素和生活方式因素，癌症的发病率正在增加。因此，对于检测和治疗癌症以及其他慢性、感染性或年龄相关性疾病的灵敏、有效且尤其是细胞、组织和/或器官特异性的组合物和方法存在未满足的需求。

技术实现要素：

在多个方面，本公开内容提供了包含脱氧核糖核酸序列的核酸构建体，该脱氧核糖核酸序列指导该构建体在体内(向性)迁移至靶组织。该构建体可包含衍生自转座子的两个或更多个序列，例如3’序列和5’序列，以用于整合到靶组织的细胞中。

在多个方面，本公开内容描述了多种药物组合物，该药物组合物包含指导该构建体在体内(向性)迁移至靶组织或靶细胞的序列。在一些情况下，本公开内容提供了一种药物组合物，包含治疗有效量的核酸构建体，所述核酸构建体包含a)第一脱氧核糖核酸(dna)序列，所述第一脱氧核糖核酸序列指导所述核酸构建体在体内迁移至预选组织；以及b)第二脱氧核糖核酸序列，所述第二脱氧核糖核酸序列指导所述核酸构建体的区域在体内整合到所述预选组织的细胞的基因组中；其中组合物被配制用于施用至受试者。在一些实施方案中，所述第一脱氧核糖核酸序列来自与所述预选组织的所述细胞相同的细胞类型。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述第一脱氧核糖核酸序列迁移至白细胞。在一些实施方案中，所述第一脱氧核糖核酸序列迁移至胰腺细胞。在一些实施方案中，所述第一脱氧核糖核酸序列迁移至肺细胞。在一些实施方案中，当施用至所述受试者时，所述核酸构建体穿过所述预选组织的所述细胞的核膜。在一些实施方案中，所述第一脱氧核糖核酸序列与seqidno:203–seqidno:277和seqidno:282中任一个的至少12个碱基具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，所述第一脱氧核糖核酸序列的长度为至少400个碱基对。在一些实施方案中，所述第一脱氧核糖核酸序列的长度为400个碱基对至20,000个碱基对。在一些实施方案中，所述第二脱氧核糖核酸序列与转座子序列具有至少90％的同源性。在一些实施方案中，所述转座子是ii型转座子。在一些实施方案中，所述ii型转座子通过水平基因转移将自身整合到所述预选组织的所述细胞的所述基因组中。在一些实施方案中，所述核酸构建体包含至少一个另外的脱氧核糖核酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个另外的脱氧核糖核酸序列包含组织选择性启动子。在一些实施方案中，所述至少一个另外的脱氧核糖核酸序列包含用于并入所述基因组的第二整合信号。在一些实施方案中，所述至少一个另外的脱氧核糖核酸序列包含编码肽或蛋白的序列。在一些实施方案中，所述至少一个另外的脱氧核糖核酸序列包含用于确保所述肽或蛋白仅在所述预选组织的所述细胞内表达的序列。在一些实施方案中，所述肽或所述蛋白编码肿瘤抑制肽或肿瘤抑制蛋白。在一些实施方案中，所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是多发性骨髓瘤肿瘤抑制基因。在一些实施方案中，所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是胰腺癌肿瘤抑制基因。在一些实施方案中，所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是肺癌肿瘤抑制基因。在一些实施方案中，所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是视网膜母细胞瘤易感基因(retinoblastomasusceptibilitygene，rb)、肾母细胞瘤(wt1)、神经纤维瘤病1型(nf1)、家族性腺瘤性息肉病(familialadenomatosispolyposiscoli，fap)、vonhippel-lindau综合征(vonhippel-lindausyndrome，vhl)、野生型p53或超阻遏物p53(superrepressorp53)中的任一种。在一些实施方案中，所述肽或所述蛋白编码抗原蛋白。在一些实施方案中，所述抗原蛋白在施用于所述受试者后在所述细胞中被特异性地翻译。在一些实施方案中，所述药物组合物还包含货物。在一些实施方案中，所述货物是荧光团或放射性同位素。在一些实施方案中，所述货物是治疗性药物。在一些实施方案中，所述货物共价连接至所述核酸构建体。在一些实施方案中，所述制剂包含纳米颗粒或阳离子聚合物。

在多个方面，本公开内容提供一种载体，包含第一序列或另外的核酸序列，所述第一序列与seqidno:203–seqidno:277或seqidno:282中任一个的至少12个碱基具有至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，所述另外的核酸序列与本文所述的转座子序列具有至少90％的同源性。在一些实施方案中，所述转座子是ii型转座子。在一些实施方案中，所述ii型转座子通过水平基因转移将自身整合到所述预选组织的所述细胞的所述基因组中。在一些实施方案中，所述载体包含至少两个另外的核酸序列。在一些实施方案中，所述至少两个另外的核酸序列包含组织选择性启动子和转座子序列。在一些实施方案中，所述至少两个另外的核酸序列包含至少两个转座子序列。在一些实施方案中，所述另外的核酸序列包含编码肽或蛋白的序列。在一些实施方案中，所述肽或所述蛋白编码肿瘤抑制肽或肿瘤抑制蛋白。在一些实施方案中，所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是多发性骨髓瘤肿瘤抑制基因。在一些实施方案中，所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是胰腺癌肿瘤抑制基因。在一些实施方案中，肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是肺癌肿瘤抑制基因。在一些实施方案中，所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是视网膜母细胞瘤易感基因(rb)、肾母细胞瘤(wt1)、神经纤维瘤病1型(nf1)、家族性腺瘤性息肉病(fap)、vonhippel-lindau综合征(vhl)、野生型p53或超阻遏物p53中的任一种。在一些实施方案中，所述载体共价连接至货物。在一些实施方案中，所述货物是荧光团或放射性同位素。在一些实施方案中，所述货物是治疗性药物。

在多个方面，本公开内容提供了两种或更多种所述载体的文库。

在多个方面，本公开内容提供了一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括：施用有效量的核酸构建体，所述核酸构建体包含指导货物迁移至患有所述癌症的受试者的组织的核酸序列，其中组合物被配制用于施用至受试者。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。在一些实施方案中，所述癌症是多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，所述癌症是胰腺癌。在一些实施方案中，所述核酸构建体在施用给所述受试者后穿过所述组织的细胞中的核膜。在一些实施方案中，指导所述货物迁移至所述组织的所述核酸序列与seqidno:203–seqidno:277或seqidno:282中任一个的至少12个碱基具有至少90％的同一性。在一些实施方案中，所述核酸构建体包含用于整合到所述组织的细胞的基因组中的转座子。在一些实施方案中，所述转座子的长度为至少400个碱基对。在一些实施方案中，所述转座子的长度为400个碱基对至20,000个碱基对。在一些实施方案中，所述转座子是ii型转座子。在一些实施方案中，所述核酸构建体包含与所述组织的细胞异源的至少一个另外的核酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个另外的核酸序列包含组织选择性启动子。在一些实施方案中，所述至少一个另外的核酸序列包含编码肽或蛋白的序列。在一些实施方案中，所述至少一个另外的核酸序列包含用于并入靶基因组的整合信号。在一些实施方案中，所述至少一个另外的核酸序列包含用于靶向所述细胞的指导序列。在一些实施方案中，所述至少一个另外的核酸序列包含编码肽或蛋白的序列。在一些实施方案中，所述肽或所述蛋白编码肿瘤抑制肽或肿瘤抑制蛋白。在一些实施方案中，所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是多发性骨髓瘤肿瘤抑制基因。在一些实施方案中，所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是胰腺癌肿瘤抑制基因。在一些实施方案中，所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是肺癌肿瘤抑制基因。在一些实施方案中，所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是视网膜母细胞瘤易感基因(rb)、肾母细胞瘤(wt1)、神经纤维瘤病1型(nf1)、家族性腺瘤性息肉病(fap)、vonhippel-lindau综合征(vhl)、野生型p53或超阻遏物p53中的任一种。在一些实施方案中，所述肽或所述蛋白编码抗原蛋白。在一些实施方案中，所述抗原蛋白在施用于所述受试者后在所述组织的细胞中被特异性地翻译。在一些实施方案中，所述核酸构建体共价连接至荧光团或放射性同位素。在一些实施方案中，所述核酸构建体共价连接至治疗性药物。

在一些情况下，本公开内容提供了一种包含第一dna序列和第二dna序列的核酸构建体，其中该第一dna序列可以是能够将构建体引导至特定的器官、组织和/或细胞的靶向序列，并且其中第二dna序列可以是能够将构建体的至少一个区域或部分整合到特定器官或组织的细胞的基因组中的整合序列。在一些情况下，第一(细胞靶向/识别)dna序列和第二(整合)dna序列可以是zip编码序列(zipcodesequence，zcs)、转座子或转座元件的一部分。该zcs或转座子可以包含细胞靶向和识别序列，该细胞靶向和识别序列可以包含与seqidno:203–seqidno:277或seqidno:282中任一个具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性或与其片段具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。该片段的长度可以为至少约8、10、12、15、20、25或30个核苷酸。在一些情况下，该转座子可以是ii型转座子。

在一些情况下，该核酸构建体可以充当用于在癌细胞之间转移基因以及用于将货物(例如，核酸、蛋白质、小分子或纳米颗粒)转运到细胞中的载体，其中该细胞可以与第一核酸序列和/或第二核酸序列的来源(或分泌)细胞具有相同的来源。如本文进一步所述，将遗传物质(诸如ctdna)转移到细胞(例如，肿瘤细胞)中可以改变细胞的克隆构型，并可以确定该细胞(例如，肿瘤细胞)对于环境变化(诸如药物治疗)的发展。

在一些情况下，本公开内容还提供了本文所述的核酸构建体的各种令人惊讶和出乎意料的属性。该独特的属性可以包括向性，其在本文中可以定义为构建体靶向和/或进入与来源于第一(靶向)序列和/或第二(整合)序列的那些细胞具有相似起源的细胞的能力。在多个情况下，本文所述的核酸构建体的该靶向和/或整合序列可以来源于循环肿瘤dna(ctdna)。本文提供的构建体的该属性的另一示例可以包括区分相似起源的细胞和源自不同组织或器官的细胞的能力。作为示例，相比于诸如胰腺癌、肺癌或结肠癌等其他肿瘤的细胞，包含来源于源自多发性骨髓瘤(mm)肿瘤细胞的ctdna的第一dna序列和第二dna序列的核酸构建体能够高特异性地靶向、进入和/或整合到mm细胞的基因组中。该特异性可以为至少约80％、85％、90％、95％、97％或99％。此外，该构建体可以靶向来自不同细胞系的mm细胞。同样地，例如，mm特异性核酸构建体可用于在体外例如将货物转运到mm细胞(例如，mm1s细胞)中，或用于在体内将货物转运到受试者(例如，啮齿类动物或人)的肿瘤的mm细胞中。

本公开内容还提供了可用于识别该独特的靶向和/或整合序列(例如，zcs或转座子)的功能测定，该靶向和/或整合序列分别允许细胞靶向和识别以及插入到细胞(例如，癌细胞)的基因组中。例如，用于递送系统的细胞特异性识别序列和/或基因组整合序列可以如本文实施例2所述被识别。在一些情况下，可用于生成该靶向和/或整合序列的ctdna可以获自受试者，例如获自受试者的血浆。该受试者可以是人。人受试者可以是已被诊断患有诸如癌症疾病的受试者。在一些方面，本公开内容提供了一种用于鉴定(向性)迁移至基本相似来源的组织或细胞的核酸序列的方法，包括：(a)从生物样品中分离循环肿瘤核酸，从而产生一组分离的肿瘤核酸；(b)向所述一组分离的循环肿瘤核酸添加条形码，从而提供多个条形码化的肿瘤核酸；(c)在允许整合组织嗜性序列(tissuetropicsequence)的条件下，将来自所述多个条形码化的肿瘤核酸的至少一个条形码化的肿瘤核酸添加到细胞群中，从何产生培养的细胞群；(d)对所述培养的细胞群进行测序，从而产生多个测序读段；(e)通过计算机分析所述测序读段，以鉴定来自包含条形码的所述多个测序读段的至少一个测序读段是否存在；以及(f)分析包含所述条形码的测序读段，以鉴定存在于所述培养的细胞群而不存在于所述细胞群的序列是否存在，从而鉴定迁移至感兴趣的所述组织或所述细胞的所述核酸序列。

在一些实施方案中，本公开内容提供了合成生成的转座子，其可来源于该ctdna并且可用于将货物(例如，核酸、蛋白质、小分子或纳米颗粒)递送至一个或多个靶细胞。在一些情况下，且如本文所述，该合成生成的转座子或zcs(例如，oligo-zcs)可以是核酸构建体的一部分，该核酸构建体可用作在体内和体外将具有高特异性的货物递送至细胞(例如，癌细胞)的工具。因此，在一些情况下，该核酸构建体可以是递送系统的一部分。该递送系统可以具有一个或多个组分。该组分可以包括(i)包含第一dna序列和第二dna序列的zcs序列，该第一dna序列用于靶向特定细胞、细胞群或组织，该第二dna序列用于将该递送系统的至少一个区域或部分整合到该靶细胞、细胞群或组织的基因组中；(ii)启动子序列；以及(iii)一种或多种货物或其任何组合。该一种或多种货物可以包括(a)一个或多个核酸(例如，dna)序列，诸如可在该靶细胞或组织中表达的基因或基因片段，以及(b)一种或多种另外的货物，诸如蛋白质、纳米颗粒或小分子。图12示出了本文所述的递送系统的示例。在该系统中，待递送至靶细胞的货物(此处是基因，诸如抗原编码基因)可以连接至(例如，组织特异性)启动子序列和指导序列，该启动子序列和指导序列两侧为包含第一dna序列和第二dna序列的zcs和/或转座子，其中第一dna序列(例如，靶向或zip编码序列)能够进行细胞靶向，并且一旦系统到达细胞核，第二dna序列就能够将该系统整合到靶细胞的基因组中。

在一些情况下，本公开内容提供了可将特定性质转移至靶细胞的核酸构建体和系统。该性质包括靶细胞对环境变化的响应。该变化可以包括暴露于某些分子。该分子可以是药物分子，诸如小分子或蛋白质(诸如抗体)。这种转移或性质的示例包括从患者血浆到体外癌细胞系对药物的耐性或敏感性。这种令人惊讶和出乎意料的属性可允许设计非天然存在的核酸构建体，该核酸构建体包含用于将该构建体或该构建体的一部分递送或整合到靶细胞的基因组中的一个或多个(例如，2个、3个、4个等)zcs(或转座子)序列和一个或多个货物分子(诸如编码治疗性和/或诊断性蛋白的另外的核酸序列)。该靶细胞可以是癌细胞，并且货物核酸可以编码各种治疗蛋白，诸如用于癌细胞凋亡的胱天蛋白酶、用于免疫细胞识别或增强免疫疗法的抗原或其他蛋白质(诸如抗体、酶、细胞因子、信号分子等)。

本文所述的zcs或转座子序列可以包含一个或多个转座元件。该转座元件可以包括哺乳动物广泛散布重复(mammalian-wideinterspersedrepeat，mir)和藤黄节杆菌(arthrobacterluteus，alu)(诸如alusq)及其衍生物或功能片段。因此，在一些情况下，本公开内容提供了能够将货物递送至靶细胞(诸如肿瘤细胞)的合成mir寡核苷酸(oligo)。

援引并入

本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同具体地和单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。

附图说明

本申请文件包含至少一张以彩色制作的附图。专利局将在收到请求并支付必要的费用后提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。

在所附权利要求书中具体阐述了本发明的新颖特征。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细说明和附图(本文也称为“图”)，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在这些附图中：

图1显示，包含特定肿瘤细胞识别序列(例如，zip编码序列，本文也缩写为“zcs”)的循环肿瘤dna(ctdna)能够穿过细胞以及多发性骨髓瘤细胞(mm1s细胞)(图示为mm细胞+mmctdna)、肺癌细胞系(a549)(图示为lc细胞+lcctdna)和胰腺癌细胞系(spac01)(图示为pc细胞+pcctdna)中的核膜。

图2a示出了八个3d图像的时程，其证明了ctdna在胰腺癌细胞中的捕获和内化。

图2b示出了八个单平面图像的时程，其证明了ctdna在胰腺癌细胞中的捕获和内化。

图2c示出了八个3d影像图像的时程，其证明了ctdna在胰腺细胞中通过胞吞作用被捕获和内化。

图3a示出了从单平面影像拍摄的八个图像的时程，其证明了ctdna在aspc-1细胞中的核定位。

图3b示出了从单平面4小时时程拍摄的六个图像，其图示了ctdna在mm1s细胞中的核吸收。用绿色荧光蛋白(gfp)标记细胞膜。用dapi标记核。

图4图示了用从肺癌或mm患者提取的标记ctdna培养的a459(肺癌)和mm1(多发性骨髓瘤，mm)细胞。该图显示，各自的ctdna几乎专一地靶向与起源ctdna细胞相似的细胞。

图5a示出了证明ctdna整合到血浆细胞的染色体中的染色体分散图。

图5b是示出了dna依赖性蛋白激酶(dnapkcs)、共济失调毛细血管扩张突变(atm)、聚(adp-核糖)聚合酶i(parp-1)和拉替拉韦(raltegravir，一种整合酶抑制剂)对ctdna整合到染色体中的影响的图。

图5c显示ctdna的染色体整合可能取决于非同源末端连接(nhej)和转座酶。当存在dnapkcs、atm、parp-1和整合酶(拉替拉韦)的抑制剂时，显著降低标记的ctdna的掺入。在parp-1抑制的情况下，观察到无显著降低。

图6示出了图示识别共有序列(重叠群)的方案。图6按照出现的顺序分别公开了seqidnos280-281。

图7示出了两个细胞识别信号序列。左侧红色方框突出显示了存在于来源于多发性骨髓瘤(mm)的ctdna中，但不存在于来源于胰腺癌(pc)的ctdna中的两个相似变体的区域。右侧红色方框示出了在mm和pc(对照)中检测到的其他核酸序列。

图8a示出了来自多发性骨髓瘤、胰腺癌和对照细胞系的经鉴定的重叠群序列的树状图。索引重叠群示出了zip编码序列的定位、类型和存在。

图8b示出了染色体整合的区域，其机制可能与转座子有关和/或由转座子介导。此类指示包括以下观察结果：大多数插入的重叠群序列可能具有高含量的转座子；重叠群序列可能具有不同类型的转座子；整合可能取决于构型；以及重叠群和/或zc序列的细胞识别可能是受体介导的。

图9显示了在全身或局部施用后，存在于肿瘤中的罗丹明标记的ctdna构建体的共聚焦显微镜图像，包括ctdna在细胞核中的定位。

图9a显示了当将罗丹明标记的ctdna直接注射到肿瘤中后24小时的共聚焦显微镜图像。

图9b显示了当将罗丹明标记的ctdna经由尾静脉注射后24小时的共聚焦显微镜图像。

图9c显示了当将罗丹明标记的ctdna经由尾静脉注射后48小时的共聚焦显微镜图像。

图9d显示了在收获前24小时经尾静脉注射磷酸盐缓冲盐水(pbs)的荷瘤对照小鼠的共聚焦显微镜图像。

图10显示了在全身或局部施用后，存在于肿瘤中的罗丹明标记的ctdna构建体的共聚焦显微镜图像。

图10a显示了在收获前24小时经尾静脉注射pbs的荷瘤对照小鼠的共聚焦显微镜图像。

图10b显示了在收获前24小时经尾静脉注射时罗丹明标记的ctdna的共聚焦显微镜图像。

图10c显示了在收获前48小时经尾静脉注射时罗丹明标记的ctdna的共聚焦显微镜图像。

图11是说明包含组织特异性zip编码的构建体的内源整合机制的图。

图12是如本文所述的递送系统(例如，用于感兴趣的基因或抗原)的示例的图示，其包括zip编码区域(即，细胞靶向或细胞识别序列)、整合序列或整合区域、编码感兴趣的特定蛋白质的感兴趣基因，以及任选的用作额外安全措施以确保感兴趣蛋白质仅在靶细胞群中表达的指导序列。该图示出了细胞靶向信号序列和整合信号序列可以存在于3’末端或5’末端或其任意组合。

图13显示了由联合疗法引起的约50％的肿瘤大小变化，其中在施用包含多发性骨髓瘤(mm)zcs核酸分子(seqidno:282)和hsv-tk基因的基因构建体后48小时起施用更昔洛韦，持续5天，每天一次。

图13a和图13b显示了更昔洛韦治疗之前和5天之后的肿瘤大小的比较。

图13c显示了在接受了mmzip编码-hsv-tk基因疗法的两只小鼠(小鼠1#和小鼠2#)中测得的肿瘤体积的变化。更昔洛韦治疗导致两只动物的肿瘤体积显著减少。

图14a和图14b显示了在接受mmzip编码-hsv-tk基因疗法并在48小时后施用更昔洛韦(100μg/kg)治疗5天后，来自小鼠2#的多个组织的pcr结果。pcr结果清楚地显示，仅在肿瘤细胞和肿瘤组织中存在与单纯疱疹病毒胸苷激酶-1相对应的条带，而在本研究中分析的任何其他器官中均未显示该条带，这表明zip编码序列以及本文公开的相关构建体具有高的细胞和组织特异性。数字表示：(1)分子量梯，(2)肿瘤，(3)肺，(4)脾，(5)肝，(6)胰腺，(7)脑和(8)肾。

图15示意性地示出了组织和/或器官特异性的“zip编码”序列。本公开提供了细胞、组织和/或器官特异性的“zip编码”序列(在本文中也缩写为“zcs”)，其允许使用这样的zcs进行细胞、组织和/或器官特异性的靶向和/或递送。

图16a显示，多发性骨髓瘤(mm)来源的循环肿瘤dna(ctdna)以细胞和组织特异性方式归巢于mm细胞。红色突出显示的区域表示罗丹明标记的dna，蓝色区域显示dapi染色。

图16b显示，肺癌(lc)来源的循环肿瘤dna(ctdna)以细胞和组织特异性方式归巢于lc细胞。红色突出显示的区域表示罗丹明标记的dna，蓝色区域显示dapi染色。

图16c显示，来源于结肠癌(cc)的循环肿瘤dna(ctdna)以细胞和组织特异性方式归巢于cc细胞。红色突出显示的区域表示罗丹明标记的dna，蓝色区域显示dapi染色。

图16d显示，胰腺癌(pc)来源的循环肿瘤dna(ctdna)以细胞和组织特异性方式归巢于pc细胞。红色突出显示的区域表示罗丹明标记的dna，蓝色区域显示dapi染色。

图17a显示，即使是在竞争性结肠癌(cc)ctdna的存在下(以绿色显示)，多发性骨髓瘤(mm)来源的循环肿瘤dna(ctdna)以细胞和组织特异性方式归巢于mm细胞(mmctdna以红色显示)。在mm细胞中仅观察到mmctdna，而在ccctdna中未观察到。

图17b显示，即使是在竞争性胰腺癌(pc)ctdna的存在下(以绿色显示)，多发性骨髓瘤(mm)来源的循环肿瘤dna(ctdna)以细胞和组织特异性方式归巢于mm细胞(mmctdna以红色显示)。在mm细胞中仅观察到mmctdna，而在pcctdna中未观察到。

图17c显示，用染料罗丹明标记多发性骨髓瘤(mm)来源的循环肿瘤dna(ctdna)不会影响来源于mm的ctdna以细胞和组织特异性方式在mm细胞中积累的能力(mmctdna-罗丹明构建体以红色显示)。

图17d显示，用染料cy5标记多发性骨髓瘤(mm)来源的循环肿瘤dna(ctdna)不会影响来源于mm的ctdna以细胞和组织特异性方式在mm细胞中积累的能力(mmctdna-cy5构建体以绿色显示)。

图18显示，mmctdna整合到mm细胞的染色体dna中。mmctdna以红点示出。使用测序验证了mmctdna的染色体整合。

图19示意性地示出了染色体整合的验证，例如通过证明整合到肿瘤染色体中的ctdna的序列比对匹配和单独来自ctdna的序列比对匹配。图19按出现的顺序分别公开了seqidno:280-281。

图20示意性地示出了本公开内容的合成的mm特异性的zip编码寡核苷酸构建体。这种构建体可以包含在任一位点两侧的两个zip编码序列(例如，长度约300bp)，该构建体包含翻译元件(例如，ires)、gfp编码序列、启动子、萤光素酶编码序列和一个或多个罗丹明染料分子，该罗丹明染料分子可以沿着构建体分布并且可以用于追踪构建体(或其片段)在体外和/或体内的运动。

图21a显示，在mm细胞内的与其定位相对应的zcs构建体(mmzip编码-pgk-gfp-mmzip编码)的gfp表达(绿色，左上方)和罗丹明检测，表明zcs构建体向mm细胞中的有效递送、转基因的递送，以及所述转基因的表达。

图21b显示，单独使用线性pgk-gfp构建体不会显示任何细胞特异性的信号位置，从而确认zip编码序列是mmzip编码-pgk-gfp-mmzip编码构建体对mm细胞特异性摄取的原因。

图22显示了mmzip编码-噬菌体-gfp-ires-luc构建体被细胞摄取到mm细胞中的放大图。图像评估显示，使用此构建体可将多达100％的基因递送至mm细胞，这可通过分析的几乎每个mm细胞都产生gfp来表明。

图23显示了在pc异种移植小鼠模型中对来源于pc的zcs的体内归巢研究的结果。图23a在左侧第一列中显示了两个图像，其显示了未注射任何构建体的阴性对照。图23b在中间列中显示了两个图像，其显示了(通过尾静脉)施用后24小时，来源于pc的zcs在pc细胞中的积累。图23c在右侧列中显示了两个图像，其显示了(通过尾静脉)施用后48小时，来源于pc的zcs在pc细胞中的积累。从该动物的肝和脾获得的组织样品未显示出来源于pc的zcs的摄取，证实了本公开内容的zcs的细胞特异性。

图24显示了在pc异种移植小鼠模型中对来源于pc的细胞靶向核酸序列的胰腺癌(pc)体内归巢研究的结果。图24a显示的数据证明在通过尾静脉注射后24小时，尤其是48小时，这些pc靶向核酸分子在pc细胞中的大量积累和摄取。图24b显示，当将来源于pc的核酸分子直接注射到肿瘤中时，肿瘤细胞的摄取显著降低，表明本公开内容的细胞靶向和/或整合核酸分子在全身施用时可以提供改善的细胞和/或组织识别和摄取。图24c显示了现已注射ctdna的对照实验。

图25a显示了在用耐硼替佐米的患者的血清处理的硼替佐米敏感细胞(omp1和mm1)和在用耐硼替佐米的患者的血清处理的耐硼替佐米细胞(omp1和mm1)中测量的细胞活力。在用dna酶处理血清10分钟后，还测量了相似细胞中的细胞活力。

图25b显示的索引图片展示了罗丹明标记的ctdna(红色)在mm和肺、胰腺和结肠癌细胞系中的核定位。

图25c显示了与基线ctdna单独密度相比，多个细胞系和来自患者的ctdna的核密度测量值的倍数变化。图25a-25c的数据显示，患者对硼替佐米的临床敏感性可以通过ctdna传递给细胞系。

图26a显示了测量证明罗丹明-ctdna在aspc1和mm1细胞中的胞质和核定位的时程。mm：多发性骨髓瘤，cc：结肠癌和pc：胰腺癌。

图26b示出了尾部注射(n＝3)后48小时的罗丹明-ctdna的肿瘤定位的索引示例。

图26c显示了与患者癌症类型匹配或不匹配的细胞系中的索引图像。

图26d显示了与患者癌症类型匹配或不匹配的细胞系中ctdna核密度测量的倍数变化。

图26e示出了匹配和不匹配的肿瘤类型ctdna与细胞系共培养的索引图像。

图26f显示了匹配和不匹配的肿瘤类型ctdna与细胞系共培养的核密度测量的倍数变化。

图27a显示了ctdna整合到mm、pc和cc细胞系的染色单体中的索引图像。

图27b显示了具有ctdna整合的染色单体的测量(一式三份的实验，n＝10个中期)。

图27c显示了在与ctdna-cmv-gfp-ctdna构建体共培养的肿瘤细胞中gfp的表达，其中编码巨细胞病毒-绿色荧光蛋白(cmv-gfp)的货物核酸序列的两侧是允许对货物(编码cmv-gfp)序列进行细胞靶向和基因组整合的ctdna序列(右图)。左图(对照)显示，当在没有ctdna的情况下使用编码cmv-gfp的货物核酸序列时，cmv-gfp在肿瘤细胞中没有表达，这表明ctdna部分对于细胞靶向和表达货物核酸序列是必需的。

图28a显示了在用ku-55933(atm抑制剂，10μm)、dna-pkcs抑制剂i(dnapkcs抑制剂，30μm)、nu1025(parp抑制剂，200μm)和拉替拉韦(manasesetmar/整合酶，100nm)作为抑制剂处理细胞(mm1s、aspc-1和hct116细胞)后，具有ctdna整合的染色单体数目(一式三份的实验，n＝10个中期)。

图28b显示了在用te-cmv-gfp片段共培养的细胞中gfp的表达。

图28c显示了从hsv-tk载体、肿瘤对照或注射了te-cmv-hsv-tk的小鼠的肿瘤以及注射了te-cmv-hsv-tk的小鼠的1个索引案例的器官中提取的dna的pcr。

图29a显示了在用对硼替佐米敏感的患者的血清，或用培养基中添加了来自耐硼替佐米的患者的ctdna的相同血清，或用dna酶处理的相同血清处理的对硼替佐米敏感的细胞系mm1s中测量的细胞活力。另外，在与单独的耐硼替佐米血清或与另一耐硼替佐米的患者的ctdna共培养的mm1s细胞中测定了活力。

图29b显示了来自未经或经rna酶、dna酶和蛋白酶处理的多发性骨髓瘤(mm)、胰腺癌(pc)和结肠癌ctdna的ctdna的琼脂糖凝胶。

图29c显示了从胰腺癌全基因组测序(n＝10)和mm外显子测序(n＝10)测得的肿瘤与ctdna之间的一致率单核苷酸变体。

图29d显示了来自多个mm患者的不同mm细胞系和ctdna的索引图像。

图30a显示了来自小鼠的胰腺癌肿瘤的共聚焦显微镜图像，该小鼠尾部注射了罗丹明-胰腺癌ctdna。注射后24和48小时收获肿瘤。

图30b显示了在尾部注射(n＝3)后48小时，注射罗丹明-ctdna(mm、结肠癌和胰腺癌)的异种移植小鼠的不同器官的索引图像。

图31a显示了尾部注射了罗丹明-mmctdna和cy5-胰腺癌ctdna的小鼠的mm或胰腺癌肿瘤的共聚焦显微镜检查。

图31b显示了用来自患有mm、结肠癌或胰腺癌患者的ctdna培养的mm1s(mm)、htc116(结肠癌)和aspc1(胰腺癌)细胞系的共聚焦显微镜检查。

图31c显示了中期索引案例，示例了2个结肠癌细胞系(ht29和rko)和2个胰腺癌细胞系(mia和panc1)的细胞核中ctdna的整合。

图32显示了用atm、dnapkcs、parp和转座酶抑制剂处理的不同癌细胞系(mm1s、aspc1和ht116)的中期索引图像。

具体实施方式

尽管本文已经示出和描述了本公开内容的各种实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案是作为示例提供的。在不脱离本公开内容的情况下，本领域普通技术人员可以想到许多变化、改变和替换。此外，可以采用本文所述的本公开内容的实施方案的各种替代方案。

本公开内容提供了用于货物分子的细胞、组织和/或器官特异性靶向、摄取、核定位和/或基因组整合的组合物和方法(参见例如图15)。这样的货物分子可以包括核酸序列(例如，编码诸如治疗蛋白的蛋白质的dna序列)、氨基酸序列(例如，肽、蛋白质或其片段)和/或小分子或有机分子(例如，小分子治疗剂或荧光染料)。在这种情况下，本文的组合物和方法可用于将货物(例如，核酸分子、蛋白质、肽或小分子，例如治疗性和/或诊断性分子等)细胞特异性递送至靶细胞中。这样的靶细胞可以是原核细胞或真核细胞(例如肿瘤细胞)。

本文所述的组合物可包含核酸构建体。这样的核酸构建体可以提供货物分子的细胞、组织和/或器官特异性靶向、摄取、核定位和/或基因组整合。这样的核酸构建体可以包含含有识别序列和/或整合序列的核酸序列。在本文的各种情况下，这样的核酸序列可包含zip编码序列(本文也缩写为“zcs”)，其可提供核酸构建体的细胞特异性靶向和摄取。此类zcs还可以包含整合序列，所述整合序列允许将核酸或其一部分整合到细胞的基因组中。在一些情况下，提供细胞靶向和/或基因组整合的此类核酸序列可以是或可以包含转座子序列。

本公开内容的细胞靶向(识别)和整合序列可以衍生自生物样品(例如受试者的血液或组织样品)的核酸序列。这样的细胞靶向和整合序列可以衍生自循环肿瘤dna(在本文中也简称为“ctdna”)。本公开内容的zcs可用于靶向、进入和/或积累在一个或多个细胞中，并且例如靶向、进入和/或积累在此类细胞的细胞核中。zcs可以包含整合序列，所述整合序列也可以衍生自这样的ctdna。可以衍生出识别/靶向和整合序列的这些一个或多个细胞可以与用于产生这样的zcs的ctdna具有相同的来源。例如，源自和/或衍生自多发性骨髓瘤(mm)细胞的核酸分子的dna分子可用于靶向和/或递送货物至mm细胞。这样的来源于mm的ctdna分子可以包含一个或多个允许mm细胞识别、细胞摄取、核定位和/或基因组(例如染色体)整合本公开内容的来源于mm的靶向和整合序列的序列。在一些情况下，靶向和整合序列可以是核酸构建体的一部分。

在一些情况下，本公开内容提供了递送系统。这样的递送系统可包含以下中的任何一种或多种：(i)核酸构建体，所述核酸构建体包含一种或多种靶向细胞的序列和一种或多种整合序列(例如，zcs)；(ii)一种或多种编码治疗性和/或诊断性分子，例如肽或蛋白质的货物核酸序列；(iii)和一种或多种非核酸货物分子，例如小分子(例如治疗性小分子，染料等)、蛋白质、肽或其任意组合。因此，本公开内容的核酸构建体对于以高度特异性的方式并且由于惊人的发现而仅以微创的方式将基因递送到细胞中可能特别有用，所述发现是：某些核酸序列(例如zcs)在细胞水平上提供高靶向特异性(例如，仅可靶向某些来源的细胞，或某些基因型、组织类型和/或器官类型的细胞)，以及允许基因组整合和随后表达蛋白质(例如肿瘤抑制物、凋亡蛋白、抗原肽、抗体、酶等)的整合序列。

本公开内容提供用于鉴定、表征、分离、合成、体外和体内测试细胞和组织型特异性人细胞靶向核酸构建体的组合物和方法。在一些情况下，这样的核酸包括从一个或多个肿瘤细胞或一个或多个肿瘤组织的一个或多个区域分离的dna分子。这样的核酸序列(这里也称为zip编码序列、zcs或细胞靶向信号)可以是从所述肿瘤细胞分离的一个或多个转座子的一部分。在一些情况下，转座子序列可以衍生自ctdna，并且可以由这样的zcs组成或包含这样的zcs，这样的zcs可以包含细胞靶向序列和基因组整合序列。在其他情况下，本文中的转座子可包含细胞靶向序列或基因组整合序列或由其组成。

本公开内容提供了核酸构建体，所述核酸构建体可以包含细胞靶向序列和基因组整合序列并且可以在诸如生物体的系统内循环，耐受降解酶(例如dna酶)的活性，并且可排他地或几乎排他地(例如，对靶细胞具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％的特异性)，其中这样的靶细胞与所述细胞靶向序列和基因组整合序列来源的细胞相同或相似(例如，相同器官或组织类型)，并且其中这样的特异性与不同组织或器官类型的细胞相当。在一个实例中，来源于mm的zcs可以靶向(并整合)mm细胞，来源于胰腺癌(pc)的zcs可以靶向(并整合)pc细胞，等等。这样的识别可以是在体外或体内以及在类似来源但不同细胞系的细胞之间，例如，来源于mm的识别序列可以靶向并进入不同细胞系的mm细胞。在一些情况下，本公开内容的核酸构建体可包含这样的ctdna分子的部分或片段。在一些情况下，可以从受试者(例如人受试者)获得可以衍生核酸构建体的ctdna分子。这样的循环肿瘤dna片段可以包含核酸序列，所述核酸序列可以具有靶向特定细胞或细胞群体并诱导其整合到细胞基因组的能力。在各种情况下，这样的核酸序列可以是或可以包含转座子(转座子序列)。在这种情况下，本文的核酸构建体可以包含一个或多个转座子序列。令人惊讶的是，这些循环肿瘤dna片段的特定区域，在本文中也称为“zip编码”，可以作为特定的细胞靶向信号起作用，并且可以识别其特定的一种或多种起源细胞，例如“识别”其zip编码序列的细胞。作为一个实例，衍生自源自胰腺癌(pc)细胞的ctdna的本公开内容的zcs可以具有以高特异性靶向pc细胞的能力。这样的zip编码信号可以是给定细胞类型(例如，mm细胞、pc细胞或其他细胞类型的任何其他癌细胞)的特定“签名”的一部分。本公开内容的核酸构建体可以包含一种或多种zcs。

本公开内容的zip编码序列(zcs)可以以高特异性靶向特定细胞。本公开内容的zcs可以以大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或大于约99％的特异性靶向、进入和定位到一个或多个其他细胞存在下的某个细胞的细胞核。作为一个实例，pc特异性zcs以比可能存在于样品或生物体(例如啮齿类动物或人)中的其他细胞至少95％、96％、97％、98％或大于约99％的特异性靶向、进入和定位到pc细胞的细胞核。

包括zip编码序列和整合序列的本文的核酸系统和构建体可实现细胞和组织特异性货物递送(例如，递送货物或核酸构建体，例如转基因)，并且因此可显著减少例如与常规货物递送系统(例如，纳米颗粒或病毒)相比的脱靶和不希望的副作用。本公开内容的方法和组合物衍生自最初从来自癌细胞(例如循环肿瘤dna)的内源性生物机制分离和纯化的序列，因此可能不会引发显著的免疫应答。本公开内容的方法和组合物可使该技术应用于多种疾病，包括慢性、感染性和免疫性疾病。

本公开内容的核酸递送系统可包含一个或多个细胞/组织特异性zip编码序列，它们可依赖于另外的核酸序列而整合到靶细胞的基因组中。因此，在某些情况下，人细胞靶向序列或zip编码序列可直接用于将货物引导至特定细胞，而在其他情况下，它们可作为较大构建体的一部分，所述较大构建体例如通过使用整合序列整合被工程改造至靶细胞的基因组中。在一些情况下，本公开内容的核酸构建体包含可允许靶向特定的细胞的zip编码识别序列。一旦在细胞核内，本公开内容的核酸构建体可允许经由整合序列来类转座整合货物核酸序列。

在一些情况下，本公开内容的核酸构建体可包括用于确保核酸构建体在细胞基因组内的特定插入位点处插入的一个或多个指导核酸序列。本文中的核酸递送系统可包含核酸构建体、启动子和感兴趣的基因(例如，编码治疗性蛋白的货物核酸)，其可在所述启动子的调控下表达。利用所述系统的自我调节性质，与传统的基于载体的技术相比，有望显著降低随机易位和不想要的双链dna断裂的风险。

在一些情况下，本公开内容的核酸构建体可用于各种慢性、感染性或遗传性(例如，遗传)疾病的诊断和监测目的，包括癌症和与例如血细胞相关的某些障碍(例如，贫血、地中海贫血、血友病或血小板异常)。在一些情况下，本文所公开的细胞和/或组织特异性识别序列的存在可用作特定疾病或病症的生物标记，并可用于监测对特定治疗干预(例如，化疗、靶向治疗、免疫治疗或细胞和基因治疗)的应答。在其他情况下，zcs可用作辅助诊断。在这种情况下，例如，zcs整合到细胞的基因组中可以用作测量或标记，以确定货物核酸序列(例如，治疗性基因序列)整合到这样的基因组中的程度。在其他情况下，本文所述的核酸构建体(或递送系统)的细胞靶向和基因组整合可用作特定生物效应的标记。在一个实例中，治疗性基因序列的基因组整合程度可以与递送系统的zcs或转座子序列的整合成比例，因此所测量的整合物质的量可以是治疗效果(例如细胞杀伤)的标记或测量。

在一些情况下，本公开内容的核酸构建体可用于开发新的治疗策略，以预防和治疗诸如癌症、炎症疾病、自身免疫疾病等疾病。例如，特异性靶向癌症类型特异性(例如胰腺癌特异性、多发性骨髓瘤特异性、肺癌特异性等)zcs或转座子的药物分子可被设计成中断肿瘤细胞之间的通讯并因此降低肿瘤异质性，这可降低肿瘤对治疗干预产生抗性的能力。在另一个实例中，本公开内容的核酸构建体可用于在施用核酸构建体后在受试者中引发免疫应答。这样的免疫应答可通过施用包含编码一种或多种抗原性或免疫原性肽或蛋白质的货物核酸序列的核酸构建体来引发，其中，在表达后，这样的免疫原性肽或蛋白质可在受试者中引发免疫应答。因此，在一些情况下，本公开内容的zcs可以用作疫苗，例如癌症疫苗。

在一些方面，本公开内容的核酸构建体可以用作多种货物(例如，药物化合物)的递送载体。在一些情况下，本公开内容的方法和组合物可与其他用药方式(例如纳米颗粒)组合使用，以进一步增强递送。

在一些方面，本公开内容的核酸构建体可以用于疾病和病症的治疗和/或诊断。在一些情况下，本文所述的核酸构建体可用于将治疗和/或诊断货物递送至特定细胞、组织或目标器官。例如，本文所述的zip编码序列可用于可视化和/或跟踪体内的疾病或病症(例如，癌症)，例如，通过将化学染料(例如，荧光染料)或放射性同位素递送到与疾病或病症相关联的一个或多个细胞。在又一实例中，通过使用如本公开内容所述的zip编码序列以高特异性将化学染料(例如荧光染料)、放射性同位素或造影剂等递送到一个或多个肿瘤部位(例如原发肿瘤部位和转移部位)，可以在体内对肿瘤细胞进行可视化和跟踪。

在另一方面，本公开内容的组合物和方法可用于通过引起遗传不稳定性和随后的细胞死亡来治疗疾病或病症(例如，癌症)。例如，包含一个或多个zip编码序列的核酸序列可以通过插入到细胞的基因组中而进行工程改造以引起遗传不稳定性。在一些情况下，可以将一个或多个核酸构建体引入基因组中。在一些情况下，可以将至少两个核酸构建体引入基因组中。在一些情况下，可以将至少两个核酸构建体引入基因组中。在一些情况下，可以将至少五个核酸构建体引入基因组中。在一些情况下，可以将至少十个核酸构建体引入基因组中。因此，在一些情况下，当例如本公开内容的核酸构建体的细胞内浓度高到足以例如在插入细胞基因组时引起遗传不稳定性时，其本身可能具有细胞毒性。

在一些情况下，本文所述的一个或多个核酸构建体可由单个细胞摄取。在一些情况下，单个细胞可以摄取至少两个本文所述的核酸构建体。在一些情况下，单个细胞可以摄取至少五个本文所述的核酸构建体。在一些情况下，单个细胞可以摄取至少十个本文所述的核酸构建体。在一些情况下，单个细胞可以摄取至少二十个本文所述的核酸构建体。在一些情况下，单个细胞可以吸收至少一百个本文所述的核酸构建体。

在一些情况下，本公开内容的核酸构建体可通过向细胞递送细胞毒性货物(例如放射性货物)而具有细胞毒性。在一些情况下，放射性标记的核酸构建体可能从细胞外(例如，β-辐射)或细胞内(例如，α-辐射)引起dna损伤。

本公开内容还提供了可以与本文描述的方法和组合物结合使用的合成核酸zip编码序列。这样的合成核酸zip编码序列可以衍生自ctdna。这种合成核酸zip编码序列(本文也缩写为“寡zcs”)可以是核酸构建体的一部分，所述核酸构建体包含一个或多个其他核酸序列(例如编码荧光蛋白如绿色荧光蛋白(gfp)、红色荧光蛋白(rfp)或荧光素酶的那些核酸序列)、一个或多个启动子序列和/或编码例如治疗性和/或诊断性分子的一个或多个基因，其中所述一个或多个基因可以处于所述一个或多个启动子的调控下。图12示意性地图示了本公开内容的核酸构建体，所述核酸构建体包含两个mm特异性的合成zcs，其位于编码各种蛋白质(例如，gfp、荧光素酶等)的核酸序列的两侧。

这种合成寡zcs的长度可以是约50个碱基对(bp)至约1000bp。寡zcs的长度可以是约100个碱基对(bp)至约900bp。寡zcs的长度可以是约200bp至约800bp。寡zcs的长度可以是约300bp至约700bp。寡zcs的长度可以是约400bp至约600bp。寡zcs的长度可以是至少约100bp。寡zcs的长度可以是至少约200bp。寡zcs的长度可以是至少约300bp。寡zcs的长度可以是至少约400bp。寡zcs的长度可以是至少约500bp。寡zcs的长度可以是至少约1000bp。

如本文所用，术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用，并且通常指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是核糖核苷酸还是脱氧核糖核苷酸。多核苷酸包括脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)或核糖核酸(cdna)的dna拷贝的序列。该术语也指包含化学修饰的核苷酸的多核苷酸聚合物。多核苷酸可由以下物质形成：d-核糖(其可以在自然界中找到)和l-核糖(其在自然界中不存在)。

如本文所用，术语“基因组”一般指来自受试者的基因组信息，其可以是例如受试者的遗传信息的至少一部分或全部。基因组可以用dna或rna编码。基因组可以包含编码区(例如，编码蛋白质的区)以及非编码区。基因组可以包含生物体中所有染色体的序列。例如，人类基因组通常具有总共46条染色体。所有这些序列一起可以构成人类基因组。

如本文所用，多核苷酸或多肽与另一多核苷酸或多肽具有一定百分比(％)“序列同一性”，意思是当比对时，碱基或氨基酸百分比相同，且在比较两个序列时处于相同的相对位置。序列同一性可以通过许多不同的方式确定。为了确定序列同一性，可以使用各种方法和计算机程序(例如，blast、t-coffee、muscle、mafft等)比对序列。

如本文所用，术语“核酸系统”、“核酸递送系统”和“核酸构建体”可在本文中互换使用，且通常指包含本公开内容的核酸分子的核酸分子-货物缀合物或构建体，所述核酸分子与货物部分相关联(例如，共价或非共价连接)，所述货物部分可以是另外的核酸分子、肽或多肽、可检测部分(例如，荧光标记)、小分子部分或其任意组合。该术语还可指用于基因治疗目的的核酸系统，诸如包含例如zip编码区、整合区、编码目的基因的序列和任选的指导序列的系统。

如本文所用，术语“货物”一般指可与本公开内容的靶特异性核酸分子偶联的分子。这样的货物分子可以是核酸、蛋白质、肽、小分子、放射性核素、聚合物或纳米颗粒。这样的货物分子可以共价或非共价地偶联到靶特异性核酸。在一些情况下，本文中的货物可以是治疗性分子，并且在本文中可以被称为“治疗性货物”。治疗性分子包括例如通过插入靶细胞基因组引起凋亡，或通过编码治疗性蛋白而具有治疗功能的核酸。治疗性货物还包括蛋白质如抗体或其功能结合片段、细胞因子、信号分子等，以及小分子如激酶抑制剂或其他抗癌药物。在其他情况下，货物是诊断性分子，并且在本文中可以称为“诊断性货物”。这样的诊断性货物可以是荧光团、放射性核素、造影剂等。

如本文所用，术语“偶联至”一般是指将第一分子共价或非共价地连接到第二分子。在本文的各种情况下，一个或多个分子可以彼此偶联。在一个实例中，本公开内容的核酸构建体可包含第一dna序列(例如，细胞靶向序列)和第二dna序列(例如，基因组整合序列)，其中第一dna序列可经由磷酸二酯键共价偶联至第二dna序列。在另一个实例中，本文中的递送系统可以包含用于细胞靶向和基因组整合的核酸构建体以及一个或多个其他核酸序列，例如编码治疗性蛋白的治疗性基因序列、可调控这样的基因序列表达的启动子序列和其他合适的核酸序列。在一些情况下，这样的递送系统的一个或多个不同核酸部分(例如，核酸构建体、基因序列、启动子等)可共价偶联形成线性核酸分子。图12示出了这种线性递送系统的示例。这样的线性递送可以具有一个或多个另外的货物分子与其共价或非共价偶联。图20示出了这样的递送系统的示例，其中包含各种部分(例如，核酸构建体序列、基因序列、启动子等)的线性核酸序列具有与其偶联的一个或多个货物分子(在这种情况下为荧光染料)。这样的一个或多个货物分子可以沿着这样的序列的长度(例如，如图20所示)和/或在这样的核酸序列的3’和/或5’末端(末端)与核酸序列偶联。

如本文所用，术语“细胞类型”一般指用于区分属或种内形态学或表型上不同的细胞形式的分类。多细胞生物体可能包含许多差异很大的特化细胞类型，如人类的胰腺细胞、肺细胞、肌肉细胞和皮肤细胞，它们在外观和功能上都不同，但在遗传上却是相同的。细胞能够具有相同的基因型，但由于它们所含基因的差异调节，细胞类型不同。特定细胞类型的分类可以通过使用显微镜、细胞表面标记、功能性或另一种合适的方法来完成。

除非另有说明，否则本文在数值或范围的上下文中使用的术语“约”一般指所述或要求保护的数值或范围的±10％。

每当术语“至少”、“大于”或“大于或等于”在两个或更多个数值系列中的第一个数值之前时，术语“至少”、“大于”或“大于或等于”适用于该数值系列中的每个数值。例如，大于或等于1、2或3等同于大于或等于1，大于或等于2，或大于或等于3。

当术语“不大于”、“小于”或“小于或等于”在两个或更多个数值系列中的第一个数值之前时，术语“不大于”、“小于”或“小于或等于”适用于该数值系列中的每个数值。例如，小于或等于3、2或1等同于小于或等于3，小于或等于2，或小于或等于1。

术语“药学上可接受的盐”一般是指本公开内容的化合物的生理上和药学上可接受的盐：例如保留母体化合物的生物活性并且不对其产生毒理学影响的盐。对于寡聚物，在美国专利6,287,860中进一步描述了药学上可接受的盐的实例及其用途，通过引用将该专利全部并入本文。

本文中使用的术语“受试者”一般指动物界的活成员。受试者可能患有或可能怀疑患有某种疾病或障碍。受试者可以是包括天然患有疾病的个体的物种的成员。受试者可以是哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例可以包括啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)、灵长类动物(例如，狐猴、猴、猿和人)、兔子、狗(例如，伴侣犬、服务犬或工作犬，诸如警犬、军犬、赛犬或表演犬)、马(诸如赛马和工作马)、猫(例如，驯养的猫)、牲畜(例如猪、牛、驴、骡子、野牛、山羊、骆驼和绵羊)和鹿。受试者可以是人。受试者可以是非哺乳动物的动物，例如火鸡、鸭或鸡。受试者可以是农场动物(例如，猪、山羊或牛)。受试者可以是患有或具有患有疾病或病症倾向的活生物体，所述疾病或病症可以使用本文提供的试剂盒、方法和系统进行诊断和/或治疗。受试者可以是医疗保健提供者(例如，初级保健医师)正在治疗或监测的患者。可替代地，受试者可以不是患者。

本文中使用的术语“诊断”一般指疾病(例如，自身免疫性疾病、炎症性自身免疫性疾病、癌症、感染性、免疫性、生态失调等)可存在于受试者中的相对概率。类似地，术语“预后”一般是指疾病状态在受试者中可能发生某种未来结局的相对概率。

除非另有说明，否则本文在组织嗜性核酸的上下文中使用的术语“基本相同”是指功能或能力相似或相同。

细胞和组织型特异性肿瘤识别核酸序列(即zip编码序列或zcs)

本公开内容提供用于分子(例如核酸分子)的细胞、组织和/或器官特异性靶向、摄取和/或核定位的组合物和方法。这样的分子可以包含核酸序列，例如zip编码序列(zcs)。这样的zcs可以靶向、进入和定位到癌细胞的细胞核。本公开内容的癌细胞特异性zcs可衍生自ctdna。ctdna可以起源于癌细胞。癌细胞可以是任何类型的癌症(例如，血癌、起源于骨髓的癌症、实体瘤等)的癌细胞，所述癌症包括但不限于多发性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、胰腺癌、肺癌、结肠癌(例如，结直肠癌)或脑癌。因此，本文所述的包含这样一个或多个zcs的核酸构建体可用作各种货物例如核酸序列(例如编码治疗性和/或诊断性分子的基因)的特异性靶向和递送构建体和/或靶向和递送媒介物。

本公开内容的zcs可包含一个或多个细胞和/或组织型特异性肿瘤细胞识别和/或染色体整合序列。这些序列可以使zcs以细胞特异性的方式识别细胞。例如，pc特异性zcs可包含一个或多个pc特异性识别和/或整合序列(在本文中也分别称为“识别信号”和“整合信号”)，其可允许pc特异性zcs以高特异性(例如>95％特异性)靶向、进入、积累和/或定位到pc细胞的细胞核。

本公开内容的细胞特异性zcs即使在对相同和/或其他细胞或细胞类型具有特异性的zcs存在时也可表现出高的细胞特异性。例如，在存在mm特异性zcs的情况下，pc特异性zcs可以显示出高摄取、积累、定位到pc细胞的细胞核以及整合到pc细胞的染色体中(参见例如图17a-17d)。

在一些情况下，本公开内容提供了一种组合物，例如药物组合物，其包含分离的核酸分子，所述分离的核酸分子包含与seqidno:1-seqidno:277中的任何一个或多个具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性，或与其片段具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性的核苷酸序列。在一些情况下，分离的核酸序列的长度可以是至少200个碱基对。在一些情况下，分离的核酸序列的长度可以是至少400个碱基对。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约200个碱基对至约800个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约400个碱基对至约2,000个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约400个碱基对至约5,000个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约1,500个碱基对至约7,200个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约1,900个碱基对至约5,800个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约2,000个碱基对至约10,000个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约5,000个碱基对至约15,000个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约600个碱基对至约16,900个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约8,000个碱基对至约18,000个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约10,000个碱基对至约20,000个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约400个碱基对至约20,000个碱基对的范围内。

在一些情况下，本公开内容提供了包含分离的核酸的组合物，所述分离的核酸具有与seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少95％的同一性的序列，所述序列包含至少一个相对于seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282的核碱基置换修饰。在一些情况下，本公开内容的分离的核酸序列可包含至少10个相对于seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282的核碱基置换修饰。在一些情况下，本公开内容的分离的核酸序列可包含至少50个相对于seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282的核碱基置换修饰。在一些情况下，本公开内容的分离的核酸序列可包含至少100个相对于seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282的核碱基置换修饰。在一些情况下，本公开内容的分离的核酸序列可包含至少250个相对于seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282的核碱基置换修饰。在一些情况下，本公开内容的分离的核酸序列可包含约1至约20个相对于seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282的核碱基置换修饰。在一些情况下，本公开内容的分离的核酸序列可包含约20至约100个相对于seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282的核碱基置换修饰。在一些情况下，本公开内容的分离的核酸序列可包含约50至约250个相对于seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282的核碱基置换修饰。在一些情况下，本公开内容的分离的核酸序列可包含约150至约500个相对于seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282的核碱基置换修饰。在一些情况下，本公开内容的分离的核酸序列可包含约250至约700个相对于seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282的核碱基置换修饰。在一些情况下，本公开内容的分离的核酸序列可包含约500至约750个相对于seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282的核碱基置换修饰。在一些情况下，本公开内容的分离的核酸序列可包含约500至约1,000个相对于seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282的核碱基置换修饰。

在一些情况下，本公开内容的核酸构建体和系统可以包含至少一个连接(例如共价连接或缀合)至核酸的可检测部分(例如荧光标记或放射性标记)。在这种情况下，可检测部分可以连接到核酸的3’或5’末端，或其任何合适的组合。可检测部分可包括荧光团，例如荧光染料或量子点。在一些情况下，可检测部分可包含小分子(例如，荧光染料)，而在其他情况下，可检测部分可包含荧光标记的多肽、荧光标记的核酸探针和/或荧光标记的多肽复合物。在一些情况下，可检测部分可以是任何染料分子，例如quasar染料(例如q570和q670)。检测试剂或部分也可以是未标记的探针，其可以进一步缀合到另外的经标记的探针(例如，经标记的多肽或抗体)。在一些情况下，例如，可检测部分可以通过缀合部分间接地与核酸缀合或结合。如本文所述，可检测部分可以是小分子(例如染料)，其可以直接与核酸缀合或结合。可检测部分可以是荧光标记的蛋白质或分子，其可以使用例如点击化学连接到核酸的缀合部分(例如半抗原基团、叠氮基、炔基或四嗪)。

在一些情况下，本文所述的荧光小分子可包括罗丹明、对甲氨基酚、荧光素、硫代荧光素、氨基荧光素、羧基荧光素、氯代荧光素、甲基荧光素、磺基荧光素、氨基对甲氨基酚、羧基对甲氨基酚、氯对甲氨基酚、甲基对甲氨基酚、磺基对甲氨基酚；氨基罗丹明、羧基罗丹明、氯代罗丹明、甲基罗丹明、磺基罗丹明、硫代罗丹明、花菁、吲哚碳花菁、氧杂碳花菁、硫碳菁(thiacarbocyanine)、部花菁、花菁2、花菁3、花菁3.5、花菁5、花菁5.5、花菁7、噁二唑衍生物、吡啶噁唑、硝基苯并噁二唑、苯并噁二唑、芘衍生物、级联蓝、噁嗪衍生物、尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170、吖啶衍生物、原黄素、吖啶橙、吖啶黄、芳基次甲基衍生物、金胺、结晶紫、孔雀石绿、四吡咯衍生物、卟吩、酞菁、胆红素1-二甲氨基萘基-5-磺酸盐、1-苯胺基-8-萘磺酸盐、2-对甲苯氨基-6-萘磺酸盐、3-苯基-7-异氰酸根香豆素、n-(对-(2-苯并噁唑基)苯基)马来酰亚胺、芪类、芘、6-fam(荧光素)、6-fam(nhs酯)、5(6)-fam、5-fam、荧光素dt、5-tamra-尸胺、2-氨基吖啶酮、hex、joe(nhs酯)、max、tet、rox、tamra、tarma^tm(nhs酯)、tex615、atto^tm488、atto^tm532、atto^tm550、atto^tm565、atto^tmrho101、atto^tm590、atto^tm633、atto^tm647n、tye^tm563、tye^tm665或tye^tm705。

荧光部分可包含cy3、cy5、cy5.5、cy7、q570、alexa488、alexa555、alexa594、alexa647、alexa680、alexa750、alexa790、atto488、atto532、atto647n、texasred、cf610、碘化丙啶、quasar570(q570)、quasar670(q670)、irdye700、irdye800、吲哚青绿、太平洋蓝染料、太平洋绿染料或太平洋橙染料。

在一些情况下，荧光部分可以包含量子点(qd)。量子点可能是纳米级半导体光致发光材料。示例性的qd可包括但不限于cds量子点、cdse量子点、cdse/cds核/壳量子点、cdse/zns核/壳量子点、cdte量子点、pbs量子点和/或pbse量子点。如本文所用，cdse/zns可以意味着zns壳层涂覆在cdse核表面(“核-壳”量子点)上。核-壳型qd的壳材料可能具有较高的带隙和钝化核qd表面，从而获得比核qd更高的量子产率和更高的稳定性以及更广泛的应用前景。本文提供的量子点可包括qdot525、qdot545、qdot565、qdot585、qdot605或qdot655。在一些情况下，本文所述的核酸可以包括量子点，例如qdot525、qdot545、qdot565、qdot585、qdot605或qdot655。本文所述的探针可包含qdot525。本文所述的探针可包含qdot545。本文所述的探针可包含qdot565。本文所述的探针可包含qdot585。本文所述的探针可包含qdot605。本文所述的探针可包含qdot655。

在一些情况下，核酸可以包括缀合部分。缀合部分可以连接在5’末端、3’末端或沿着核酸长度的内部位点。缀合部分可以是核苷酸类似物(例如溴脱氧尿苷)。缀合部分可以是缀合官能团。缀合官能团可以是叠氮基或炔基。探针可进一步通过化学反应如点击化学或任何其他生物缀合反应衍生化。点击化学可以是铜(i)催化的炔烃和叠氮化合物的[3+2]-huisgen1,3-偶极环加成反应，生成1,2,3-三唑。点击化学可以是上述反应的无铜变体。点击化学反应可以是反式-环辛二烯与四嗪之间的反电子需求diels-alder反应。

在一些情况下，本文所用的缀合部分可包含半抗原基团。半抗原基团可包括地高辛配基、2,4-二硝基苯基、生物素、亲和素，或选自唑类、硝基芳基化合物、苯并呋喃、三萜、脲、硫脲、鱼藤酮、噁唑、噻唑、香豆素、环木脂素、杂联芳基化合物、偶氮芳基化合物或苯并二氮杂环庚三烯(benzodiazepine)。半抗原基团可以包含生物素。包含缀合部分的核酸可进一步连接到第二核酸、荧光部分(例如染料，例如量子点)或缀合伴侣，例如聚合物(例如peg)、大分子(例如碳水化合物、脂质、多肽)等。

在一些方面，本文所述的可检测标记或部分可以通过光学显微镜、荧光显微镜或色谱来检测。探针的可检测标记的检测可包括用辐射源(例如光源，例如激光器)刺激探针或其一部分(例如可检测标记)。探针的可检测标记的检测也可以包括酶促反应。

在一些情况下，可检测标记可以是放射性标记(例如放射性同位素)，其能够通过正电子发射断层扫描(pet)或单光子发射计算机断层扫描(spect)可视化本文公开的核酸构建体的分布。这些核检测方法可以与计算机x射线断层扫描(ct)(例如，pet/ct或spect/ct)耦合。在一些情况下，可检测部分可包含至少一种元素的放射性同位素。示例性的合适的放射性标记包括但不限于本文所述的那些。在一些情况下，放射性同位素包含^99mtc、¹¹¹in、⁶⁴cu、⁶⁷ga、¹⁸⁶re、¹⁸⁸re、¹⁵³sm、¹⁷⁷lu、⁶⁷cu、¹²³i、¹²⁴i、¹²⁵i、¹¹c、¹³n、¹⁵o、¹⁸f、¹⁸⁶re、¹⁸⁸re、¹⁵³sm、¹⁶⁶ho、¹⁷⁷lu、¹⁴⁹pm、⁹⁰y、²¹³bi、¹⁰³pd、¹⁰⁹pd、¹⁵⁹gd、¹⁴⁰la、¹⁹⁸au、¹⁹⁹au、¹⁶⁹yb、¹⁷⁵yb、¹⁶⁵dy、¹⁶⁶dy、⁶⁷cu、¹⁰⁵rh、¹¹¹ag、⁸⁹zr、²²⁵ac和¹⁹²ir。

在本公开内容的一些方面中，放射性同位素可以使用螯合剂连接到如本文所述的核酸分子上。示例性螯合剂部分可包括2,2’,2”-(3-(4-(3-(1-(4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23-庚氧杂-2-氮杂二十五烷-25-基)硫脲基)苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸；2,2’,2”-(3-(4-(3-(1-(4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十一氧杂-2-氮杂三十七烷-37-基)硫脲基)苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸；2,2’-(7-(4-(3-(1-(4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十一氧杂-2-氮杂三十七烷-37-基)硫脲基)苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸；2,2’,2”-(3-(4-(3-(1-(4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)-3,7-二氧代-11,14,17,20,23,26,29-七氧杂-2,8-二氮杂三十一烷-31-基)硫脲基)苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸；2,2’,2”-(3-(4-(3-(1-(4-(1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)-3,7-二氧代-11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41-十一氧杂-2,8-二氮杂四十三烷-43-基)硫脲基)苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸；2,2’,2”-(3-(4-(3-(25,28-二氧代-28-((6-(6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)氨基)-3,6,9,12,15,18,21-七氧杂-24-氮杂二十八基)硫脲基)苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸；2,2’,2”-(3-(4-(3-(37,40-二氧代-40-((6-(6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)氨基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂-36-氮杂四十基)硫脲基)苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸；2,2’,2”-(3-(4-(1-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24-七氧杂-2-氮杂二十七烷-27-酰胺基)苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸；2,2’,2”-(2-(4-(1-(4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯氧基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂三十六烷-36-酰胺基)苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三基)三乙酸；2,2’,2”-(3-(4-(3-(5-氨基-6-((4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)氨基)-6-氧代己基)硫脲基)苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸；2,2’-(7-(4-(3-(5-氨基-6-((4-6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)氨基)-6-氧代己基)硫脲基)苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸；2,2’,2”-(3-(4-(3-(5-氨基-6-((5-氨基-6-((4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)氨基)-6-氧代己基)氨基)-6-氧代己基)硫脲基)苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸；和2,2’,2”-(3-(4-(3-(5-氨基-6-((5-氨基-6-((5-氨基-6-((4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄基)氨基)-6-氧代己基)氨基)-6-氧代己基)氨基)-6-氧代己基)硫脲基)苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-2,5,8-三基)三乙酸。

在一些情况下，本公开内容的核酸分子可与颗粒(例如，纳米颗粒)或囊泡(例如，外泌体)相关联(例如，缀合或共价连接)，用于细胞和/或组织特异性靶向。例如，含有货物的纳米颗粒或外泌体可以在其表面上用细胞靶向核酸分子进行功能化，从而实现高度特异性的货物递送。

在一些情况下，本公开内容提供了载体，所述载体包含分离的核酸(所述分离的核酸包含与seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少95％的同一性的序列)以及异源核酸序列。在一些情况下，异源序列还包含整合信号。在一些情况下，异源序列还包括编码目的基因的序列，例如编码免疫原的序列或编码可从基因组表达的蛋白质的序列。这样的蛋白质序列可以受组织选择性启动子的控制，进一步促进蛋白质的组织特异性表达。

在本公开内容的一些方面中如本文所述的核酸序列和系统可包含可与特定功能相关联的各种部分。例如，本公开内容的系统可以是用于目的基因(例如转基因)的核酸递送系统，所述核酸递送系统包括细胞靶向信号、整合信号、指导序列和编码目的基因的部分。任选地，本公开内容的递送构建体可在一个末端或两个末端包含条形码序列(例如，pacbio序列)以识别核酸序列的3’末端和5’末端。图12中的图例如图示了细胞靶向信号序列可以存在于本文所述的核酸递送系统的3’末端和5’末端。所述构建体还可包括整合信号序列，并且所述整合信号序列的存在可促进所述核酸序列或其至少一部分整合到基因组中。在一些情况下，本文所述的zcs或转座子包括细胞靶向序列和整合序列。在一些情况下，本公开内容的递送系统可以包含至少一个在目的基因两端的另外的序列，从而在两个位点上位于目的基因的两侧，例如如图12和图20中所示的zcs或转座子。

在本公开内容的一些实施方案中，zcs可以由以下组成或包含以下：一个或多个转座子，例如ii型转座子。在这种情况下，转座子可以是能够靶向特定细胞、细胞群体或组织(例如，血细胞、肺组织、胰腺组织、结肠组织等)和/或将自身和/或另外的货物核酸分子整合到靶细胞的基因组中的任何分子。在一些情况下，转座子是核酸。这样的核酸可以包含dna或由dna组成。在本公开内容的转座子是dna序列的情况下，转座子可以包含与seqidno:203-seqidno:277或seqidno:282中的任一个具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性，或与其片段具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。这样的片段的长度可以是至少约8、10、12、15、20、25或30个核苷酸。在一些实施方案中，转座子可以包含以下或由以下组成：seqidno:203-seqidno:277或seqidno:282中任一个核苷酸序列(acccggccttggacacgccattttcaactccgtggtgcgttttttttttttttttttttttttgtaatggagttttgctcttgttgcccaggatggagtgcaagggatcttggctcaccacagcctctgcctcctgggttcaagtgattcttctgcctcagcctcccaagtagctgggattataagcacccaccaccacgcccagctaattttgtattttttagaagagatggagtttctccagttggccaggatggtctgtatatcctgacctcatgatctgcccacca，seqidno:282)。在一个实例中，与其他来源或组织的细胞相比，由seqidno:282所示核酸序列组成或包含seqidno:282所示核酸序列的核酸构建体可以以高度选择性的方式靶向多发性骨髓瘤(mm)细胞，并且可以整合到mm细胞的基因组中。此类核酸构建体可用于将货物分子引导至mm细胞。

在一些情况下，本公开内容的递送系统可以在核酸递送系统的3’末端或5’末端包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或另一个合适数量的细胞靶向序列。本公开内容的组合物可以包括多个这样的递送系统，每个递送系统可以靶向一个或多个细胞类型。因此，本公开内容的方法和组合物可用于同时靶向一个或多个不同的靶细胞、一个或多个不同的靶细胞群体和/或一个或多个不同的靶组织。

在一些情况下，序列的一部分(例如，一半)可以连接到目的基因的5’末端，而序列的另一部分(例如，一半)可以连接到目的基因的3’末端。在一些情况下，序列可以直接或间接与目的基因连接。例如，在一些情况下，第一序列可直接连接到包含目的基因的核酸序列的5’末端，第二序列可间接连接到包含目的基因的核酸序列的3’末端。在一些情况下，本公开内容的组合物可以包含指导序列，所述指导序列在一个末端(例如3’末端)直接连接到目的基因，并且在另一个末端(例如5’末端)直接连接到zcs或转座子序列，并且因此间接连接转座子或zcs序列和目的基因(参见例如，图12，图20)。

在一些情况下，细胞靶向信号序列和整合信号序列是细胞和/或组织特异性的，因此允许目的基因在一个或多个靶细胞群体和/或在一个或多个靶组织中表达。在一些情况下，本公开内容的核酸系统还包括编码目的基因的核酸序列。目的基因可以编码核糖核酸(即，mrna)，所述核糖核酸被细胞用于多肽或蛋白质的翻译。换句话说，目的基因可以编码异源蛋白质或多肽。

在其他情况下，本公开内容提供了可包含一个或多个指导核酸序列的核酸构建体和核酸递送系统。这样的指导核酸可以是整合信号序列、指导rna、指导dna或其组合。这样的指导核酸序列可用于例如将这样的构建体或递送系统引导到细胞基因组内的特定位置以进行基因组整合。因此，在一些情况下，本文中的指导核酸序列可用于选择细胞(例如癌细胞)基因组内的特定整合位点。

目的基因可以编码执行特定功能的蛋白质或多肽。例如，目的基因可能编码不被细胞产生的蛋白质或多肽。目的基因可以编码可以进一步用作治疗性抗原的治疗性蛋白质。可替代地，目的基因可以编码可用于基因治疗的治疗性蛋白。这样的治疗性蛋白可以可以减少、阻止和/或消除本公开内容的核酸系统所靶向的细胞的生长和/或存活。这样的细胞可以是癌细胞。靶细胞可与疾病或病症相关联，并且目的基因的靶细胞特异性表达可通过使用本文所述的zip编码序列来实现。

在一些情况下，本公开内容的递送系统可以包含编码目的基因的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或另一个合适数目的序列。

在一些情况下，目的基因的整合可以是基因座特异性的或非基因座特异性的。在本公开内容的一些方面，目的基因可以在细胞中表达，并且所得到的内源性或外源性治疗性蛋白可以保留在细胞内。在另一方面，本发明的治疗性蛋白可以从细胞中释放。在一些情况下，目的基因能够表达的速率可以根据以下而变化：所使用的启动子，和/或目的基因是否以基因座特异性的方式整合到靶细胞的基因组中。对于一些应用，可期望从组成型启动子表达蛋白质。在其他情况下，可期望从诱导型启动子表达蛋白质。

在本公开内容的一些方面中，目的基因可以编码受试者中缺乏或功能受损的内源性蛋白质或功能性rna分子。在一些情况下，携带基因突变(例如癌突变)的受试者可以使用本发明通过提供缺乏的或功能受损的蛋白质来治疗。

在一些方面，本公开内容的组合物和方法可用于细胞、组织或器官特异性递送可在细胞内执行特定功能的分子。例如，在一些情况下，本公开内容的核酸构建体可用于递送编码表现出某个功能的蛋白质的某个目的基因。在又一实例中，本文所述的组合物可用于灭活某个靶基因。例如，本文所述的组合物可用于将干扰rna如小发夹结构rna(shrna)递送到靶细胞，其可用于通过rna干扰(rnai)沉默该靶基因。

在一些情况下，货物可以是核酸。这样的核酸可以是目的基因。这种目的基因可以编码一种或多种蛋白质，所述蛋白质可以表现出某种功能并引起特定的生物学效应，例如治疗效应。在一些情况下，货物可以是或要递送到靶细胞中的转基因，可以编码角蛋白7、人胆囊收缩素a受体(胰腺癌的导管胰腺细胞来源)、人附睾蛋白4(he4，卵巢癌)、gata2和wasp(造血干细胞)、前列腺特异性抗原、gfab(星形胶质细胞)、cd20和cd19(b淋巴细胞)，在一些情况下，目的基因可以编码her2、her3、cd20、vegf、egf、cd38、slam7、cd52、cd30、cd19、cd3、pd1或pdl1。在一些情况下，本文公开的目的基因可编码核因子-κb(nf-κb)或p53(例如野生型p53或超级阻遏物p53)，或其任何组合。在一些情况下，本文公开的目的基因可编码细菌抗原，例如来源于呼吸道合胞病毒(rsv，例如rsv-a和rsv-b)、丙型肝炎病毒(hcv)、登革热病毒(denv)、单纯疱疹病毒1型(hsv-1)和2型(hsv-2)、人乳头瘤病毒(hpvs)的那些，或来源于流感的抗原，包括血凝素融合肽(ha-fp)表位、血凝素疏水口袋肽(ha-hp)表位、血凝素螺旋a表位、神经氨酸酶表位、m2胞外结构域(m2e)表位和核蛋白(np)表位。

在一些情况下，本公开内容的组合物和方法可包含某些核酸序列，所述核酸序列可用作指导序列并使核酸序列能够插入基因组的特定靶位点。

在本公开内容的一些方面中，本文所述的组合物可包含可调节目的基因在靶细胞、一个或多个靶细胞群体或一个或多个靶组织中表达的启动子(例如转录启动子)。在一些情况下，转录启动子响应于一个或多个因子(例如，如p16、p21或p53)而被激活，所述因子中的每一个在靶细胞内产生。目的基因可以与转录启动子可操作地连接并在其调控下。在其他方面，本文所述的启动子可以是组织特异性的，并且对包括sp1、ets1和/或ets2的转录因子的激活作出响应。在一些情况下，转录启动子可包括p21^cip1/waf1启动子、p27^kip1启动子、p57^kip2启动子、tdt启动子、rag-1启动子、b29启动子、blk启动子、cde19启动子、blnk启动子、hsp(例如hsp70)启动子、tyr启动子和/或λ5启动子。在一些情况下，启动子可以是球蛋白启动子。在一些情况下，启动子可以是α-球蛋白启动子、β-球蛋白启动子或γ-球蛋白启动子。

在本公开内容的一些方面，核酸可包括天然或非天然核苷酸类似物或碱基或其组合。所述非天然核苷酸类似物或碱基可以包括核糖部分、磷酸部分、核苷部分或其组合中的一个或多个处的修饰。非天然核苷酸类似物或碱基可包含2'-o-甲基、2'-o-甲氧基乙基(2'-o-moe)、2'-o-氨基丙基、2'-脱氧基、t-脱氧基-2'-氟基、2'-o-氨基丙基(2'-o-ap)、2'-o-二甲基氨基乙基(2'-o-dmaoe)、2'-o-二甲基氨基丙基(2'-o-dmap)、t-o-二甲基氨基乙氧基乙基(2'-o-dmaoee)或2'-o-n-甲基乙酰胺基(2'-o-nma)修饰、锁定的核酸(lna)、乙烯核酸(ena)、肽核酸(pna)、1’,5’-脱水己糖醇核酸(hna)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸或2’-氟n3-p5’-亚磷酰胺。本公开内容的核酸可进一步包含一个或多个无碱基位点。可进一步用可检测的部分官能化所述无碱基位点。

如本文所用，术语“转录启动子”是指启动特定基因的转录的核酸序列的区域。启动子通常位于基因的转录起始位点附近，在同一条链上并位于dna的上游(朝向反义链(也叫模板链和非编码链)的3'区)。启动子的长度为约100-1000个碱基对。启动子包含特定的dna序列和应答元件，它们为rna聚合酶和招募rna聚合酶的称为转录因子的蛋白质提供安全的初始结合位点。这些转录因子具有相应核苷酸的特异性激活物或阻遏物序列，它们附接至特定启动子上并调控基因表达。这个过程更为复杂，至少有七种不同的因子是rna聚合酶ii与启动子结合所必需的。启动子代表可以与其他调控区(增强子、沉默子、边界元件/绝缘子)协同工作，以指导给定基因的转录水平的关键元件。真核生物的转录启动子包含许多必需的元件，它们共同构成核心启动子(即启动转录所需的启动子的最小部分)。这些元件通常包括(1)转录起始位点(tss)，(2)rna聚合酶结合位点(特别是用于编码信使rna的基因的启动子中的rna聚合酶ii结合位点)，(3)一般转录因子结合位点(例如，具有共有序列tataaa的tata框，其是tata结合蛋白(tbp)的结合位点)，(4)b识别元件(bre)，(5)包含调节元件的约250bp的近端启动子，(6)转录因子结合位点(例如，具有序列cacgtf的e框(e-box)，其是包含bmal11-clock和cmyc的碱性螺旋-环-螺旋(bhlh)转录因子的结合位点)，和(7)包含另外调节元件的远端启动子。如本文所用，术语“转录启动子”不同于术语“增强子”，后者指的是远离转录起始位点的调节元件。真核生物的启动子通常根据以下类别进行分类：(1)基于at的类，(2)基于cg的类，(3)atcg-紧凑类，(4)atcg-平衡类，(5)atcg-中间类，(6)少atcg类，(7)少at类，(8)cg-掺入类，(9)少cg类，(10)at掺入类。参见gagniuc和ionescu-tirgoviste,bmcgenomics13:512(2012)。真核启动子可以是“单向的”或“双向的”。单向启动子调节单个基因的转录，其特征是存在tata框。双向启动子是短的(<1千碱基对(kbp))，dna的基因间区，在双向基因对中的基因5’末端之间(即在具有相互定向的5’末端的相反链上编码的两个相邻基因)。双向基因通常在功能上是相关的，因为它们共享单个启动子，所以可以共同调控和共同表达。与单向启动子不同的是，双向启动子不包含tata框，但包含gpc岛，并且在一侧的优势cs和as以及另一侧的gs和ts的中点周围呈现对称性。ccaat框在双向启动子中是常见的，如nrf-1、gabpa、yy1和actacanntccc(seqidno:278)基序。

如本文所用，术语“转录因子”是指与转录启动子内的特异性序列结合的序列特异性dna结合因子，从而调节可操作地接近启动子并位于启动子下游的核酸的转录。转录因子包括促进转录的激活物和通过阻止rna聚合酶的招募或结合而阻断转录的阻遏物。

本文所用术语“自杀基因”是指产生诱导p53介导的凋亡细胞杀伤的蛋白质的一类基因。可用于本公开内容的表达构建体和系统中的自杀基因包括半胱天冬酶、casp3、casp8、casp9、bax、dna片段化因子(dff)40、单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)和胞嘧啶脱氨酶以及casp3、casp8、casp9、bax、dff40、疱疹hsv-tk和胞嘧啶脱氨酶的可诱导变体。

分离的核酸可以具有转座子功能，例如ii型转座子。

通过筛选生物样品检测细胞特异性癌症zip编码序列

在一些情况下，本公开内容提供了通过检测生物样品中的细胞和组织型特异性无细胞人细胞靶向序列(有时包括一个或多个zcs)来筛选受试者(例如啮齿类动物或人)中的癌症的方法。在一些情况下，本公开内容提供了方法，所述方法包括：获得受试者的生物样品；通过使探针与所述生物样品接触并检测所述探针与所述核酸序列之间的杂交，来检测所述生物样品中是否存在与seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282具有至少90％序列同一性的核酸序列；以及基于是否通过所述杂交检测到所述核酸来表征所述受试者的所述生物样品的健康状态。在其他情况下，本公开内容提供了方法，所述方法包括：获得受试者的生物样品；通过一个或多个选自以下的方法来定量所述生物样品中与seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282具有至少90％序列同一性的核酸序列的水平：逆转录、多核苷酸扩增或测序；在计算机系统中，将所述核酸序列的所述量化水平与参比进行比较；以及基于是否通过所述一个或多个方法检测到所述核酸来表征所述受试者的所述生物样品的健康状态。

在一些情况下，分离的核酸序列的长度可以是至少200个碱基对。在一些情况下，分离的核酸序列的长度可以是至少400个碱基对。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约200个碱基对至约800个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约400个碱基对至约2,000个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约400个碱基对至约5,000个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约1,500个碱基对至约7,200个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约1,900个碱基对至约5,800个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约2,000个碱基对至约10,000个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约5,000个碱基对至约15,000个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约600个碱基对至约16,900个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约8,000个碱基对至约18,000个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约10,000个碱基对至约20,000个碱基对的范围内。在一些情况下，所述核酸序列的长度可以在约400个碱基对至约20,000个碱基对的范围内。

体内疾病或病症的治疗

在各个方面，本公开内容的人细胞靶向核酸序列可用于在施用后靶向体内(即活体或受试者中)的特定细胞、细胞群体、组织或器官。在一些情况下，由于其对特定细胞、细胞群体、组织或器官的高特异性，本公开内容的人细胞靶向核酸序列可与货物组合使用，以将这些货物递送到生物体或受试者内的特定位置。在一些情况下，这样的货物的递送可用于治疗和/或诊断目的，以例如在体内以高特异性治疗和/或检测疾病或病症或疾病或病症的发病。在一些情况下，本公开内容的人细胞靶向核酸序列可实现高度靶向治疗。在一些情况下，本公开内容的人细胞靶向核酸序列可使得能够以高度特异性的方式检测疾病或病症或疾病或病症的发病，包括疾病或病症的驱动因素。在一些情况下，疾病或病症的诊断可以是非侵入性的，因此可以使用侵入性方法(例如，外科手术)检测活体或受试者的特定疾病或病症。

如本文进一步详细描述的，例如，货物可包括编码治疗性蛋白或蛋白、肽和小分子药物的核酸分子，或多种可检测部分，例如荧光标记或放射性标记，其允许体内跟踪本文公开的人细胞靶向核酸序列。

由于它们的模块化性质(例如，图12或图20)，本公开内容的人细胞靶向核酸序列和系统可用于预防、治疗和/或诊断多种疾病和病症，所述疾病和病症可包括慢性、代谢性和感染性疾病或病症，例如癌症或糖尿病。

在各个方面，本公开内容的人细胞靶向核酸序列可配制成药物组合物并使用多种施用途径(包括全身和局部施用)施用到受试者的生物体。施用后，人细胞靶向核酸序列分布在受试者的活生物体内，并且可以在循环和器官摄取期间通过检测可检测部分(如荧光染料或放射性同位素)释放的信号而被检测到。由细胞、细胞群体、组织或器官在体内摄取细胞靶向核酸序列后，细胞靶向核酸序列可将如本文所述的货物递送至靶位点或多个靶位点。由于其对特定细胞、细胞群体、组织或器官的高特异性，本公开内容的核酸构建体主要聚集在靶位点，因此可以是多种货物的高特异性递送媒介物。

zip编码序列在癌症治疗中的用途

许多癌症，特别是几种类型的实体肿瘤，很难治疗，因为很难在管理正常组织中的药物的负面副作用的同时，使足够高水平的有效药物进入此类肿瘤。因此，需要将药物特异性地靶向例如实体肿瘤，以在肿瘤中获得更高的药物有效剂量，同时最小化在其他组织中的负面副作用水平。此外，还需要针对快速生长的癌细胞特异性地靶向药物。典型的癌症药物方案常常受到剂量限制毒性的限制，并且尽管一些抗体-药物缀合物被用于将药物靶向特定肿瘤以限制位点外毒性，但对于许多实体肿瘤来说，这种特异性疗法是不可用的。本文提供了核酸构建体和递送系统，其可特异性地将货物(例如药物)递送到细胞。在某些情况下，包含zip编码的核酸构建体本身具有或诱导治疗应答。

本公开内容描述了一类细胞靶向核酸序列，其可包含一个或多个细胞/组织特异性zcs，所述zcs衍生自无细胞肿瘤dna特异性样品，所述zcs可归巢、靶向、导向、积聚、穿透癌或病变细胞的细胞质和细胞核。本公开内容的此类细胞靶向核酸可以特异性地靶向一个或多个人细胞类型。因此，它们可以直接使用或用作活性药物、核酸构建体或分子的载剂来治疗癌细胞或病变细胞。在一个或多个特定的癌区域或病变区域、组织、结构或细胞中能够特异性地归巢、靶向、导向、积聚、穿透细胞质和细胞核的核酸序列能够具有较少的脱靶和潜在的负面效应。

本公开内容还提供了一类新的载剂，其可将活性剂或可检测剂递送到可用于治疗和成像目的之一或两者的特定区域、组织、结构或细胞。如本文所述，活性剂或可检测剂可连接到包含本公开内容的一个或多个zip编码序列的核酸序列。

本公开内容还提供了一种用于治疗受试者的病症的方法，其中所述方法包括给受试者施用zcs，所述zcs归巢、靶向、迁移到、导向受试者的区域、组织或细胞，例如在特定靶细胞(例如多发性骨髓瘤、胰腺癌或肺癌细胞)的细胞质或细胞核内。在一些情况下，施用的核酸构建体可以穿过受试者的靶细胞的细胞核并整合到受试者的细胞中。

在一个实施方案中，所述方法包括给需要的受试者施用有效量的zcs核酸构建体，所述zcs核酸构建体可任选地包含治疗性货物。

本文所用的术语“有效量”指使所治疗疾病或病症的一种或多种症状得到某种程度缓解的药剂或化合物的充足施用量。结果可以是疾病的体征、症状或病因的减轻和/或缓解或者生物系统的任何其他期望变化。可施用含有此类药剂或化合物的组合物用于预防性、增强性和/或治疗性治疗。在任何个体中，适当的“有效”量可以使用诸如剂量递增研究等技术来确定。在一些情况下，核酸zip编码序列的治疗有效量(例如，预防和/或治疗疾病或障碍)可为约1皮克(pg)至约1g。zcs的治疗有效量可为约1纳克(ng)至约100mg。zcs的治疗有效量可为约100ng至约10mg。zcs的治疗有效量可为约1微克(μg)至约10mg。zcs的治疗有效量可为约100μg至约1mg。

zcs或包含一个或多个zcs的构建体可与一个或多个其他zcs或包含一个或多个zcs的构建体组合施用。zcs或包含一个或多个zcs的构建体可与一个或多个其他治疗性分子(例如，小分子药物、免疫治疗剂(例如，免疫检查点阻断剂)、治疗性抗体等)组合施用。

本公开内容的方法、组合物和试剂盒可包含防止、治疗、抑制、逆转或减轻病症症状的方法。所述治疗可包括用本公开内容的核酸构建体或包含zcs的一个或多个系统治疗受试者(例如，患有疾病或病症的个体、家畜、野生动物或实验室动物)。所述疾病可以是癌症或肿瘤。在治疗疾病时，本公开内容的核酸分子可以接触肿瘤或癌细胞。受试者可以是人。受试者可以是人；非人类灵长类动物如黑猩猩，以及其他猿和猴物种；农场动物如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜如兔、狗和猫；实验室动物包括啮齿类动物，如大鼠、小鼠和豚鼠等。受试者可以是任何年龄的。受试者可以是，例如，老年人、成人、青少年、青少年前期、儿童、蹒跚学步的儿童、婴儿和子宫中的胎儿。

可以在疾病的临床发作前向受试者提供治疗。可以在疾病的临床发作后向受试者提供治疗。可以在疾病的临床发作后1天、1周、6个月、12个月或2年或更长时间后，向受试者提供治疗。可以在疾病的临床发作后，向受试者提供超过1天、1周、1个月、6个月、12个月、2年或更长时间的治疗。可以在疾病的临床发作后，向受试者提供少于1天、1周、1个月、6个月、12个月或2年的治疗。治疗还可以包括在临床试验中治疗人。使用本文所述zcs的治疗可包括每日一次或多次施用zcs或包含一个或多个zcs的构建体。在一些情况下，这样的每日施用包含相同或不同量的zcs或包含一个或多个zcs的构建体，和/或包含一种或多种如本文所述的其他治疗性分子。

治疗可包括向受试者施用药物组合物，如贯穿本公开内容所述的一种或多种药物组合物。治疗可以包括将本公开内容的核酸分子或核酸递送系统经静脉内、皮下、肌肉内、通过吸入、皮肤、局部、口服、舌下、鞘内、经皮、鼻内、经由腹膜途径，或者直接进入脑，例如经由和脑内心室途径递送到受试者。治疗可以包括将核酸分子-或核酸递送系统-活性剂复合物经静脉内、皮下、肌肉内、通过吸入、皮肤、局部、口服、鞘内、经皮、经皮内、经肠外、口服、经腹膜途径、鼻、舌下或直接进入脑施用给受试者。

在一些实施方案中，本公开内容提供了治疗癌症或肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本公开内容的核酸递送系统。可以用本公开内容的核酸分子(或核酸分子-货物缀合物)治疗的癌症或病症的一个示例是实体瘤或液体瘤。可以使用的本公开内容的核酸构建体或包含zcs的一种或多种系统治疗的癌症或病症的进一步示例包括三阴性乳腺癌、乳腺癌、乳腺癌转移、er/pr阳性乳腺癌、本文描述的任何癌症的转移、结肠癌、结肠癌转移、肉瘤、急性淋巴母细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、肾上腺皮质癌、aids相关癌症(如卡波西肉瘤、aids相关淋巴瘤)、原发性cns淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、儿童星形细胞瘤、星形细胞瘤、儿童非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤、cns非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤、非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、皮肤癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、尤因肉瘤肿瘤家族的肿瘤、骨肉瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、原发性和转移性骨癌、恶性纤维组织细胞瘤、儿童脑干胶质瘤、脑干胶质瘤、脑肿瘤、脑和脊髓肿瘤、中枢神经系统胚胎性肿瘤、儿童中枢神经系统胚胎性肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、儿童中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、儿童颅咽管瘤、室管膜瘤、儿童室管膜瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、儿童支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、胃癌、不明原发癌、心脏肿瘤、儿童心脏肿瘤、原发淋巴瘤、宫颈癌、胆管癌、脊索瘤、儿童脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生性肿瘤、结肠癌、结直肠癌、皮肤t细胞淋巴瘤、原位导管癌、子宫内膜癌、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、儿童鼻腔神经胶质瘤、尤文肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、儿童颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、眼癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、卵巢癌、睾丸癌、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、组织细胞增生症、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、黑色素瘤、黑色素瘤转移、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、肾癌、肾细胞瘤、肾母细胞瘤、儿童肾肿瘤、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、非霍奇金淋巴瘤、巨球蛋白血症、华氏巨球蛋白血症、男性乳腺癌、梅克尔细胞癌、隐匿性原发转移性鳞状颈癌、涉及nut基因的中线道癌、口腔癌、多发性内分泌瘤综合征、儿童多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生性肿瘤、慢性骨髓增生性肿瘤、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌、口咽癌、低度恶性潜能肿瘤、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤、乳头状瘤病、儿童乳头状瘤病、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、咽癌、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、儿童胸膜肺母细胞瘤、原发性腹膜癌、前列腺癌、直肠癌、妊娠相关癌、横纹肌肉瘤、儿童横纹肌肉瘤、唾液腺癌、塞扎里综合征、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、肾、盆、输尿管的移行细胞癌、子宫癌、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、血管肿瘤和外阴癌。

示例性癌细胞样品可以包括但不限于从肛门癌、阑尾癌、胆管癌(即胆管上皮癌)、膀胱癌、脑瘤、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、不明原发癌(cup)、食管癌、眼癌、输卵管癌、胃肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、髓母细胞瘤、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺病、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌或外阴癌获得的细胞样品。

癌细胞样品可以包括从血液系统恶性肿瘤获得的细胞。血液系统恶性肿瘤可包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤。血液系统恶性肿瘤可能是以t细胞为基础的血液系统恶性肿瘤。血液系统恶性肿瘤可能是以b细胞为基础的血液系统恶性肿瘤。示例性的基于b细胞的血液系统恶性肿瘤可包括但不限于慢性淋巴细胞白血病(cll)、小淋巴细胞淋巴瘤(sll)、高风险cll、非cll/sll淋巴瘤、幼淋巴细胞白血病(pll)、滤泡淋巴瘤(fl)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、套细胞淋巴瘤(mcl)、华氏巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区b细胞淋巴瘤、结内边缘区b细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高度b细胞淋巴瘤、原发性纵隔b细胞淋巴瘤(pmbl)、免疫母细胞大细胞淋巴瘤、前体b淋巴母细胞淋巴瘤、b细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大b细胞淋巴瘤、血管内大b细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿病。示例性的基于t细胞的血液系统恶性肿瘤可包括但不限于，未另外指明的外周t细胞淋巴瘤(ptcl-nos)、间变性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、成人t细胞白血病/淋巴瘤(atll)、母细胞nk细胞淋巴瘤、肠病型t细胞淋巴瘤、血细胞γ-δt细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、鼻nk/t细胞淋巴瘤、治疗相关t细胞淋巴瘤或多毛细胞白血病。

zip编码序列介导的基因递送可以改变靶细胞的表型

本公开内容的方法和组合物可用于改变靶细胞和/或靶细胞群体的表型。在一些情况下，受试者中靶细胞的表型改变可改善受试者对治疗干预的治疗和/或临床应答。

本文所述的人细胞靶向序列(zip编码)可连接到一个或多个目的基因，因此不需要病毒载体系统就可用于那些基因的细胞和/或组织特异性递送。在一些情况下，目的基因可能编码特定的蛋白质或多肽，如一旦在靶细胞中表达，就能使细胞对细胞外刺激产生应答的表面受体，而细胞以前对这些刺激没有应答，或对这些刺激产生了抗性机制。因此，本公开内容的方法和组合物可用于逆转细胞中的抗性机制或诱导细胞对某些细胞外或外源性刺激的应答性。例如，目的基因可以编码表面受体，例如雌激素受体(er)、人表皮生长因子受体2(her2)和/或3(her3)或其他表面标记(或生物标记)，包括分化(cd)表面蛋白(例如cd19、cd22、cd138、cd34、pd1、cd38或slam7)的簇。这种人工引入的基因的表达可能使细胞表型从例如her阴性改变为her2阳性。在一些情况下，例如，her2阳性原发肿瘤可能发展为her2阴性的远处病变，其对包括施用抗her2抗体如曲妥珠单抗的抗her2治疗没有应答或仅表现出非常有限的应答。因此，本公开内容的方法和组合物可用于将her2阴性肿瘤转化为her2阳性肿瘤，从而增加其对抗her2治疗的敏感性。作为另一个示例，肿瘤细胞可下调应答靶向治疗或化疗，例如吉西他滨的某些途径(例如核苷酸合成或dna修复)，并因此逃避这些治疗途径，导致低应答率和总生存率。因此，本公开内容的方法和组合物可用于逆转这些抗性机制并过量表达某些蛋白质，这些蛋白质与治疗性药物分子结合可显著增加肿瘤对治疗的敏感性。

在本公开内容的其他方面，本文所述的组合物可用于增加免疫调节蛋白在靶细胞中的表达。例如，本公开内容的核酸构建体和系统可用于增加免疫检查点如程序性细胞死亡受体-1(pd-1)和/或程序性细胞死亡受体配体1(pd-l1)的产生。此外，本公开内容的核酸序列可以包含编码蛋白质的基因，所述蛋白质包括但不限于ctla-4、btla、tim-3、ccr5、cxcr4、tcr、b2m、嵌合抗原受体(car)、负责生物蛋白生产的基因、肝脏中的白蛋白、血红蛋白亚基β基因、血红蛋白亚基α1基因、甲状腺素转位素(ttr)、ccr5、糖皮质激素(gr)、t细胞受体(tcr)、cd52、bcl11a、α-l艾杜糖醛酸酶(idua)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(ids)、因子9、pd-1/tcr-a/tcr-b、tcr/cs-1、tcr、cep290、tcr/b2m、cblb、tgfbr、肌营养不良蛋白、cftr、serpina1、il2rg或hbv。

zip编码序列介导和细胞特异性产生新抗原

本公开内容的人细胞靶向序列可用于在靶细胞、靶细胞群体和/或靶组织中产生新抗原，所述靶细胞、靶细胞群体和/或靶组织随后可被特异性设计的药物分子(例如，治疗性抗体或抗体-药物缀合物)靶向，所述药物分子对那些新抗原表现出亲和力。换言之，本公开内容的zcs可用于增加或人工诱导靶细胞对药物的敏感性，并因此提供新的和有效的治疗选择。如本文所述，新抗原通常被理解为由肿瘤特异性突变基因编码的抗原。

在本公开内容的一些方面，所述方法和组合物可用于提高免疫治疗方法的功效。例如，目前的靶向免疫疗法仅在小部分患者(约15-25％)中显示出有希望的结果。使用本文所述组合物来增强受试者自身免疫系统更有效地识别和攻击肿瘤细胞的能力的一个示例可以是通过在癌细胞中产生新抗原，所述新抗原使得免疫系统能够识别肿瘤细胞为外来的。例如，本文所述的组合物还可用于诱导肿瘤细胞中的受试者可能具有先天或获得性免疫(例如，过去曾接种过针对该特异性抗原的疫苗)的细菌或病毒的表达，因此可允许记忆b细胞识别并破坏表达相应细菌或病毒抗原的癌细胞。

本文公开的方法和组合物可与现有药物如靶向pd-1/pd-l1轴的免疫检查点抑制剂或其他免疫检查点如细胞毒性t淋巴细胞相关分子4(ctla-4)或lag-3、tim-3、tigit、vista或b7/h3组合使用。已经表明，目前可用的免疫疗法对具有高突变负荷的肿瘤(例如，吸烟引起的肺癌)和可被免疫系统的t细胞检测为外来的表面新抗原存在增加的肿瘤更有效。因此，使用本公开内容的组合物人工增加免疫细胞可识别的非天然多肽片段(即，新抗原)的量可增加用于预防和治疗癌症和其他疾病的免疫疗法的功效。

在其他情况下，本公开内容提供了核酸构建体和递送系统，其可用于将病毒、细菌、真菌或其他外来抗原递送到受试者(例如啮齿类动物或人)的靶细胞，以便在受试者中引发针对这种靶细胞的免疫应答。在一些情况下，这样的靶细胞可以是癌细胞。可以通过例如使用本公开内容的递送系统将这种外源抗原递送到这样的靶细胞，所述递送系统包括细胞靶向序列、整合序列和编码这样的外源抗原的货物核酸序列。货物核酸序列可在将这样的序列整合到靶细胞的基因组中后由靶细胞表达。

zip编码序列介导的嵌合抗原受体(car)t细胞的产生

在一些方面，本公开内容的人细胞靶向序列可以包括zip编码序列，并且可以用于在靶细胞中表达内源性或人工受体。在一些情况下，人工受体可以是嵌合抗原受体(car)，其可以在特定的靶细胞群体(例如，t淋巴细胞)中表达。对特定靶细胞或细胞群体的高特异性和自整合能力可使zip编码序列用作靶向序列，用于car基因的高效和可重复整合。由于t细胞群体内离体car基因整合的高度异质性，目前可用的用于在t细胞(即，cart细胞)中使用多种病毒载体系统(例如，腺病毒或慢病毒载体)生产car的方法通常具有有限的临床效用，导致在比较多批次生产时的低重复性。因此，本文所述的组合物和方法可用于增加临床相关细胞群体(例如，t细胞)内car基因转染的有效性和同源性。

zip编码序列防止肿瘤生长和疾病复发

本文描述的核酸zip编码序列(zcs)也可用于防止肿瘤生长和疾病复发。在一些情况下，本公开内容的zcs可用于在施用给患有或怀疑患有癌症的受试者时结合和/或捕获循环肿瘤核酸分子。

本公开内容的组合物和方法允许分离和/或合成癌症类型特异性zcs。当本公开内容的zcs与受试者中的循环肿瘤核酸分子接触时，这些zcs对源自相同肿瘤类型的循环肿瘤核酸分子的特异性可导致杂交复合物的形成。这可以阻止循环肿瘤核酸分子(例如ctdna)到达其目的组织或器官，因此可以防止或减少转移瘤形成、肿瘤细胞之间的细胞串扰以及与肿瘤生长和发育相关的其他机制的发生率。

在一些情况下，本文所述的肿瘤特异性共有序列或共有zcs可用于预防受试者中的癌症和/或预防癌症疾病的复发。本文所述方法的多功能性可允许生产和/或合成可用于几乎任何肿瘤类型的zcs。

在一些情况下，本公开内容的zcs可与一个或多个分子缀合、结合或连接，所述一个或多个分子可允许改进循环肿瘤核酸分子的结合或捕获。这样的分子可以包括增强zcs对与特定肿瘤类型相关的循环肿瘤核酸分子的结合亲和力的那些分子。这些分子可以进一步包括那些改变zcs的生物分布、药代动力学和/或药效动力学的化学部分。在一些情况下，可以修饰zcs，使得循环肿瘤核酸分子从循环中的去除例如通过排泄、代谢(例如酶促)转化或失活而增强或加速。

zcs可用于确定受试者中的循环肿瘤核酸分子的生物分布，以及所述受试者血液中循环肿瘤核酸分子的量(例如，通过测量可以用染料标记的结合或杂交的zcs的量)。

核酸zcs在货物递送中的用途

如本文所公开的核酸序列和系统可与用于成像、研究、治疗、治疗诊断学、药物、化疗药物、螯合疗法、靶向药物递送和放射疗法的试剂缀合。

在一些实施方案中，细胞或组织型特异性zcs与可检测剂(例如荧光团、近红外染料、造影剂、纳米颗粒、含金属的纳米颗粒、金属螯合物、x射线造影剂、pet试剂、金属、放射性同位素、染料、放射性核素螯合剂)或可用于成像的另一合适材料缀合或融合。在一些情况下，可以将1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种可检测剂与细胞或组织型特异性zcs连接。放射性同位素的非限制性实例包括α发射体、β发射体、正电子发射体和γ发射体。在一些情况下，金属或放射性同位素选自：锕、镅、铋、镉、铯、钴、铕、钆、铱、铅、镥、锰、钯、钋、镭、钌、钐、锶、锝、铊和钇。在一些情况下，金属是锕、铋、铅、镭、锶、钐或钇。

在一些情况下，荧光团是发射波长在650nm和4000nm之间的电磁辐射的荧光剂，这种发射用于检测这种试剂。在本公开内容中可用作缀合分子的荧光染料的非限制性实例包括dylight-680、dylight-750、vivotag-750、dylight-800、irdye-800、vivotag-680、cy5.5或吲哚菁绿(icg)。在一些情况下，近红外染料通常包括菁染料(例如，cy7、cy5.5和cy5)。在本公开内容中用作缀合分子的荧光染料的另外的非限制性实例包括吖啶橙或吖啶黄、alexafluor(例如，alexafluor790、750、700、680、660和647)及其任何衍生物、7-放线菌素d、8-苯胺基萘-1-磺酸、阿托染料及其任何衍生物、金胺-罗丹明染色剂及其任何衍生物、bensantrhone、bimane、9-10-双(苯基乙炔基)蒽、5,12-双(苯基乙炔基)并四苯(naththacene)、双苯酰亚胺、脑彩虹、钙黄绿素、羧基荧光素(carbodyfluorescein)及其任何衍生物、1-氯-9,10-双(苯基乙炔基)蒽及其任何衍生物、dapi、dioc6、dylightfluors及其任何衍生物、艾吡可酮(epicocconone)、溴化乙锭、flash-edt2、荧光染料及其任何衍生物、fluoprobe及其任何衍生物、荧光素及其任何衍生物、fura及其任何衍生物、gelgreen及其任何衍生物、gelred及其任何衍生物、荧光蛋白及其任何衍生物、m同种型蛋白及其任何衍生物(例如mcherry)、七甲川(hetamethine)染料及其任何衍生物、赫斯特(hoeschst)染色剂、亚氨基香豆素、印度黄、indo-1及其任何衍生物、来若丹(laurdan)、荧光黄及其任何衍生物、荧光素及其任何衍生物、荧光素酶及其任何衍生物、部花菁(mercocyanine)及其任何衍生物、尼罗染料(niledye)及其任何衍生物、苝、荧光桃红(phloxine)、phyco染料及其任何衍生物、碘化丙啶、比染因(pyranine)、罗丹明及其任何衍生物、瑞博绿(ribogreen)、rogfp、红荧烯、芪及其任何衍生物、磺基罗丹明及其任何衍生物、sybr及其任何衍生物、synapto-phluorin、四苯基丁二烯、tetrasodiumtris、德克萨斯红、太坦黄、tsq、伞形酮、蒽酮紫、黄荧光蛋白和yoyo-1。其他合适的荧光染料包括但不限于荧光素和荧光素染料(例如荧光素异硫花菁(isothiocyanine)或fitc、萘并荧光素、4′,5′-二氯-2′,7′-二甲氧基荧光素、6-羧基荧光素或fam等)、羰花菁、部花菁、苯乙烯染料、氧杂菁染料(oxonoldyes)、藻红蛋白、赤藓红、曙红、罗丹明染料(例如羧基四甲基-罗丹明或tamra、羧基罗丹明6g、羧基-x-罗丹明(rox)、丽丝胺罗丹明b、罗丹明6g、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明(tmr)等)、香豆素和香豆素染料(例如，甲氧基香豆素、二烷基氨基香豆素、羟基香豆素、氨基甲基香豆素(amca)等)、俄勒冈绿染料(例如，俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514等)、德克萨斯红、德克萨斯红-x、spectrumred、spectrumgreen、花菁染料(例如，cy-3、cy-5、cy-3.5、cy-5.5等)、alexafluor染料(例如，alexafluor350、alexafluor488、alexafluor532、alexafluor546、alexafluor568、alexafluor594、alexafluor633、alexafluor660、alexafluor680等)、bodipy染料(例如bodipyfl、bodipyr6g、bodipytmr、bodipytr、bodipy530/550、bodipy558/568、bodipy564/570、bodipy576/589、bodipy581/591、bodipy630/650、bodipy650/665等)、irdye(例如ird40、ird700、ird800等)等。另外的合适的可检测剂描述于pct/us14/56177中。放射性同位素的非限制性实例包括α发射体、β发射体、正电子发射体和γ发射体。在一些实施方案中，金属或放射性同位素选自：锕、镅、铋、镉、铯、钴、铕、钆、铱、铅、镥、锰、钯、钋、镭、钌、钐、锶、锝、铊和钇。在一些实施方案中，该金属是锕、铋、铅、镭、锶、钐或钇。在一些实施方案中，放射性同位素是锕-225或铅-212。

本公开内容提供与放射增敏剂或光敏剂缀合的细胞或组织型特异性人细胞靶向核酸序列。放射增敏剂的实例包括但不限于：abt-263、abt-199、wehi-539、紫杉醇、卡铂、顺铂、奥沙利铂、吉西他滨、依他硝唑、米索硝唑、替拉扎明和核酸碱基衍生物(例如，卤化嘌呤或嘧啶，如5-氟脱氧尿苷)。光敏剂的示例包括但不限于：当被照射时产生热的荧光分子或荧光珠、纳米颗粒、卟啉和卟啉衍生物(例如，二氢卟酚、细菌二氢卟酚、异细菌二氢卟酚、酞菁和萘酞菁)、金属卟啉、金属酞菁、当归根素、chalcogenapyrrilliumdyes、叶绿素、香豆素、黄素和相关化合物(如咯嗪和核黄素)、富勒烯、脱镁叶绿酸、焦脱镁叶绿酸、花菁(例如，部花菁540)、脱镁叶绿素、萨卟啉(sapphyrin)、得克萨卟啉(texaphyrin)、红紫素、类卟吩(porphycene)、吩噻嗪鎓、亚甲蓝衍生物、萘酰亚胺、尼罗蓝衍生物、醌、苝醌(例如，金丝桃素、竹红菌素和尾孢毒素)、补骨脂素、醌、类维生素a、罗丹明、噻吩、verdin、呫吨染料(例如，曙红、赤藓红、孟加拉玫瑰红(rosebengal))、卟啉的二聚体和寡聚体形式以及前药如5-氨基乙酰丙酸。有利地，该方法允许同时使用治疗剂(例如，药物)和电磁能(例如，辐射或光)高度特异性靶向患病细胞(例如癌细胞)。

在一些方面，本公开内容的组合物和方法可用于诱导靶细胞中的dna损伤和/或基因组不稳定性。例如，使用放射性标记的核酸构建体可用于在与疾病或病症相关的细胞内引起辐射诱导的dna损伤。在一些情况下，施用特定治疗量的核酸构建体可导致例如肿瘤组织中的增殖细胞的可测量的减少。

包含细胞型和组织型特异性zip编码序列的药物组合物

本公开内容提供包含本文所述的一种或多种zcs的药物组合物。本公开内容的药物组合物可以是包含本文所述的一种或多种细胞靶向和/或基因组整合核酸序列(例如zcs)的任何核酸构建体与其他化学和/或药学上可接受的组分的组合，所述化学和/或药学上可接受的组分例如载剂、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂、抗氧化剂、增溶剂、缓冲剂、渗透剂、盐、表面活性剂、氨基酸、封装剂、膨胀剂、冷冻保护剂和/或赋形剂。该组合物可促进将本文所述的任何核酸构建体或zcs施用至生物体。组合物可以作为药物组合物以治疗有效量通过各种形式和途径施用，所述形式和途径包括例如静脉内、皮下、肌内、直肠、气雾剂、肠胃外、眼(ophthalmic)、肺、经皮、阴道、眼(optic)、鼻、口腔、舌下、吸入、皮肤、鞘内、鼻内和局部施用(例如用于黑色素瘤)。药物组合物可以以局部或全身方式进行施用，例如，通过将本文所述的核酸分子直接注射到器官中，任选地在贮器中。

可以将肠胃外注射剂配制用于推注注射或连续输注。本文所述的药物组合物可以是适于肠胃外注射的呈油性的或水性媒介物中的无菌悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于肠胃外施用的药物配制品包括呈水溶性形式的本文所述的人细胞靶向核酸序列的水溶液。本文所述的人细胞靶向核酸序列的悬浮液可以制备为油性注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油(如芝麻油)或合成的脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯)或脂质体。水性注射悬浮液可以含有增加该悬浮液的粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。该悬浮液还可以含有合适的稳定剂或药剂，这些稳定剂或药剂增加了本文所述的此类核酸分子的溶解度和/或减少了其聚集以允许制备高度浓缩的溶液。可替代地，本文所述的核酸分子和核酸-货物构建体可以是冻干形式或粉末形式，以在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)重构。在一些情况下，核酸构建体或zcs被直接注射到组织中。本文所述的核酸构建体或zcs可以施用给受试者、归巢、靶向、迁移到、穿透器官(例如胰腺)或细胞(例如多发性骨髓瘤细胞)。

本公开内容的核酸分子和核酸-货物构建体可在外科手术过程中直接应用于器官、器官组织或细胞，例如肺或胰腺。本文所述的核酸构建体或包含zcs的人细胞靶向核酸序列可以局部施用，并且可以配制成多种局部施用的组合物，如溶液、悬浮液、洗剂、凝胶剂、糊剂、药用棒、香膏剂、乳膏剂和软膏剂。此类药物组合物可含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。

在实施本文提供的治疗或使用方法时，可以将治疗有效量的本文所述的核酸构建体或zcs以药物组合物的形式施用给患有癌症的受试者。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物(如人)。治疗有效量可以根据疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、所用化合物的效力以及其他因素而广泛变化。

药物组合物可以使用一种或多种药学上可接受的载剂(包含赋形剂和助剂，它们促进了将这些活性化合物加工成药学上可使用的制剂)来配制。可以根据所选择的施用途径来修饰配制品。包含本文所述的核酸分子或核酸递送系统的药物组合物可以例如通过在重组系统中表达肽、纯化肽、冻干核酸分子、混合、溶解、造粒、造糖衣丸、研磨、乳化、包封、包埋或压缩过程来制造。药物组合物可以包括至少一种药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂、以及呈游离碱或药学上可接受的盐形式的本文所述的化合物。

制备如本文所述的核酸和包含本文所述化合物的核酸系统(例如，连接到货物部分的zcs)的方法包括使用一种或多种惰性的药学上可接受的赋形剂或载剂配制本文所述的核酸构建体或zcs，以形成固体、半固体或液体组合物。固体组合物包括例如粉末剂、片剂、可分散颗粒剂、胶囊剂、扁囊剂和栓剂。这些组合物还可以含有少量无毒的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂和其它药学上可接受的添加剂。

药学上可接受的赋形剂的非限制性实例可以例如在，remingtonthescienceandpracticeofpharmacy,第十九版(easton,pa.:mackpublishingcompany,1995)；hoover,johne.,remington'spharmaceuticalsciences,mackpublishingco.,easton,pennsylvania1975；liberman,h.a.和lachman,l.,编辑,pharmaceuticaldosageforms,marceldecker,纽约,n.y.,1980；和pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems,第七版(lippincottwilliams&wilkins1999)，其中每一个以其全文通过引用并入。

核酸序列的体内摄取

本公开内容的核酸分子和核酸缀合物(例如，连接到货物部分的zcs)摄取进入特定细胞、细胞群体、组织或器官可在离体(例如，通过组织染色、荧光、pcr等)或体内(例如，组织样品(例如，血液样品、活检)、非侵入性成像等)确定。以相同的方式，可以离体或体内确定货物递送的功效。离体分析包括器官采集和在分析之前固定(例如使用4％甲醛)采集的组织。可以使用多种分析方法分析组织样品，包括显微镜检查、光谱学、流式细胞术、聚合酶链式反应(pcr)以及通过超声、电磁辐射(例如uv/vis、x射线)或放射性的测量。例如，组织摄取可通过测量细胞、细胞群体、组织或器官样品的发光或生物发光，或通过测量细胞、细胞群体、组织或器官样品的放射性，以及通过计算摄取值，例如每克(或每摩尔或每体积)的注射剂量百分比来确定。

实施方案

实施方案1.在一些实施方案中，本公开内容提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的分离的核酸序列，所述分离的核酸序列源自由癌细胞释放的循环肿瘤dna，其中所述分离的核酸序列靶向与所述癌细胞具有相同细胞类型的细胞，所述组合物被配制用于施用给受试者。

实施方案2.如实施方案1所述的药物组合物，其中所述细胞是人细胞。

实施方案3.如实施方案1所述的药物组合物，其中所述分离的核酸序列靶向肺细胞。

实施方案4.如实施方案1所述的药物组合物，其中所述分离的核酸序列靶向胰腺细胞。

实施方案5.如实施方案1所述的药物组合物，其中所述分离的核酸序列靶向白细胞。

实施方案6.如实施方案1所述的药物组合物，其中所述分离的核酸序列在施用于所述细胞后穿过所述细胞的核膜。

实施方案7.如实施方案6所述的药物组合物，其中所述分离的核酸序列与seqidno:203-seqidno:277或seqidno:282中的任何一个具有至少80％的同一性。

实施方案8.如实施方案7所述的药物组合物，其中所述分离的核酸序列在穿过所述核膜后自身整合到所述受试者的基因组中。

实施方案9.如实施方案1所述的药物组合物，其中所述分离的核酸序列的长度为至少400个碱基对。

实施方案10.如实施方案1所述的药物组合物，其中所述分离的核酸序列的长度为400个碱基对至20,000个碱基对。

实施方案11.如实施方案1所述的药物组合物，其中由所述癌细胞释放的所述循环肿瘤dna包含转座子。

实施方案12.如实施方案11所述的药物组合物，其中所述转座子是ii型转座子。

实施方案13.如实施方案12所述的药物组合物，其中所述分离的核酸序列衍生自所述ii型转座子。

实施方案14.如实施方案1所述的药物组合物，其中所述分离的核酸序列是核酸构建体的一部分，所述核酸构建体包含与所述细胞异源的至少一个另外的核酸序列。

实施方案15.如实施方案14所述的药物组合物，其中所述至少一个另外的核酸序列包含组织选择性启动子。

实施方案16.如实施方案14所述的药物组合物，其中所述至少一个另外的核酸序列包含编码肽或蛋白的序列。

实施方案17.如实施方案14所述的药物组合物，其中所述至少一个另外的核酸序列包含用于并入靶基因组的整合信号序列。

实施方案18.如实施方案14所述的药物组合物，其中所述至少一种另外的核酸序列包含用于靶向所述细胞的指导序列。

实施方案19.如实施方案14所述的药物组合物，其中所述至少一个另外的核酸序列包含编码肽或蛋白的序列。

实施方案20.如实施方案19所述的药物组合物，其中所述肽或所述蛋白编码肿瘤抑制肽或肿瘤抑制蛋白。

实施方案21.如实施方案20所述的药物组合物，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是多发性骨髓瘤肿瘤抑制基因。

实施方案22.如实施方案20所述的药物组合物，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是胰腺癌肿瘤抑制基因。

实施方案23.如实施方案20所述的药物组合物，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是肺癌肿瘤抑制基因。

实施方案24.如实施方案20所述的药物组合物，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是视网膜母细胞瘤易感基因(rb)、肾母细胞瘤(wt1)、神经纤维瘤病1型(nf1)、家族性腺瘤性息肉病(fap)、vonhippel-lindau综合征(vhl)、野生型p53或超阻遏物p53中的任一种。

实施方案25.如实施方案19所述的药物组合物，其中所述肽或所述蛋白编码抗原蛋白。

实施方案26.如实施方案25所述的药物组合物，其中所述抗原蛋白在施用于所述受试者后在所述细胞中被特异性地翻译。

实施方案27.如实施方案1所述的药物组合物，其中所述组合物还包含货物。

实施方案28.如实施方案27所述的药物组合物，其中所述货物是荧光团或放射性同位素。

实施方案29.如实施方案27所述的药物组合物，其中所述货物是治疗性药物。

实施方案30.如实施方案27所述的药物组合物，其中所述制剂包含纳米颗粒或阳离子聚合物。

实施方案31.在一些实施方案中，本公开内容提供了一种基因递送系统，其包括：a)包含3’核酸序列的第一区域，其中所述3’细胞核酸序列衍生自从癌细胞分离的转座子，b)包含基因编码序列的第二区域；和c)包含5’核酸序列的第三区域，其中所述5’细胞核酸序列衍生自分离自所述癌细胞的所述转座子。

实施方案32.如实施方案31所述的基因递送系统，其中所述3’细胞核酸序列或衍生自所述转座子的所述5’核酸序列包含细胞靶向信号。

实施方案33.如实施方案31所述的基因递送系统，其中所述3’细胞核酸序列或衍生自所述转座子的所述5’核酸序列包含细胞整合信号。

实施方案34.如实施方案31所述的基因递送系统，其中所述第一区域进一步包含任选的指导序列。

实施方案35.如实施方案31所述的基因递送系统，其中所述第二区域进一步包含驱动所述目的基因表达的组织特异性启动子。

实施方案36.在一些实施方案中，本公开内容提供了分离的核酸，所述分离的核酸包含衍生自癌细胞释放的循环肿瘤dna的序列，其中所述分离的核酸序列被与所述癌细胞具有相同细胞类型的细胞摄取。

实施方案37.如实施方案36所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸不被与所述癌细胞不同细胞类型的第二细胞类型摄取。

实施方案38.如实施方案36所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸穿过所述细胞的核膜。

实施方案39.如实施方案36所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸被肺细胞摄取。

实施方案40.如实施方案36所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸被胰腺细胞摄取。

实施方案41.如实施方案36所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸被肺细胞摄取。

实施方案42.如实施方案36所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸具有与seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282具有至少80％相似性的序列。

实施方案43.如实施方案42所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸具有与seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282具有至少80％相似性的序列，并且包含相对seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282的至少一个置换修饰。

实施方案44.在一些实施方案中，本公开内容提供了包含如实施方案36所述的分离的核酸序列和异源核酸序列的载体。

实施方案45.在一些实施方案中，本公开内容提供了两种或更多种分离的核酸序列的文库，所述分离的核酸序列包含如实施方案36所述的两种或更多种分离的核酸序列。

实施方案46.在一些实施方案中，本公开内容提供了分离的核酸，所述分离的核酸包含衍生自癌细胞释放的循环肿瘤dna的序列，其中所述分离的核酸序列穿过与所述癌细胞具有相同细胞类型的细胞的核膜，并且自身整合到所述细胞的基因组中。

实施方案47.如实施方案46所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸不被与所述癌细胞不同细胞类型的第二细胞类型摄取。

实施方案48.如实施方案46所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸自身整合到肺细胞的基因组中。

实施方案49.如实施方案46所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸自身整合到胰腺细胞的基因组中。

实施方案50.如实施方案46所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸自身整合到肺细胞的基因组中。

实施方案51.如实施方案46所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸具有与seqidno:203-seqidno:277或seqidno:282具有至少80％相似性的序列。

实施方案52.如实施方案51所述的分离的核酸，其中所述分离的核酸具有与seqidno:203-seqidno:277或seqidno:282具有至少80％相似性的序列，并且包含相对于seqidno:203-seqidno:277或seqidno:282的至少一个置换修饰。

实施方案53.在一些实施方案中，本公开内容提供包含如实施方案46所述的分离的核酸序列和异源核酸序列的载体。

实施方案54.在一些实施方案中，本公开内容提供两种或更多种分离的核酸序列的文库，所述分离的核酸序列包含如实施方案46所述的两种或更多种人核酸转座子序列。

实施方案55.在一些实施方案中，本公开内容提供了一种方法，其包括：a)获得受试者的生物样品；b)通过使探针与所述生物样品接触并检测所述探针与所述核酸序列之间的杂交，来检测所述生物样品中是否存在与seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282具有至少80％序列同一性的核酸序列；以及c)基于是否通过所述杂交检测到所述核酸来表征所述受试者的所述生物样品的健康状态。

实施方案56.如实施方案55所述的方法，其中所述核酸是脱氧核糖核酸。

实施方案57.如实施方案55所述的方法，其中所述核酸是无细胞的脱氧核糖核酸。

实施方案58.如实施方案55所述的方法，其中所述核酸序列的长度为至少400个碱基对。

实施方案59.如实施方案58的方法，其中所述核酸序列的长度为400个碱基对至20,000个碱基对。

实施方案60.如实施方案55所述的方法，其中所述健康状态是癌症。

实施方案61.如实施方案60所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌。

实施方案62.如实施方案60所述的方法，其中所述癌症是骨髓瘤。

实施方案63.如实施方案55所述的方法，其中所述生物样品是尿液、唾液或痰。

实施方案64.如实施方案55所述的方法，其中所述生物样品是组织学组织。

实施方案65.如实施方案55所述的方法，其中所述探针与所述核酸序列的区域互补。

实施方案66.在一些实施方案中，本公开内容提供了一种方法，其包括：a)获得受试者的生物样品；b)通过一个或多个选自以下的方法来定量所述生物样品中与seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282具有至少80％序列同一性的核酸序列的水平：逆转录、多核苷酸扩增或测序；c)在计算机系统中，将所述核酸序列的所述量化水平与参比进行比较；以及d)基于是否通过所述一个或多个方法检测到所述核酸来表征所述受试者的所述生物样品的健康状态。

实施方案67.如实施方案66所述的方法，其中所述核酸是脱氧核糖核酸。

实施方案68.如实施方案66所述的方法，其中所述核酸是无细胞的脱氧核糖核酸。

实施方案69.如实施方案66所述的方法，其中所述核酸序列的长度为至少400个碱基对。

实施方案70.如实施方案66的方法，其中所述核酸序列的长度为400个碱基对至20,000个碱基对。

实施方案71.如实施方案66所述的方法，其中所述健康状态是癌症。

实施方案72.如实施方案71所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌。

实施方案73.如实施方案71所述的方法，其中所述癌症是骨髓瘤。

实施方案74.如实施方案71所述的方法，其中所述癌症是肺癌。

实施方案75.如实施方案66所述的方法，其中所述生物样品是尿液、唾液或痰。

实施方案76.如实施方案66所述的方法，其中所述生物样品是组织学组织。

实施方案77.在一些实施方案中，本公开内容提供了一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括：给患有所述癌症的受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物包含衍生自人转座子序列的核酸序列和货物，所述组合物配制为给受试者施用。

实施方案78.如实施方案77所述的方法，其中所述癌症是肺癌。

实施方案79.如实施方案77所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。

实施方案80.如实施方案77所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌。

实施方案81.如实施方案77所述的方法，其中所述分离的核酸序列在施用于所述细胞后穿过所述细胞的核膜。

实施方案82.如实施方案77所述的方法，其中衍生自所述人转座子的所述核酸序列与seqidno:1-seqidno:277或seqidno:282中的任何一个具有至少80％的同一性。

实施方案83.如实施方案77所述的方法，其中衍生自所述人转座子的所述核酸序列在穿过核膜后将自身整合到所述受试者的基因组中。

实施方案84.如实施方案77所述的方法，其中衍生自所述人转座子的所述核酸序列的长度为至少400个碱基对。

实施方案85.如实施方案77所述的方法，其中衍生自所述人转座子的所述核酸序列的长度为400个碱基对至20,000个碱基对。

实施方案86.如实施方案77所述的方法，其中所述人转座子是ii型转座子。

实施方案87.如实施方案77所述的方法，其中衍生自所述人转座子的所述核酸序列是核酸构建体的一部分，所述核酸构建体包含与所述细胞异源的至少一个另外的核酸序列。

实施方案88.如实施方案87所述的方法，其中所述至少一个另外的核酸序列包含组织选择性启动子。

实施方案89.如实施方案87所述的方法，其中所述至少一个另外的核酸序列包含编码肽或蛋白的序列。

实施方案90.如实施方案87所述的方法，其中所述至少一个另外的核酸序列包含用于并入靶基因组的整合信号序列。

实施方案91.如实施方案87所述的方法，其中所述至少一种另外的核酸序列包含用于靶向所述细胞的指导序列。

实施方案92.如实施方案87所述的方法，其中所述至少一个另外的核酸序列包含编码肽或蛋白的序列。

实施方案93.如实施方案92所述的方法，其中所述肽或所述蛋白编码肿瘤抑制肽或肿瘤抑制蛋白。

实施方案94.如实施方案93所述的方法，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是多发性骨髓瘤肿瘤抑制基因。

实施方案95.如实施方案93所述的方法，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是胰腺癌肿瘤抑制基因。

实施方案96.如实施方案93所述的方法，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是肺癌肿瘤抑制基因。

实施方案97.如实施方案93所述的方法，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是视网膜母细胞瘤易感基因(rb)、肾母细胞瘤(wt1)、神经纤维瘤病1型(nf1)、家族性腺瘤性息肉病(fap)、vonhippel-lindau综合征(vhl)、野生型p53或超阻遏物p53中的任一种。

实施方案98.如实施方案89所述的方法，其中所述肽或所述蛋白编码抗原蛋白。

实施方案99.如实施方案98所述的方法，其中所述抗原蛋白在施用于所述受试者后在所述细胞中被特异性地翻译。

实施方案100.如实施方案77所述的方法，其中所述组合物还包含货物。

实施方案101.如实施方案100所述的方法，其中所述货物是荧光团或放射性同位素。

实施方案102.如实施方案100所述的方法，其中所述货物是治疗性药物。

实施方案103.如实施方案77所述的方法，其中所述制剂包含纳米颗粒或阳离子聚合物。

实施方案104.在一些实施方案中，本公开内容提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的核酸构建体，所述核酸构建体包含a)第一脱氧核糖核酸序列，所述第一脱氧核糖核酸序列指导所述核酸构建体在体内迁移至预选组织；和b)第二脱氧核糖核酸序列，所述第二脱氧核糖核酸序列指导所述核酸构建体的区域在体内整合到所述预选组织的细胞的基因组中；所述药物组合物被配制用于施用至受试者。

实施方案105.如实施方案104所述的药物组合物，其中所述第一脱氧核糖核酸序列来自与来自所述预选组织的所述细胞相同的细胞类型。

实施方案106.如实施方案104所述的药物组合物，其中所述受试者是人。

实施方案107.如实施方案104所述的药物组合物，其中所述第一脱氧核糖核酸序列迁移至白细胞。

实施方案108.如实施方案104所述的药物组合物，其中所述第一脱氧核糖核酸序列迁移至胰腺细胞。

实施方案109.如实施方案104所述的药物组合物，其中所述第一脱氧核糖核酸序列迁移至肺细胞。

实施方案110.如实施方案104所述的药物组合物，其中当施用于所述受试者时，所述核酸构建体穿过所述预选组织的所述细胞的核膜。

实施方案111.如实施方案104所述的药物组合物，其中所述第一脱氧核糖核酸序列与seqidno:203-seqidno:277和seqidno:282中任一个的至少12个碱基具有至少90％的同一性。

实施方案112.如实施方案104所述的药物组合物，其中所述第一脱氧核糖核酸序列的长度为至少400个碱基对。

实施方案113.如实施方案104所述的药物组合物，其中所述第一脱氧核糖核酸序列的长度为400个碱基对至20,000个碱基对。

实施方案114.如实施方案104所述的药物组合物，其中所述第二脱氧核糖核酸序列与转座子序列具有至少90％的同源性。

实施方案115.如实施方案114所述的药物组合物，其中所述转座子是ii型转座子。

实施方案116.如实施方案105所述的药物组合物，其中所述ii型转座子通过水平基因转移将自身整合到所述预选组织的所述细胞的所述基因组中。

实施方案117.如实施方案104所述的药物组合物，其中所述核酸构建体包含至少一个另外的脱氧核糖核酸序列。

实施方案118.如实施方案117所述的药物组合物，其中所述至少一个另外的脱氧核糖核酸序列包含组织选择性启动子。

实施方案119.如实施方案117所述的药物组合物，其中所述至少一个另外的脱氧核糖核酸序列包含用于并入所述基因组的第二整合信号。

实施方案120.如实施方案117所述的药物组合物，其中所述至少一个另外的脱氧核糖核酸序列包含编码肽或蛋白的序列。

实施方案121.如实施方案120所述的药物组合物，其中所述至少一个另外的脱氧核糖核酸序列包含用于确保所述肽或蛋白仅在所述预选组织的所述细胞内表达的序列。

实施方案122.如实施方案120所述的药物组合物，其中所述肽或所述蛋白编码肿瘤抑制肽或肿瘤抑制蛋白。

实施方案123.如实施方案122所述的药物组合物，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是多发性骨髓瘤肿瘤抑制基因。

实施方案124.如实施方案122所述的药物组合物，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是胰腺癌肿瘤抑制基因。

实施方案125.如实施方案122所述的药物组合物，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是肺癌肿瘤抑制基因。

实施方案126.如实施方案122所述的药物组合物，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是视网膜母细胞瘤易感基因(rb)、肾母细胞瘤(wt1)、神经纤维瘤病1型(nf1)、家族性腺瘤性息肉病(fap)、vonhippel-lindau综合征(vhl)、野生型p53或超阻遏物p53中的任一种。

实施方案127.如实施方案120所述的药物组合物，其中所述肽或所述蛋白编码抗原蛋白。

实施方案128.如实施方案127所述的药物组合物，其中所述抗原蛋白在施用于所述受试者后在所述细胞中被特异性地翻译。

实施方案129.如实施方案104所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含货物。

实施方案130.如实施方案127所述的药物组合物，其中所述货物是荧光团或放射性同位素。

实施方案131.如实施方案127所述的药物组合物，其中所述货物是治疗性药物。

实施方案132.如实施方案127所述的药物组合物，其中所述货物共价连接至所述核酸构建体。

实施方案133.如实施方案127所述的药物组合物，其中所述制剂包含纳米颗粒或阳离子聚合物。

实施方案134.在一些实施方案中，本公开内容提供了一种载体，包含第一序列和另外的核酸序列，所述第一序列与seqidno:203-seqidno:277和seqidno:282中任何一个的至少12个碱基具有至少90％的同一性。

实施方案135.如实施方案134所述的载体，其中所述另外的核酸序列与转座子序列具有至少90％的同源性。

实施方案136.如实施方案135所述的载体，其中所述转座子是ii型转座子。

实施方案137.如实施方案136所述的载体，其中所述ii型转座子通过水平基因转移将自身整合到所述预选组织的所述细胞的所述基因组中。

实施方案138.如实施方案134所述的载体，其中所述载体包含至少两个另外的核酸序列。

实施方案139.如实施方案138所述的载体，其中所述至少两个另外的核酸序列包含组织选择性启动子和转座子序列。

实施方案140.如实施方案138所述的载体，其中所述至少两个另外的核酸序列包含至少两个转座子序列。

实施方案141.如实施方案134所述的载体，其中所述另外的核酸序列包含编码肽或蛋白的序列。

实施方案142.如实施方案141所述的载体，其中所述肽或所述蛋白是肿瘤抑制肽或肿瘤抑制蛋白。

实施方案143.如实施方案142所述的载体，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是多发性骨髓瘤肿瘤抑制基因。

实施方案144.如实施方案142所述的载体，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是胰腺癌肿瘤抑制基因。

实施方案145.如实施方案142所述的载体，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是肺癌肿瘤抑制基因。

实施方案146.如实施方案142所述的载体，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是视网膜母细胞瘤易感基因(rb)、肾母细胞瘤(wt1)、神经纤维瘤病1型(nf1)、家族性腺瘤性息肉病(fap)、vonhippel-lindau综合征(vhl)、野生型p53或超阻遏物p53中的任一种。

实施方案146.如实施方案134所述的载体，其中所述载体与货物共价连接。

实施方案147.如实施方案146所述的载体，其中所述货物是荧光团或放射性同位素。

实施方案148.如实施方案146所述的载体，其中所述货物是治疗性药物。

实施方案149.在一些实施方案中，本公开内容提供了如实施方案134所述的两种或更多种载体的文库。

实施方案150.在一些实施方案中，本公开内容提供了一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括：施用有效量的核酸构建体，所述核酸构建体包含指导货物迁移到患有所述癌症的受试者的组织的核酸序列，所述组合物被配制为施用给受试者。

实施方案151.如实施方案150所述的方法，其中所述癌症是肺癌。

实施方案152.如实施方案150所述的方法，其中所述癌症是多发性骨髓瘤。

实施方案153.如实施方案150所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌。

实施方案154.如实施方案150所述的方法，其中所述核酸构建体在施用给所述受试者后穿过所述组织的细胞中的核膜。

实施方案155.如实施方案150所述的方法，其中指导所述货物迁移到所述组织的所述核酸序列与seqidno:203-seqidno:277和seqidno:282中任一个的至少12个碱基具有至少90％的同一性。

实施方案155.如实施方案150所述的方法，其中所述核酸构建体包含用于整合到所述组织的细胞的基因组中的转座子。

实施方案156.如实施方案155所述的方法，其中所述转座子的长度为至少400个碱基对。

实施方案157.如实施方案155所述的方法，其中所述转座子的长度为400个碱基对至20,000个碱基对。

实施方案158.如实施方案155所述的方法，其中所述转座子是ii型转座子。

实施方案159.如实施方案155所述的方法，其中所述核酸构建体包含与所述组织的细胞异源的至少一个另外的核酸序列。

实施方案160.如实施方案159所述的方法，其中所述至少一个另外的核酸序列包含组织选择性启动子。

实施方案161.如实施方案159所述的方法，其中所述至少一个另外的核酸序列包含编码肽或蛋白的序列。

实施方案162.如实施方案159所述的方法，其中所述至少一个另外的核酸序列包含用于并入靶基因组的整合信号。

实施方案163.如实施方案159所述的方法，其中所述至少一个另外的核酸序列包含用于靶向所述细胞的指导序列。

实施方案164.如实施方案159所述的方法，其中所述至少一个另外的核酸序列包含编码肽或蛋白的序列。

实施方案165.如实施方案164所述的方法，其中所述肽或所述蛋白编码肿瘤抑制肽或肿瘤抑制蛋白。

实施方案166.如实施方案165所述的方法，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是多发性骨髓瘤肿瘤抑制基因。

实施方案167.如实施方案165所述的方法，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是胰腺癌肿瘤抑制基因。

实施方案168.如实施方案165所述的方法，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是肺癌肿瘤抑制基因。

实施方案169.如实施方案165所述的方法，其中所述肿瘤抑制肽或所述肿瘤抑制蛋白是视网膜母细胞瘤易感基因(rb)、肾母细胞瘤(wt1)、神经纤维瘤病1型(nf1)、家族性腺瘤性息肉病(fap)、vonhippel-lindau综合征(vhl)、野生型p53或超阻遏物p53中的任一种。

实施方案170.如实施方案164所述的方法，其中所述肽或所述蛋白编码抗原蛋白。

实施方案171.如实施方案170所述的方法，其中所述抗原蛋白在施用于所述受试者后在所述组织的细胞中被特异性地翻译。

实施方案172.如实施方案150所述的方法，其中所述核酸构建体共价连接至荧光团或放射性同位素。

实施方案173.如实施方案150所述的方法，其中所述核酸构建体共价连接至治疗性药物。

实施方案174.在一些实施方案中，本公开内容提供了一种用于鉴定迁移至基本相似来源的组织或细胞的核酸序列的方法，所述方法包括：(a)从生物样品中分离循环肿瘤核酸，从而产生一组分离的肿瘤核酸；(b)向所述一组分离的循环肿瘤核酸添加条形码，从而提供多个条形码化的肿瘤核酸；(c)在允许整合组织嗜性序列的条件下，将来自所述多个条形码化的肿瘤核酸的至少一个条形码化的肿瘤核酸添加到细胞群中，从而产生培养的细胞群；(d)对所述培养的细胞群进行测序，从而产生多个测序读段；(e)由计算机分析所述测序读段，以鉴定来自包含所述条形码的所述多个测序读段的至少一个测序读段是否存在；和(f)分析包含所述条形码的测序读段，以鉴定存在于所述培养的细胞群而不存在于所述细胞群的序列的是否存在，从而鉴定迁移到所述目的组织或细胞的核酸序列。

实施例

以下实施例被包括在内以进一步描述本公开内容的某些方面，并且不应当用来限制本公开内容的范围。

实施例1：多发性骨髓瘤(mm)、肺癌和胰腺癌患者血清中反映组织来源的ctdna的鉴定

使用病毒提取dna试剂盒(qiaampultrasensviruskit，quiagen，germantown，md)然后滚环扩增(genomiphiv2，gehealthcare)来提取癌症患者循环中发现的大dna片段(约大于10kb)。比较了2例多发性骨髓瘤(mm)患者的cd138(+)分选细胞、外周血白细胞(pbl)细胞和血清样品在诊断时和治疗4个周期后的突变序列。

进一步处理和测序样品。简而言之，与来自非mm患者(即肺癌或胰腺癌)的对照样品相比，mm患者在诊断样品中具有更高水平的ctdna(图1)。跨所有样品平均覆盖深度约50×10⁶读段/外显子，对每个位置的碱基调用和归一化序列深度进行两两比较。使用varscan算法(http://dkoboldt.github.io/varscan)，每个ctdna鉴定出平均23,146个编码单核苷酸变异体(snv)，肿瘤或pbl中鉴定出24,000个编码snv，从而表征ctdna是整个外显子组突变分析的良好来源。此外，比较来自肿瘤或pbl的扩增的ctdna和未扩增的dna中的snv的数量，我们可以确定我们的扩增方法引入约0.03％的snv(扩增误差)。

接下来，提高了ctdna中体细胞突变的检测水平(lod)，并发现89.8％的体细胞突变存在于来源于cd138(+)细胞的诊断性dna中，7％为种系突变，3％为ctdna上未发现的突变。

实施例2：细胞识别和基因组整合信号的鉴定

该实施例例证了核酸序列的鉴定，所述核酸序列能够识别细胞和/或组织(zip编码)，并在易位到细胞的细胞核中时将核酸整合到细胞的基因组中(参见例如，图6-图7)。

细胞识别信号(crs)和整合信号(is)的鉴定过程在平行实验中进行。第一个实验(a)集中于鉴定位于循环肿瘤dna(ctdna)(例如实施例1中描述的循环肿瘤dna)的3’和5’末端的dna序列。第二个实验(b)集中于鉴定能够结合和整合到靶细胞基因组中的dna。

a.位于ctdna3’末端和5’末端的dna序列的鉴定。

样品处理。从6例多发性骨髓瘤患者、1例胰腺癌患者和1例健康志愿者(作为对照)中提取ctdna。随后，使用abmdna文库制备试剂盒，修复ctdna的两端并进行“a”加尾。一旦完成该过程，就将特异性pacbio序列条形码(gcgctctgtgtgct(seqidno:279))连接到核酸序列的任一端。这些步骤之后，提交样品用于使用illumina衔接子连接制备文库。使用illuminamiseq仪器进行全基因组测序(wgs)，其中深度覆盖为1亿拷贝。

wgs数据分析。所有与人线粒体基因组比对的读段都被移除。对读段进行二次取样，然后用spades进行组装，结果共获得1700万个重叠群。然后使用cd-hit以99％的同一性对组装的重叠群进行聚簇。选择包含所有多发性骨髓瘤样品但不包含对照和胰腺癌样本的簇的矩心(centroid)，结果产生180个剩余的重叠群，这些重叠群的3’或5’末端也具有pacbio条形码。

b.鉴定能够穿过细胞和核膜并整合到细胞基因组中的dna序列。使用来自多发性骨髓瘤细胞系的细胞、从多发性骨髓瘤患者(772)提取的供体ctdna以及来自与提取的ctdna共培养的多发性骨髓瘤细胞系的细胞(772)进行全基因组测序。然后对来自这3个细胞种类的fastq文件中的所有读段生成k-mer。然后通过保留那些含有k-mer(通过bowtie2作图)的重叠群来进一步过滤重叠群，所述k-mer存在于772共培养物和供体ctdna样品中但不存在于多发性骨髓瘤细胞系的浆细胞样品中。这些步骤之后，重叠群的数量减少到75。

细胞识别信号的鉴定。

为此，使用burrows-wheeleraligner(bwa)将实验(a)中发现的读段与实验(b)中鉴定的75个重叠群进行比对，并使用samtools/bcftools鉴定调用的变异体。随后，基于调用的变异体，使用bcftools对每个样品进行共有序列(重叠群)鉴定，以找到与对照或胰腺癌相比仅针对多发性骨髓瘤特异性的变异区域。在骨髓瘤中没有突变但在胰腺癌或对照ctdna中高度突变的区域被标记为将成为潜在的细胞识别信号的目标区域。

实施例3：循环肿瘤dna能穿过细胞膜和核膜

用cx罗丹明共价标记mm、肺癌或胰腺癌患者的ctdna。将100ngctdna加载到培养基中后，在如图3b所示的不同的时间点收获细胞。在mm中，在引入后，早在30分钟时就观察到ctdna出现在细胞质中，24小时后就定位在细胞核中。在胰腺癌细胞系的情况下，在15分钟内观察到ctdna细胞质内化，在50分钟内观察到核定位(图2a-2c和图3a-3b)。有趣的是，我们的三维和单平面视频显示，在细胞内化过程中，ctdna被gfp(+)细胞膜包围，提示ctdna内化是由内吞介导的。

实施例4：ctdna诱导dna损伤

对mm细胞及其相应的ctdna进行了评估，观察到ctdna并不能穿过每一个细胞的核膜。在一些情况下，观察到核碎裂，提示导入细胞质或细胞核的ctdna负载量可以决定靶细胞的命运。有趣的是，通过这些细胞中的阳性h2ax灶鉴定并证实了双链dna(dsdna)断裂。

实施例5：ctdna只靶向与其起源细胞相似的细胞

该实施例证明来自与靶细胞相同来源的ctdna快速穿透靶细胞的核膜，而相同ctdna不进入来自不同来源(例如细胞类型或组织)的细胞的细胞核。

将从mm、肺癌或胰腺癌患者获得的经标记的ctdna加入到匹配癌细胞系(即，mm、肺癌或胰腺癌细胞系)的培养基中。如前面的实施例所示，在引入后24小时在细胞核中检测到ctdna。

然而，研究发现，当ctdna加入到与各自ctdna来源的癌症类型不相似的细胞系中时，ctdna未能易位到细胞质和细胞核中。这表明细胞识别中存在一定程度的特异性。此外，在不囿于任何理论，假设由于从血清中提取ctdna是非常严格的程序，因此ctdna的序列或固有修饰(例如，dna甲基化模式)可能驱动细胞识别，而不是细胞膜(外泌体)片段或携带ctdna的蛋白质的片段。

因此，这些结果表明，在mm细胞的细胞核中检测到来自mm细胞的ctdna，但是，来源于mm的ctdna未定位于肺癌或胰腺癌细胞的细胞核内。同样地，研究表明在mm细胞的细胞核中检测到来自肺癌患者(腺癌)的ctdna，然而，来源于腺癌的ctdna并没有迁移到或被引入mm或胰腺癌细胞中。最后，表明来自胰腺癌患者的ctdna仅被引入胰腺癌细胞的细胞质和细胞核，而不被引入肺癌或多发性骨髓瘤细胞系(参见例如图1，图4)

在另一个实验中，证明了来源于肿瘤的ctdna以肿瘤特异性的方式归巢至肿瘤细胞，从而只有相应ctdna来源的肿瘤细胞才被靶向。图16a示出来源于多发性骨髓瘤(mm)的循环肿瘤dna(ctdna)以细胞和组织特异性的方式归巢至mm细胞。以红色突出显示的区域表示罗丹明标记的dna，蓝色区域显示dapi染色。图16b示出来源于肺癌(lc)的循环肿瘤dna(ctdna)以细胞和组织特异性的方式归巢至lc细胞。以红色突出显示的区域表示罗丹明标记的dna，蓝色区域显示dapi染色。图16c示出来源于结肠癌(cc)的循环肿瘤dna(ctdna)以细胞和组织特异性的方式归巢至cc细胞。以红色突出显示的区域表示罗丹明标记的dna，蓝色区域显示dapi染色。图16d示出来源于结肠癌(pc)的循环肿瘤dna(ctdna)以细胞和组织特异性的方式归巢至pc细胞。以红色突出显示的区域表示罗丹明标记的dna，蓝色区域显示dapi染色。

这些结果证明了令人惊讶的发现，即来源于肿瘤的ctdna以肿瘤特异性的方式归巢至肿瘤细胞，从而只有相应ctdna来源的肿瘤细胞才被靶向。因此，本文所述的zip编码序列可用作细胞、组织和/或器官特异性靶向构建体，以高度特异性的方式向细胞递送治疗性和/或诊断性货物。

在竞争性ctdna的存在下，zip编码序列的细胞特异性摄取不受影响

设计了一个实验来证明在来自第二种肿瘤类型的ctdna的存在下，来自第一种肿瘤类型的ctdna的细胞特异性(例如起源细胞)的zip编码序列的摄取不受影响。

图17a显示即使存在竞争性结肠癌(cc)ctdna时(绿色显示)，来源于多发性骨髓瘤(mm)的循环肿瘤dna(ctdna)也以细胞和组织特异性的方式归巢至mm细胞(红色显示的是mmctdna)。在mm细胞中只观察到mmctdna，而没有观察到ccctdna。图17b显示即使存在竞争性的胰腺癌(pc)ctdna(绿色显示)，来源于多发性骨髓瘤(mm)的循环肿瘤dna(ctdna)也以细胞和组织特异性的方式归巢至mm细胞(红色显示的是mmctdna)。在mm细胞中只观察到mmctdna，而没有观察到pcctdna。

货物与ctdna的缀合不会影响细胞摄取和核定位

设计了一个实验来证明货物(例如，荧光染料等分子)与ctdna的缀合不影响ctdna分子定位于其起源的肿瘤细胞并进一步定位于此类细胞的细胞核的能力。

图17c显示用染料罗丹明标记来源于多发性骨髓瘤(mm)的循环肿瘤dna(ctdna)并不影响来源于mm的ctdna以细胞和组织特异性的方式在mm细胞中积累的能力(红色显示的是mmctdna-罗丹明构建体)。图17d显示用染料cy5标记来源于多发性骨髓瘤(mm)的循环肿瘤dna(ctdna)并不影响来源于mm的ctdna以细胞和组织特异性的方式在mm细胞中积累的能力(绿色显示的是mmctdna-cy5构建体)。

实施例6：ctdna整合到浆细胞染色体中

将来自第一个mm患者的罗丹明标记的ctdna置于来自不同mm患者的浆细胞的培养物中。24小时后，用卡奇霉素阻断细胞的细胞周期1小时，并进行染色体分散。然后用dapi染色标记细胞dna。如图5a中所示，ctdna标记的条带被整合到多个区域的染色体中，每个中期具有平均5个整合位点。

ctdna整合到靶细胞基因组中需要非同源末端连接修复系统成员的存在，并可通过使用非同源末端连接修复的转座子介导的机制发挥作用。

为了进一步评估，来自mm和肺癌细胞系的染色体分散与从mm患者获得的共价标记的ctdna进行培养。结果表明，在浆细胞染色体中并入了罗丹明条带。当使用dnapkcs(dna-pkcs抑制剂i，200nm)、atm(ku-55933)或甘露糖苷酶setmar/整合酶(拉替拉韦，30nm)抑制剂时，经标记的ctdna并入显著减少，而当使用聚adp核糖聚合酶抑制剂(parp，nu1025，200nm)时，经标记的ctdna也并入较少(图5b)。此外，图5c显示ctdna的染色体整合依赖于非同源末端连接(nhej)和转座酶。当dnapkcs、atm、parp-1和整合酶(拉替拉韦)的抑制剂存在时，经标记的ctdna并入显著减少。观察到parp-1抑制作用没有显著降低。

在ctdna与浆细胞的共培养过程中，出乎预料地发现具有衍生自ctdna的seqidno:99的重叠群序列插入到浆细胞的基因组中。

例如，图18显示mmctdna整合到mm细胞的染色体dna中(红点显示mmctdna)。在这项研究中使用测序验证了mmctdna的染色体整合。图19通过例如证明整合到肿瘤染色体中的ctdna的序列比对匹配和仅来自ctdna的序列比对匹配，示意性地说明了染色体整合的验证。

实施例7：ctdna的5’和3’末端经常含有转座元件，并且来自这种转座元件的区域(zcs)特异性地靶向一个或多个细胞群体

该实施例显示通过将衔接子(pacbio)连接到ctdna的两端以标记5’和3’末端，使得ctdna的5’和3’末端经常含有转座元件(te)，从而能够在测序时识别ctdna的起始和终止。连接后进行常规的基于illumina的文库制备方法。

将pacbio条形码连接到从4例mm患者(mm2025、mm910、mm2024和mm772)、1例胰腺癌患者和对照(健康志愿者)获得的ctdna的5’和3’末端。使用illumina文库制备试剂盒(例如，illuminatruseqstrandeddna文库制备试剂盒)对pacbio-标记的ctdna进行标准文库制备。通过搜索pacbio条形码的存在来鉴定目的序列。一旦序列被鉴定并分选，就进行从头组装。随后，对样品之间的连续(即重叠群)序列进行比较，鉴定了一组跨所有mm样品的共有的重叠群，其序列相似性大于99％。图8a-8b显示聚类分析的结果，该聚类分析使用从每个样品的重叠群调用的变体衍生的共有序列。与对照组和胰腺癌相比，mm样品聚簇在一起，提示mm重叠群的结构彼此非常相似，仅存在于mm细胞中。通过循环dna的提取和多种扩增方法，也表明在像骨髓瘤的疾病中，循环肿瘤dna(ctdna)反映了97％的肿瘤基因组。

用girirepbase软件分析和鉴定所有重叠群的转座子的存在、位置和类型。分析结果表明，所有重叠群都具有高含量的转座子。有趣的是，大多数重叠群在序列的最末端具有转座子，如显示转座子的位置和类型的索引重叠群所示(图6)。

实施例8：在异种移植模型中ctdna序列特异靶向肿瘤细胞并避免在脱靶组织中摄取

该实施例证明了来源于癌症的、包含zcs的人细胞靶向核酸序列特异性地靶向体内相同来源的肿瘤细胞而在脱靶组织中则表现出很低的摄取甚至没有摄取。

为了评估ctdna识别体内特定靶组织的能力，使用人来源的胰腺细胞系mt5建立异种移植小鼠模型。具体而言，将一百万个细胞双侧注射到免疫缺陷的bnx小鼠的背部。达到约0.5cm的肿瘤体积后，将小鼠分配到特定的实验组。队列#1和#2的小鼠经尾静脉注射罗丹明标记的胰腺癌患者来源的ctdna。分别在注射后24小时和48小时收获肿瘤。队列#3在肿瘤收获前24小时将罗丹明-ctdna构建体直接注射到肿瘤中。队列#4为阴性对照，在肿瘤收获前24小时接受pbs尾部注射。在收获时，分离肿瘤和选定的器官(肝、肺和脾)并进行冷冻切片。组织切片用多聚甲醛(4％v/v)固定，随后用4’,6-二眯基-2-苯基吲哚(dapi)染色。

共聚焦显微镜检查显示肿瘤中而不是其他组织中存在不同水平的罗丹明标记的ctdna构建体。与施用后24小时收获的肿瘤细胞相比，在收获前48小时注射(图9c，图10c)的肿瘤细胞显示出高得多的经标记的ctdna的浓度，两者通过尾静脉注射(图9b，图10b)和直接肿瘤注射(图9a)，与仅接受pbs的对照小鼠相比(图9d，图10a)。类似地，与施用后24小时收获的肿瘤相比(图9a-图9b)，注射后48小时收获的肿瘤中，罗丹明-ctdna构建体的核定位显著更高(图9c)。在潜在的清除器官如肝、肺或脾中对罗丹明-ctdna摄取的评估显示，在这些器官中没有检测到罗丹明-ctdna构建体的摄取。

因此，这些结果证明了ctdna对于相同来源的肿瘤组织(本例为胰腺癌)的高度特异性。体内模型显示，从胰腺癌患者获得的ctdna专门靶向胰腺癌细胞，而没有显示在其他器官(包括肝或网状内皮组织系统)中有任何摄取。因此，ctdna的zip编码序列可以实现对相同来源的组织的高度特异性靶向。

实施例9：zip编码基因递送在治疗和监测多种疾病中的用途

该实施例例证了使用zip编码基因递送治疗和监测多种疾病如何可以提供相比于采用病毒载体递送系统的现有技术的明显优势。

以前已经表明循环dna(cdna)能够在细胞间交换遗传信息。如上文前述实施例所示，证明cdna还能够进入细胞核并整合到靶细胞的染色体中(参见图11)。这可能发生在不需要脂质膜包裹(如外泌体、微泡)的情况下。此外，上文表明cdna细胞靶向性对相同来源的细胞具有选择性。例如，结果表明来源于肺的cdna只穿透肺组织(或来源于肺组织)细胞的核膜，而不穿透其他组织类型的细胞的核膜。此外，cdna进入细胞核后通过引起双链dna断裂而导致基因组不稳定性，从而促进其整合到细胞基因组中。

考虑到使用常规病毒载体系统作为基因递送载体的缺点，例如脱靶突变的风险，本公开内容的使用新鉴定的组织/细胞特异性识别序列(即zip编码序列)的新方法可在组织靶向和/或货物递送期间提供显著降低的脱靶效应。

实施例10：zip编码序列在疾病诊断和治疗监测中的用途

本公开内容的细胞和组织特异性核酸序列(即，zcs)可用于疾病的诊断和分期以及用于监测对治疗干预的应答。例如，从具有肿瘤的受试者中提取的ctdna可以作为疾病阶段和严重程度的生物标记。

分析从受试者提取的ctdna的细胞和组织特异性识别信号和整合信号。每ml血清检测到的包含这些识别信号和整合信号的核酸序列的数量可用于评估疾病的阶段。例如，来自ctdna的zcs的浓度可与转移性疾病阶段相关联。

此外，在受试者血液中鉴定的细胞和组织特异性识别信号的类型以及它们的浓度可以提供关于原发肿瘤的起源组织和转移或转移微环境形成的可能部位的信息。

施用后，通过受试者血液样品的pcr监测本文所述的核酸构建体在靶组织细胞中的摄取，循环核酸构建体的减少是其在靶组织中摄取的量度。可替代地，如上所述，使用放射性标记的核酸构建体提供了一种在全身施用后体内跟踪(例如，在目的靶组织中摄取)构建体的非侵入性方法。

实施例11：作为治疗剂的细胞特异性zip编码序列

该实施例表明，本公开内容的zcs可用于治疗性和/或诊断性货物(例如，治疗性蛋白或多肽、小分子治疗剂、放射性核素)的细胞和/或组织特异性递送。具体地，该实施例例证了编码治疗性蛋白的目的基因的细胞特异性递送和整合。

如上文实施例2中所述鉴定细胞特异性识别序列和基因组整合序列。编码治疗性蛋白(例如表面抗原cd19)的目的基因可以在3’和5’末端两侧是整合信号序列，所述整合信号序列两侧是细胞识别序列(参见例如，图12)，以产生治疗性核酸构建体。

将与用于鉴定靶向和整合信号的ctdna具有相同组织类型或来源的细胞与治疗性核酸构建体孵育。在cd19编码转基因的情况下，收获细胞并使用荧光辅助细胞分选(facs)分析cd19表面表达。细胞也用抗cd19抗体染色，并确定每个细胞的表达密度，这间接用作核酸构建体整合效率的量度。

基于体外结果所示的核酸构建体的性能，核酸递送系统的几个参数可以通过使用不同的识别和整合序列并且任选地使用用于增强细胞特异性靶向和蛋白质表达的指导序列进行几轮体外实验来优化。

实施例12：肿瘤细胞特异性zip编码序列向肿瘤递送自杀基因并诱导肿瘤消退

该实施例表明，本公开内容的肿瘤特异性zcs几乎排他地靶向肿瘤细胞并在肿瘤细胞中积累。而且，这样的肿瘤特异性zcs将自杀基因递送到肿瘤，并诱导肿瘤大小的显著减小。该实施例表明在在多发性骨髓瘤(mm)异种移植模型中多发性骨髓瘤zip编码序列在体内将自杀基因递送给肿瘤细胞并诱导肿瘤消退。

在该实施例中，单纯疱疹病毒胸苷激酶(例如hsv-tk)被用作用于癌症治疗的自杀基因。人类单纯疱疹病毒胸苷激酶1型基因(例如hsvtk)被用作哺乳动物肿瘤细胞中的条件致死标记。在转录和翻译成酶胸苷激酶-1后，这种酶能将核苷类似物(如更昔洛韦、吉西他滨等)转化为毒性dna复制抑制剂。因此，在提出研究的本文中，使用本文公开的肿瘤特异性zcs，然后使用更昔洛韦(gcv)治疗，将单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)基因转移到荷瘤小鼠的癌细胞中。

肿瘤异种移植模型

通过将大约500万个人来源的多发性骨髓瘤细胞系(例如mm1s)的细胞注射到两只bnx小鼠的背部来诱导肿瘤。在肿瘤体积达到2cm后，向小鼠注射2μg的连接到含有cmv-hsv-tk的核酸片段的mmzip编码序列(seqidno:282)。注射后48小时，每天腹膜内使用更昔洛韦(100μg/kg)来治疗两只小鼠。使用电子卡尺每天进行肿瘤测量。基于最长轴和最短轴的测量以及肿瘤的宽度来计算肿瘤体积(参见，图13)。

结果

肿瘤测量显示两种动物的肿瘤大小持续减小。小鼠#1在治疗4天后因不明原因死亡。图13a和图13b显示了使用更昔洛韦治疗5天后用hsv-tk基因递送治疗的小鼠#2中观察到的肿瘤体积的变化。图13c和下文的表1显示了接受基因治疗联合更昔洛韦治疗的两只动物的肿瘤体积的测量变化。

表1-治疗性基因递送实验中肿瘤体积的测量

这些结果清楚地验证了在本公开内容中提供的zip编码序列的特异性。在体内模型中mm靶向zip编码序列靶向mm肿瘤并递送功能性转基因。与随后施用的核苷类似物更昔洛韦联合治疗明显显示肿瘤大小显著减小，表明zip编码序列将自杀基因递送给肿瘤细胞。

实施例13：多发性骨髓瘤(mm)特异性zip编码序列对mm肿瘤细胞具有高度特异性

该实施例表明，与荷瘤小鼠的其他组织相比，本公开内容的多发性骨髓瘤(mm)特异性zcs几乎排他地靶向肿瘤细胞并在肿瘤细胞中积累。

使用如上文实施例12中所述的基因治疗-核苷类似物联合诱导肿瘤异种移植并治疗荷瘤小鼠。

对动物实施安乐死并获得包括肿瘤、肺和其他的器官。制备来自每个器官的组织样品用于pcr分析以评估每个组织中表达的单纯疱疹病毒-胸苷激酶-1(hsv-tk-1)的水平。

图14a和图14b显示在接受mmzip编码-hsv-tk的基因治疗后并在48小时后，使用更昔洛韦(100μg/kg)治疗5天后，来自小鼠#2的多个组织的pcr结果。pcr结果清楚地显示了仅在肿瘤细胞和肿瘤组织中存在对应于单纯疱疹病毒胸苷激酶-1的条带，而在本研究中分析的任何其他器官中均不存在该条带，证明了本文公开的zip编码序列和相关构建体的高度细胞和组织特异性。数字表示：(1)分子量梯；(2)肿瘤；(3)肺，(4)脾，(5)肝，(6)胰腺，(7)脑和(8)肾。

这些数据证明了本公开内容的zip编码序列的高细胞特异性和组织特异性。观察到的对它们各自的起源细胞和/或组织的高特异性可允许使用本文所述的zip编码核酸序列的改进的基因递送和基因治疗和诊断方法。

实施例14：多发性骨髓瘤(mm)特异性zip编码序列将转基因递送到mm细胞中并允许后续转基因表达

该实施例证明本文所述的多发性骨髓瘤(mm)特异性zip编码序列将转基因递送到mm细胞中并允许后续转基因表达。

图20示意性地示出了本公开内容的mm特异性zip编码序列构建体。这样的构建体包括在任一位点两侧的两个zip编码序列(例如，长度约300bp)，该构建体包括翻译元件(例如，ires)、gfp编码序列、启动子、荧光素酶编码序列和一个或多个罗丹明染料分子的构建体，该罗丹明染料分子连接到所述构建体的荧光素酶-和/或ires-编码部分，并且用于在体外和/或体内跟踪所述构建体(或其片段)的移动。

评估图20中所描述的mm特异性zip编码构建体将转基因递送至mm肿瘤细胞以及后续表达转基因的能力。

图21a显示在mm细胞内与其定位相对应的zcs构建体(mmzip编码-pgk-gfp-mmzip编码)的gfp(绿色，左上方)表达和罗丹明检测，表明zcs构建体向mm细胞中有效递送、转基因的递送和所述转基因的表达。这表明本公开内容的zcs构建体可用于所述转基因的有效基因递送和后续表达。

包含线性pgk-gfp构建体而不含zip编码序列的阴性对照构建体没有显示出任何转基因表达。图21b显示仅使用线性pgk-gfp构建体并不显示任何细胞特异性的信号位置，从而确认zip编码序列是mmzip编码-pgk-gfp-mmzip编码构建体对mm细胞特异性摄取的原因。

图22显示了mmzip编码-噬菌体-gfp-ires-luc构建体被细胞摄取到mm细胞中的放大图。图像评估显示，使用该构建体将高达100％的基因递送到mm细胞中，这通过分析的几乎每个mm细胞都产生gfp来表明。

这些结果表明，本文所述的zip编码序列可用作高度特异性和高效的基因递送构建体。这些构建体不仅定位于靶细胞的细胞核，而且允许所述转基因进行高效的染色体整合及其后续表达。因此，本文所述的zip编码序列可用作各种应用的基因递送构建体，例如用作适用于各种疾病的治疗性和/或诊断性构建体。重要的是，不使用递送载体(例如病毒载体)就可以实现这种高效和特异性的基因递送。

实施例15：来源于胰腺癌(pc)的zip编码序列靶向并显示在体内胰腺癌细胞中的核定位

该实施例证明本文公开的来源于pc的zip编码序列靶向体内胰腺肿瘤细胞并显示出高度的核定位。

通过将大约500万个人来源的胰腺癌细胞注射到两只bnx小鼠的背部来诱导肿瘤。在肿瘤体积达到2cm后，向小鼠注射2μg的来源于pc的zip编码序列构建体。

图23显示了在pc异种移植小鼠模型中对来源于pc的zcs的体内归巢研究的结果。图23a左侧第一列中显示两个图像，其显示未注射任何构建体的阴性对照。图23b中间一列中显示了两个图像，其显示(通过尾静脉)施用后24小时，来源于pc的zcs在pc细胞中的积累。图23c在右侧列中显示两个图像，其显示(通过尾静脉)施用后48小时，来源于pc的zcs在pc细胞中的积累。从该动物的肝和脾获得的组织样品显示没有摄取来源于pc的zcs，证实了本公开内容的zcs的细胞特异性。

此外，研究表明，全身施用，如通过尾静脉施用所示，可导致这些构建体在pc细胞中的高摄取和核定位。图24显示了在pc异种移植小鼠模型中来源于胰腺癌(pc)的zcs的体内归巢研究的结果。图24a显示了在经尾静脉注射后24小时，特别是48小时，在pc细胞中显著累积和更新的数据。图24b显示了直接将来源于pc的zcs注射到肿瘤中时，肿瘤细胞的摄取显著减少，提示衍生自ctdna的zcs在全身施用时可改善细胞和/或组织的识别和更新。图24c显示了现在注射ctdna的对照实验。

该数据证明了本文所述构建体的高细胞、组织和/或器官特异性。这些结果进一步显示了这些构建体在体内的基因组递送和整合，表明了这些构建体的治疗和/或诊断用途。

实施例16：zip编码序列可用作体内产生免疫原性肽或蛋白质的癌症疫苗

该实施例证明本文公开的核酸zip编码序列可用于将核酸序列递送到癌细胞中，其中所述核酸序列编码一种或多种免疫原性肽，能够在患有癌症的受试者中引发针对所述癌细胞的免疫应答。

如实施例1和2中所述获得用于递送免疫原性肽编码核酸序列的核酸zip编码序列。所述zip编码序列用于产生核酸构建体(例如zip编码构建体)，所述核酸构建体包含编码一种或多种免疫原性肽或蛋白质的核酸序列，其两侧是包含一种或多种细胞识别和染色体整合信号的一种或多种zip编码序列。

zip编码构建体被施用于患有或怀疑患有癌症的受试者。在施用给受试者后，zip编码构建体归巢至癌症细胞。将zip编码构建体整合到癌细胞的基因组中，然后由癌细胞表达免疫原性肽或蛋白质。使用包含gfp编码序列的构建体来跟踪免疫原性分子的表达。癌细胞产生的免疫原性肽或蛋白质在受试者体内引起免疫应答。癌症在尺寸上显著减小，并且在此后不久(例如，通过核成像和/或使用经标记的zip编码序列的成像确定)消除(例如，癌症/癌细胞的存在不可检测)。

该数据表明，本文描述的构建体可用作癌症疫苗以预防和/或治疗癌症疾病。

实施例17：寡核苷酸zip编码序列(寡-zcs)、核酸构建体和递送系统的合成、表征和纯化

该实施例例证了本文所述的寡核苷酸zip编码序列(寡-zcs)、核酸构建体和递送系统的合成、表征和纯化，例如，包含以下或由以下组成的那些：seqidno:1-202的任何分离的共有序列和/或seqidno:203-277或282的任何自整合核酸序列中的任何一个或多个。

通常，双链核酸序列由外部供应商经化学或酶法合成。在接收到核酸分子后，例如使用脱盐方法纯化该核酸分子，然后分析确认序列和结构。

实施例18：使用本文所述的核酸zip编码序列预防癌症和癌症复发

该实施例验证了本文所述的包含一个或多个zip编码序列的核酸构建体可用于防止癌症的形成和/或防止治疗后癌症的复发。

本研究证明，本公开内容的zip编码序列(例如，寡-zcs)可用于通过结合和/或捕获受试者体内(例如循环系统和/或其他器官或组织)中的肿瘤相关核酸分子来防止癌症形成。受试者是啮齿类动物或人。

为此，将衍生自胰腺癌患者ctdna的胰腺癌(pc)特异性zcs分子(例如，作为药物组合物)施用给有发生胰腺癌风险的一组受试者(例如，在成功治疗之后并防止复发)。接受(pc)特异性zcs的受试者队列显示出明显较低的pc发展率(例如复发率)。

对这些受试者血清样品的分析表明(pc)特异性zcs结合并捕获受试者体内来源于循环肿瘤的核酸分子，提示通过这种治疗机制可以实现疾病预防。

因此，本文所述的zcs不仅可用于癌症的治疗，而且还可用于癌症的预防。在不受任何理论束缚的情况下，假定本文描述的zcs结合并捕获循环肿瘤dna，从而(i)防止或减少此类ctdna到达远端组织和/或器官并抑制转移形成；和(ii)抑制或减少原发肿瘤的生长和增殖(例如，通过抑制或减少细胞串扰、肿瘤血管系统的形成等)。

实施例19：一般实验方法

该实施例描述了本文用于构建、分析和评估本文所述的靶(例如细胞)特异性核酸分子的实验方法。

临床标本和样品制备

从温希普癌症研究所(winshipcancerinstitute)的组织和采集库中的可用存储样品中获得来自10例多发性骨髓瘤(mm)和胰腺癌(pc)患者、4例肺癌和4例结肠癌患者的回顾性血浆样品。十例多发性骨髓瘤患者接受含硼替佐米的方案治疗，或胰腺患者接受吉西他滨治疗，所用样品根据其疾病状态(应答或进展性疾病)选择。mm的应答采用多发性骨髓瘤的国际统一应答标准，胰腺癌患者采用recist标准。使用离心方法分离血浆。将血液以1500rpm离心10分钟。收集上清液用于储存。

细胞系和凋亡研究

多发性骨髓瘤(opm、rpmi、jk6l、kms11、kms12、jjn3和mm1s)、胰腺癌(aspc1、panc1、mia)、结肠癌(hct-116、rk8和hct)和肺癌(a549)细胞系在补充了10％胎牛血浆、1％l-谷氨酰胺、1mm丙酮酸钠和50μg/ml青霉素-链霉素的rpmi培养基中生长。

对于细胞凋亡研究，将10⁴个细胞用滴定剂量的硼替佐米(剂量：0.15、0.25、0.5、0.750、1、1.5和2.5mg/ml；从sigmaaldrich获得)或吉西他滨处理。二十四小时后，将细胞用yo-pro-1和碘化丙啶(invitrogen)染色。使用imagexpress5000a自动采集和分析系统(pi，moleculardevices)测量活细胞，定量yo-pro-1和碘化丙啶阴性细胞。

ctdna提取和免疫荧光标记

使用内部开发的ctdna分离和扩增试剂盒从血浆中获得循环肿瘤dna。除扩增步骤外，按照制造商的规程提取dna。用label核酸标记法、cx-罗丹明法或cy5法对ctdna进行荧光标记。

免疫荧光

在本文所述的不同时间点，将1ml含10％fbs的rpmi培养基中的约10⁶个细胞与罗丹明或cy5标记的dna孵育。对于活细胞成像，按照celllightplasmamembrane-gfp，bacman2.0方案(termofishercat#10607)标记细胞膜。显示的图片是来自一式三份实验的代表性图像。

染色体分散和ctdna条带鉴定

将来自3例不同的mm、pc、结肠癌(cc)和肺癌患者的罗丹明标记ctdna加入mm、pc、cc和肺癌(lc)的培养基中。将1.5ml培养基中的约10⁶个细胞与100ng/ml罗丹明-ctdna构建体共培养。培养24小时后，将细胞转移到15ml试管中，在37℃下在具有15μl秋水仙胺(colcemid)(10g/ml)的10ml培养基中孵育20分钟，然后收获。离心并除去培养基后，将细胞重悬于预热的10ml0.075mkcl中，并在37℃下孵育20分钟。加入固定剂(2ml，3:1甲醇：乙酸)并孵育10分钟，随后离心和抽吸。然后将样品重悬于10ml固定剂中，并在室温下孵育10分钟，然后再用固定剂洗涤两次。在thermotron中制备载玻片，其中控制温度和湿度以实现最佳的中期分散。将三滴10μl的dapiantifade添加到每个载玻片上，然后滑动盖子。使用连续微移液法，每次3μl，直到在20倍放大下每个视野至少可见25个细胞，从而将固定细胞施加到载玻片上。室温干燥1小时后，用4’,6-二眯基-2-苯基吲哚(dapi)染色细胞核。每个实验计数十个中期细胞核，排除接触和重叠细胞。计数含罗丹明带的染色体数目。

非同源末端连接修复、替代途径和转座酶抑制剂情况下对ctdna整合的评估

使用非同源末端连接(nhej)修复系统的抑制剂(例如ku-55933(atm抑制剂，10μm)和dna-pkcs抑制剂i(30μm))、替代修复途径例如聚adp核糖聚合酶抑制剂nu1025(parp，200μm)和整合酶/转座酶抑制剂(拉替拉韦，100nm)将大约10⁶个mm1s、panc1和hct-116细胞处理2小时。用抑制剂处理后，将罗丹明标记的ctdna构建体加入培养基中24小时。然后将细胞停滞，并如上所述获得染色体分散。在最少计数20个中期后获得每个细胞的整合位点计数(图32)。

异种移植实验

使用人来源的胰腺细胞系(mt5)、mm细胞系(mm1s)和结肠癌(hct-116)开发了异种移植模型。为此，在j:nu(007850)近交系裸鼠的双侧背部注射相应细胞系的大约100万个肿瘤细胞。达到约0.5cm的肿瘤体积后，将小鼠分配到特定的实验组。三只小鼠尾静脉注射罗丹明标记的ctdna构建体，分别于注射后24小时和48小时收获肿瘤。第四只小鼠尾部仅注射罗丹明(未与靶特异性ctdna，即zcs偶联)，第五只小鼠注射pbs(对照)。收获时，肿瘤和器官(肝、肺、小肠和大肠、胰腺和脾)进行冷冻切片解剖。每片载玻片均用4％多聚甲醛固定，并用4’,6-二眯剂-2-苯基吲哚(dapi)染色，之后安装盖玻片。

全基因组测序

使用如该实施例中所述的方法从5例多发性骨髓瘤(mm)和10例胰腺癌(pc)患者中提取ctdna。用血液&细胞培养dna微量试剂盒(qiagen，md)从cd138(+)细胞中提取dna，在检查了肿瘤载玻片和含肿瘤区域的核心提取物之后，从ffpe样品中获得了胰腺癌原发肿瘤dna。使用qiaampdnaffpe组织试剂盒(qiagen，md)提取获得这些样品上的dna。提取后，按照用于illumina测序的abmdna文库制备试剂盒(appliedbiologicalmaterialsinc.加拿大)将ctdna连接到pacbio衔接子(gcgctctgtgtgct(seqidno:279))。随后，对pacbio标记的ctdna进行了文库制备的标准方法，并使用illumina方案进行测序。appliedbiologicalmaterialsinc进行文库制备和全基因组测序。平均目标覆盖率是50倍。为了进行分析，所有与人类线粒体基因组比对的读段都被移除。使用spades软件处理全基因组测序原始数据，以进行从头组装。该分析产生了总计1700万个重叠群。然后使用cd-hit以每个肿瘤类型99％的同一性对组装的重叠群进行聚簇。选择包含所有mm样品但不包含pc样品的簇的矩心，反之亦然。从那些重叠群中，仅选择在3’或5’末端包含pacbio条形码的序列。

鉴定转座元件(te)

分析重叠群序列(重叠群)，并使用censorgiri和repeatmasker方法对te进行鉴定和分类，从而可以确定重叠群中可转座的类似区域的位置。

转座子线性化载体

由integrateddnatechnologies,inc(idt)产生包含所有mm样品共有的突变的转座子序列acccggccttggacacgccattttcaactccgtggtgcgttttttttttttttttttttttttgtaatggagttttgctcttgttgcccaggatggagtgcaagggatcttggctcaccacagcctctgcctcctgggttcaagtgattcttctgcctcagcctcccaagtagctgggattataagcacccaccaccacgcccagctaattttgtattttttagaagagatggagtttctccagttggccaggatggtctgtatatcctgacctcatgatctgcccacca(seqidno:282)。该寡核苷酸分为两个嵌段产生，以克服polyt片段。此外，在末端添加ecori互补位点，以利于与cmv-绿色荧光蛋白(gfp)或-单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsvtk)线性化载体的连接。

实施例20：硼替佐米或吉西他滨治疗的多发性骨髓瘤(mm)和胰腺癌(pc)患者的血浆转移药物敏感性或耐药性至mm或pc细胞系

该实施例证明，分别用硼替佐米或吉西他滨治疗的多发性骨髓瘤(mm)和胰腺癌(pc)患者的血浆可在体外将在这些患者中观察到的药物敏感性或耐药性转移到mm或pc细胞。

在本实验中，根据对硼替佐米或吉西他滨的应答状况从mm或pc患者提取血浆。随后，将对硼替佐米的mm敏感细胞系(opm1和mm1s)和对吉西他滨的pc敏感细胞系(mia)与已对相应药物表现出耐药性的患者血浆培养24小时。随后，在培养基中加入滴定剂量的硼替佐米或吉西他滨，24小时后测定细胞活力。

这些结果证明加入硼替佐米耐药患者的血浆导致mm1s和opm1的耐药增加(图25a，右上图和左上图)。相反，当用对硼替佐米有应答的患者的血浆培养硼替佐米耐药mm细胞系(rpmi，jk6l)时，细胞显著地恢复其对硼替佐米的敏感性(图25a，右下图和左下图)。这些观察结果在胰腺细胞(panc1和mia)与吉西他滨敏感和耐药患者血浆共培养时得到证实。

此外，为了研究ctdna是否有助于传递患者血浆诱导的治疗应答，用dna酶处理上述相同患者的血浆。数据表明该处理恢复了细胞对治疗的固有敏感性(图29a)。为了进一步验证ctdna在传递药物应答给细胞方面的贡献，提取来自硼替佐米耐药细胞的无细胞ctdna，并将其加入含有经dna酶处理的硼替佐米敏感患者血浆的培养基(图29a)。此外，当将从硼替佐米耐药患者提取的ctdna添加到不同的硼替佐米耐药患者的血清中时，观察到硼替佐米耐药显著增加(图29a)。图25c显示与基线ctdna单独密度相比，多个细胞系和来自患者的ctdna的核密度测量值的倍数变化。图25a-25c的数据表明患者对硼替佐米的临床敏感性可通过ctdna传递给细胞系。

这些发现共同暗示ctdna可以传递遗传物质，这些遗传物质可以允许细胞(例如肿瘤细胞)传递信息，例如定义细胞对药物治疗的命运的信息。这些数据还表明，本文所述的zcs可用于将货物分子以高特异性递送到靶细胞中。在不受任何理论约束的情况下，假定本文所述zcs构建体的高细胞特异性(例如，来源于mm的zcs对mm细胞的特异性)基于允许本文所述的从药物治疗患者的来源于mm的ctdna向体外mm细胞转移耐药性信息的相同机制。

实施例21：ctdna并入到与ctdna起源细胞相似的肿瘤细胞中

该实施例证明ctdna并入到与ctdna起源细胞相似的肿瘤细胞中。

为此目的，评估了ctdna在mm和胰腺细胞系中传递药物治疗应答(如抗性、敏感性等)中的作用是否是由于遗传物质的水平传递。因此，首次证实了从人类患者中获得的ctdna实际上代表了dna，并反映了相应癌症患者的肿瘤基因组。这些从mm、胰腺癌和结肠癌患者血浆中获得的dna证明只有用dna酶处理才能降解在这些蛋白质印迹中看到的条带(图29b)。此外，来自mm的十对肿瘤和ctdna外显子测序和来自pc的全基因组测序显示了很高的相似性，在这种情况下具有约90％的突变率(图29c)。基于这些发现，利用4例mm、3例pc、3例结肠癌和1例肺癌(lc)患者的罗丹明标记的ctdna评估ctdna介导的水平基因转移(hgt)，然后将其分别引入与ctdna的肿瘤类型相匹配的不同细胞系mm1s、aspc1、hct116和a549的培养中(图25b)。图29d显示来自多个mm患者的不同mm细胞系和ctdna的索引图像。

这些结果证明24小时后，在大多数实验条件下，ctdna以高水平定位在细胞核中。还观察到，并不是每一个ctdna都被癌细胞系捕获，这表明某些ctdna片段可能具有允许在癌细胞之间迁移和转移的固有特性，例如允许信息交换。

随后，评估了在固体(pc)和液体(mm)肿瘤细胞中ctdna到达细胞核所需的时间长度。使用胰腺细胞系aspc1，鉴定出来自pc患者的ctdna快速靶向细胞膜(参见例如图26a的aspc1分图的左上图像，显示罗丹明标记的ctdna定位于细胞膜甚至细胞内部)，并在几分钟内被内化，然后在大约10分钟后到达细胞核。此外，mm1s细胞(由标记为“mm1s”的图像分图表示)在2小时内摄取ctdna(图26a的mmm1s分图的最左侧图像)并显示约6小时后ctdna在细胞质中的内化，早在8小时到达细胞核，并在约24小时具有最大核定位(图26a的mmm1s分图的最右侧图像)。

实施例22：ctdna优先迁移到类似于ctdna起源细胞的肿瘤异种移植物中

该实施例证明ctdna优先迁移到与它们起源的相同肿瘤类型相似的肿瘤异种移植物，在此可称为“趋性”。

对于本实验，利用人来源的胰腺(mt5)、mm(mm1s)和结肠癌(hct-116)细胞系建立异种移植模型。在进行所有肿瘤异种移植实验之前，进行先导实验，以确定肿瘤部位的ctdna最高浓度的时间。为此，将3只携带pc异种移植物的小鼠经尾静脉注射罗丹明标记的来源于pc的ctdna。该研究确定了注射后48小时罗丹明-ctdna构建体的最大肿瘤定位(图30a)。

随后，在mm、pc和cc的小鼠肿瘤异种移植物(每个肿瘤类型n＝5)中注射具有相应诊断(每个肿瘤类型n＝3)的罗丹明-ctdna(从患有相应癌症的患者中获得的ctdna)。两只对照异种移植小鼠单独注射罗丹明作为对照。48小时后收获肿瘤及不同器官(肝、脾、肺、肾、结肠和胰腺)制作冷冻切片。与对照小鼠相比，共聚焦显微镜检查探索经标记的ctdna的浓度，显示出在肿瘤中具有高浓度(图26b和图30b)。对ctdna的生物分布的评估没有在任何其他器官中显示任何免疫荧光信号，这表明给定的ctdna对其自身来源的细胞具有高度特异性。

实施例23：ctdna不并入与ctdna的起源细胞不同的细胞类型的细胞中

该实施例证明ctdna没有或没有显著地并入到与ctdna的起源细胞不同的细胞类型的细胞中。

循环肿瘤dna(ctdna)特异性靶向肿瘤细胞，增加了ctdna对与ctdna起源的细胞相似的细胞具有选择性趋性的可能性。因此，通过对与提取ctdna的患者诊断不匹配的细胞系进行共培养来测试这一点。将2个mm细胞系与来源于pc、lc或cc患者的ctdna共培养，发现ctdna聚簇在细胞膜外围，未能内化(图26c和图26d)。当细胞胰腺和结肠癌细胞系与从不匹配的肿瘤类型中提取的ctdna共培养时，在其他实验中也获得了类似的数据。

这些出乎预料和意想不到的发现通过加入含有来自与细胞系的肿瘤类型匹配或不匹配的患者的ctdna的培养基中，并测量ctdna的核定位得到进一步验证。用cy5或罗丹明标记ctdna后，将ctdna分别与mm(mm1s和jk6l)、cc(ht29和hct-116)和pc(panc1和panc1)细胞系共培养24小时。图26e和26f显示当ctdna来源与细胞系肿瘤类型匹配时，ctdna显著聚簇在细胞核内。相反，当细胞系的肿瘤类型与ctdna不匹配时，ctdna仍保留在细胞外。

为了在体内重现ctdna对类似来源细胞的特异性细胞靶向性(趋性)，在2种异种移植模型(mm和pc)中检测了ctdna的选择性趋性。通过在每只动物尾部注射罗丹明标记的mmctdna和cy5标记的pcctdna进行一式三份实验。肿瘤显微镜检查显示罗丹明-mmctdna(红色荧光)靶向mm异种移植物，但不能靶向pc的异种移植物。同样，cy5标记的pcctdna(黄色荧光)高度集中在pc异种移植物中，而mm-ctdna并没有(图31a)。

这些数据共同提供了强有力的证据，证明ctdna选择性地靶向体内与其起源细胞相似的癌细胞类型。

实施例24：ctdna的染色体整合

该实施例证明ctdna不仅靶向并进入细胞和这种细胞的细胞核，还可以整合到类似ctdna起源细胞的这种细胞的染色体中。

在这项研究中，评估了ctdna片段一旦到达细胞核是否有能力整合到细胞基因组中。为此，通过向培养基中加入ctdna(每种肿瘤类型n＝3)来进行mm(mm1s、rpmi、opm1)、pc(mia、aspc1、panc1)和cc(hct-116、hct-11、rko)细胞系的中期染色体分散。如图27a和图27b以及图31b和图31c中所示，鉴定出多个罗丹明-ctdna条带并入了几个染色单体中。

为了进一步确认ctdna在细胞基因组中的整合，按照本文所述的3种不同的实验条件进行全基因组测序(wgs)：细胞系(mm、pc和cc)，从与细胞系相似的癌症诊断患者中提取的ctdna，以及与其对应的肿瘤细胞系共培养的ctdna。ctdna片段的序列是通过从头组装产生的，由此产生了约1700万个重叠群序列(重叠群)。然后通过选择那些在mm、pc或cc中具有超过99％序列同源性的以及其质心区域聚簇到每个肿瘤类别的能力的序列来过滤重叠群列表(每个重叠群n＝180)。将这一重叠群序列与共培养的ctdna细胞系和单独培养的细胞系中存在的k-mer映射后，鉴定出整合到细胞基因组中的ctdna片段。circus图显示mm1s和aspc1细胞系中多个重叠群的插入及其相应的插入位点。最后，通过评估mm1s细胞中的gfp表达来进一步验证ctdna将遗传物质转运和整合到靶细胞中的能力，所述mm1s细胞与中间已引入线性化cmv-gfp载体的mmctdna共培养，使得编码gfp的cmv-gfp载体在每个位点的两侧都有mmctdna分子)。图27c显示了与ctdna-cmv-gfp-ctdna构建体共培养的肿瘤细胞中gfp的表达，其中编码巨细胞病毒-绿色荧光蛋白(cmv-gfp)的货物核酸序列的两侧是ctdna序列，其允许对货物(编码cmv-gfp)序列细胞靶向和基因组整合(右图)。左图(对照)显示，当在没有ctdna的情况下使用编码cmv-gfp的货物核酸序列时，cmv-gfp在肿瘤细胞中不表达，提示ctdna部分是细胞靶向和表达货物核酸序列所必需的。

因此，这些数据表明ctdna可以介导癌细胞之间遗传物质的水平传递。因此，这些数据表明，如本文所述的ctdna以及由此衍生的核酸，例如包含靶向序列和整合序列的zcs，可用于以高度细胞特异性的方式将靶基因(例如治疗性靶基因)运送到细胞中，潜在地避免了使用病毒载体或其他常规方法将目的基因引入到靶细胞中的需要。

此外，还研究了ctdna的细胞靶向特异性，比较了ctdna和细胞类型与肿瘤诊断相匹配的条件下和ctdna与细胞系的肿瘤类型不匹配的条件下的插入数。

这些研究证实了显著增加的ctdna插入到与ctdna来源细胞相匹配(例如，相同的癌症类型等)的细胞基因组中，验证了ctdna的组织靶向选择性。

实施例25：5’和3’转座子介导ctdna的插入

该实施例表明5’和3’转座子可介导ctdna插入靶细胞的基因组，例如，与ctdna来源的细胞具有相同癌症类型的细胞。

转座元件(te)在原核生物和少数情况的真核生物(昆虫和植物)中观察到的hgt的机制中可起重要作用。因此，研究转座元件的抑制是否可以减少或阻止ctdna整合到染色单体中。为此，在将ctdna加入到培养基中之前，用转座酶抑制剂拉替拉韦处理细胞2小时。作为对照，使用了atm抑制剂(ku-55933)、dnpkc(dna-pkcs抑制剂i)和parp(nu1025)。图28a证明了mm(mm1s)、pc(aspc-1)和cc(hct116)细胞系中罗丹明(来自罗丹明标记的ctdna)条带并入染色体的水平。数据显示，与对照或parp抑制剂(nu1025，200μm)处理的细胞相比，dnapkcs抑制剂(dna-pkcs抑制剂i，30μm)、atm(ku-55933，10μm)或转座酶抑制剂(拉替拉韦，100nm)显著降低了ctdna的整合，证实转座元件可在将ctdna插入细胞基因组中发挥作用。基于这些结果，设计了一系列实验来鉴定可能在整合到细胞基因组中起作用的ctdna片段的序列特征。为此，对5个mm和10个pcctdna样品进行测序，这些样品先前连接到pacbio探针以标记每个ctdna片段的5’和3’末端。根据mm和pc序列的鉴定算法，通过比较从ctdna从头组装产生的重叠群列表与本文所述的共培养实验中鉴定为ctdna插入的序列，研究了哪些ctdna片段可以在将ctdna插入细胞基因组中起作用。这些分析鉴定了埋入或未埋入细胞基因组的重叠群。利用多个能够检测和分类dna序列中te含量的软件，根据其整合到细胞基因组中的能力、te含量和te在重叠序列中的定位对ctdna片段进行划分。分析表明整合在细胞基因组中的ctdna片段高度富集te，其定位主要集中在5’和3’末端。此外，未插入的ctdna片段显示明显缺乏te，并且当存在时，在ctdna片段的任何末端没有明显定位。结合在原核生物和植物中观察到的te在hgt中的重要作用，以及本文描述的在癌细胞中发现，提示te可能在癌细胞之间的基因转移中起重要作用。因此，这些te序列可用于ctdna或ctdna来源的构建体中，将目的核酸或基因(例如，治疗性、凋亡性基因等)运送到靶细胞中。

随后对整合的ctdna片段进行分析，可以鉴定出两种类型的te，它们构成了这些片段中存在的约40％的转座类似元件。其中大约一半是mir逆转座子，另一半是alusq。有趣的是，mir是一种衍生自于转座元件(te)的绝缘子，与果蝇gypsy元件非常相似；te在基因编辑中广泛使用。为了进一步验证mir在癌细胞间传递遗传物质中的作用，化学合成te并连接到线性化的巨细胞病毒-绿色荧光蛋白(cmv-gfp)片段(图28b)。连接和纯化后，将te-cmv-gfpdna置于mm细胞系培养物(mms1)中，进行活体显像。结果表明，在12小时内，mm1s细胞表达gfp，表明合成的te能够将遗传货物物质转移并整合到细胞基因组中(图28b，右图，绿色荧光显示细胞内gfp的产生)。当te连接到cmv-hsvtk并注射到mm异种移植小鼠的尾部时，该结果在体内中得到进一步验证。肿瘤和不同小鼠器官的pcr检测到hsvtk基因仅存在于肿瘤组织中(图28c)。这些结果，结合在ctdna中高浓度的te和在拉替拉韦处理的细胞中观察到的整合缺失，提示te在介导癌细胞间ctdna水平基因转移中发挥核心作用。因此，包含这种转座元件的核酸构建体可用于以高度细胞特异性的方式在细胞中表达目的基因，同时避免了对病毒载体和/或基因编辑工具如talen或crispr的需要。

虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对本领域技术人员将是显而易见的是，仅通过举例的方式来提供这样的实施方案。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现将进行许多变型、改变和替代。应当理解，在实践本发明时可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同项的范围内的方法和结构。

序列表

<110>爱默蕾大学

科迪卡兹治疗解决方案公司

<120>用于细胞识别和整合的核酸

<130>54774-702.601

<140>

<141>

<150>62/875,887

<151>2019-07-18

<150>62/736,323

<151>2018-09-25

<160>282

<170>专利版本3.5

<210>1

<211>7120

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述:合成的

多核苷酸

<400>1

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述:合成的

多核苷酸

<400>2

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述:合成的

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<223>人工序列的描述:合成的

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<213>人工序列

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<223>人工序列的描述:合成的

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<220>

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<220>

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<220>

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<220>

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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