使用脱色的芦荟提取物的治疗方法与流程

背景

公开内容的领域

芦荟(aloevera)已经在口服和局部施用以及其它施用途径的多种制剂中被用作传统的疗法。这些制剂已经以多种方式使用，如愈合伤口、支持消化健康和用于美容目的。叶片的不同部分与不同的健康益处相关。然而，关于芦荟的生物活性和作用机制知之甚少。

作为天然成分，芦荟的组成随着生长条件以及制造过程而变化。传统上，包括乳胶在内的全叶汁被摄取。该乳胶用作泻药以舒缓胃部以及消除肠道寄生虫。在市场上，芦荟汁是用于消费的商业上更相关的产品，乳胶成分如蒽醌类通常通过被称为脱色的炭过滤方法去除。关于脱色过程之后芦荟的生物和生理作用，可以获得的信息有限。

本公开内容涉及不同的脱色芦荟提取物对肠上皮屏障健康的影响。本公开内容还论述了这些提取物对屏障功能和基因表达的影响。

概述

在第一方面，提供了用于增加人胃肠道的内部与身体的其余部分之间的上皮细胞屏障的强度的方法。所述方法包括将有效量的包含脱色的芦荟提取物的组合物施用至上皮细胞屏障。

在一些实施方案中，增加上皮细胞屏障的强度包括增加的跨上皮电阻。

在一些实施方案中，在用于增加上皮细胞屏障的强度的方法中使用的提取物选自包括以下的组：全叶提取物(wlc，5x)、全叶干提取物(wld，100x)、内叶干提取物(ild，200x)、消化的全叶提取物(5xdig)、消化的全叶干提取物(100xdig)、消化的内叶干提取物(200xdig)以及它们的组合的脱色样品。在一些实施方案中，增加的强度在施用提取物之后4小时是明显的。在一些实施方案中，增加的强度在施用提取物之后24小时是明显的。在一些实施方案中，以约0.5mg/ml至约2mg/ml范围内的浓度施用提取物。在一些实施方案中，以约1mg/ml的浓度施用提取物。

在第二方面，提供用于修复上皮细胞损伤的方法。所述方法包括，例如，将所述组合物施用至上皮细胞，所述组合物包含脱色的芦荟提取物。

在一些实施方案中，在用于修复上皮细胞损伤的方法中使用的提取物选自包括以下的组：例如全叶提取物、全叶干提取物、内叶干提取物、消化的全叶提取物、消化的全叶干提取物、消化的内叶干提取物以及它们的组合的脱色样品。在一些实施方案中，修复在施用提取物之后4小时是明显的。在一些实施方案中，修复在施用提取物之后24小时是明显的。在一些实施方案中，以约0.5mg/ml至约2mg/ml范围内的浓度施用脱色的内叶干提取物。在一些实施方案中，以约1mg/ml的浓度施用脱色的内叶干提取物。

在第三方面，提供了用于修复人胃肠道的内部与身体的其余部分之间的上皮细胞屏障的损伤的方法。所述方法包括将组合物施用至上皮细胞屏障，所述组合物包含脱色的芦荟提取物。

在一些实施方案中，所述损伤是由艰难梭菌(clostridiumdifficile)毒素a(toxa)造成的。在一些实施方案中，修复对上皮细胞屏障的损伤包括增加上皮细胞屏障的跨上皮电阻。在一些实施方案中，修复对上皮细胞屏障的损伤包括降低上皮细胞屏障对fict-葡聚糖4kda(fd4)的通透性。

在一些实施方案中，在修复人胃肠道的内部与身体的其余部分之间的上皮细胞屏障的损伤的方法中使用的提取物选自脱色的全叶提取物、全叶干提取物、内叶干提取物、消化的全叶提取物、消化的全叶干提取物、消化的内叶干提取物或它们的组合。在一些实施方案中，有益效果位于小肠中。在一些实施方案中，有益效果是上皮屏障强度增加。在一些实施方案中，有益效果是对人胃肠道的内部与身体的其余部分之间的上皮细胞屏障损伤的修复。在一些实施方案中，修复在施用所述提取物之后4小时是明显的。在一些实施方案中，修复在施用所述提取物之后24小时是明显的。

在第四方面，提供了向人的胃肠道提供有益效果的方法。所述方法包括将组合物施用至人，所述组合物包含脱色的芦荟提取物，其中所述提取物选自全叶提取物、全叶干提取物、内叶干提取物、消化的全叶提取物、消化的全叶干提取物、消化的内叶干提取物或它们的组合。

在一些实施方案中，益处位于小肠中。在一些实施方案中，益处是胃肠道的内部与身体的其余部分之间的上皮细胞屏障的强度增加。在一些实施方案中，益处是修复胃肠道的内部与身体的其余部分之间的上皮细胞屏障的损伤。在一些实施方案中，益处是人生长因子的表达。

在一些实施方案中，益处在施用提取物之后4小时是明显的。在一些实施方案中，益处在施用提取物之后24小时是明显的。在一些实施方案中，益处是通过刺激巨噬细胞向m1(炎性)和m2(抗炎)极化来进行的免疫调节。

附图简述

结合附图，从以下描述和所附权利要求中，本公开内容的特征将变得更加充分地显而易见。应理解，这些附图仅描述了根据本公开内容的某些实施方案，因此不应被认为是对其范围的限制；将通过使用附图以另外的特异性和细节来描述本公开内容。根据一些所述实施方案的设备、系统或方法可以具有几个方面，其中没有一个单一的方面必须单独负责设备、系统或方法的期望属性。在考虑了本论述之后，特别是在阅读了标题为“某些实施方案的详述”的章节之后，人们将理解所示的特征如何用于解释本公开内容的某些原理。

图1显示了与培养基相比，三种脱色的芦荟样品wlc(5x)、wld(100x)和ild(200x)随时间导致的上皮屏障强度的相对变化。

图2显示了与培养基和消化的对照样品(ctrldig)相比，三种脱色的消化的芦荟样品wlc(5xdig)、wld(100xdig)和ild(200xdig)导致的上皮屏障强度的相对变化。

图3显示了在用梭菌毒素(toxa)处理的情况下，与培养基和消化的对照样品相比，样品wlc(5x)、wld(100x)和ild(200x)导致的上皮屏障强度的相对变化。

图4显示了在用梭菌毒素(toxa)处理的情况下，与消化的对照样品相比，消化的样品wlc(5x)、wld(100x)和ild(200x)导致的上皮屏障强度的相对变化。

图5显示了在梭菌毒素(toxa)存在下，对于选择的样品wlc(5x)、wld(100x)和ild(200x)导致的fd4跨上皮屏障迁移的影响。

图6显示了在梭菌毒素(toxa)存在下，对于选择的消化的样品wlc(5x)、wld(100x)和ild(200x)导致的fd4跨上皮屏障迁移的影响。

某些实施方案的详述

使用caco-2细胞系和巨噬细胞的经验证的体外transwell系统经常用于研究肠上皮屏障的强度和完整性，其为通过提供物理屏障来维持肠健康的关键，以及巨噬细胞的基因表达，其为通过向耐受和/或炎性表型的极化来维持胃肠免疫稳态的关键。先前对芦荟的研究显示，它可以以多种方式促进改善的健康，包括伤口愈合和免疫调节。另一方面，将体外消化步骤包括在实验程序中可能是适当的，因为它将模拟天然肠活动。

当前研究漏肠是因为它被怀疑参与涉及一些严重的健康问题和疾病，如慢性疲劳综合症、ibs、代谢紊乱、炎性肠病、1型糖尿病、过敏、哮喘和自身免疫病。事实上，漏肠确定了破坏的肠屏障功能与自身免疫病和炎性疾病的发展之间的关联。上皮通过形成机械连接相邻细胞并密封细胞间间隔的复杂蛋白-蛋白网络，而维持其选择性屏障功能。紧密连接的不正常起作用或调节可能是较大的细胞间间隔的原因，其中腔内元素穿过屏障，允许有害物质在整个人体内循环。这可能导致连续的局部和全身炎症。

慢性炎症是一种病理状况，其特征在于持续活跃的炎症应答和组织破坏。许多研究表明慢性炎症可能在多种年龄相关的疾病(包括糖尿病、心血管病和自身免疫病)中具有严重作用。炎性过程诱导氧化应激和降低的细胞抗氧化能力。过量产生的自由基与细胞膜脂肪酸以及蛋白质反应，永久性地损坏它们的功能。另外，自由基可导致突变和dna损伤，其可能是癌症以及年龄相关的病症的诱发因素。

本公开内容评价了不同的脱色芦荟提取物对肠上皮屏障健康的可能影响。为此，使用了以caco-2细胞为特征的人肠细胞系模型。收集和分析与屏障功能和基因表达相关的结果。

本文公开的芦荟产品包括三种不同的芦荟脱色提取物：全叶提取物5x浓缩物(wlc)、全叶干提取物100x浓缩物(wld)和内叶干提取物200x浓缩物(ild)。最初以相同的方式处理两种芦荟全叶提取物(wlc和wld)。通过研磨或浸渍整个芦荟叶，随后纯化以去除乳胶中发现的酚类化合物来获得芦荟全叶汁。该纯化步骤在称为脱色的过程中通过活性炭过滤完成。然后去除溶剂(水)，直到提取物达到所需的5x浓度的wlc，这意味着1千克的这种材料将来源于约5千克起始的全芦荟叶；或者完全干燥成wld的100x提取物，这意味着1千克的这种材料将来源于约100千克的起始全芦荟叶。芦荟内叶提取物200x(ild)通过如下获得：剥掉外叶皮，冲洗或洗掉存在的任何乳胶，并通过研磨或浸渍内芦荟叶圆角，随后纯化以去除乳胶中发现的酚类化合物来处理剩余的内叶材料。该纯化步骤也可以通过脱色来完成。然后将提取物干燥直至其达到完全干燥，得到所需的200x浓度，这意味着1千克的这种材料将来源于约200千克的起始芦荟内叶。

还进行了实验以测试如[0026]中处理的wlc、wld和ild的消化产物。平行测试消化的产物，以更好地模拟体内环境。如下制备消化的芦荟提取物。通过向每个芦荟样品中加入50重量％的150mmol/lnacl+5mmol/lkcl，每个样品经历模拟的消化步骤。将所得溶液各自用手持搅拌器混合并转移至50ml管中。用hcl将ph调节至2，并加入0.667ml猪胃蛋白酶，之后将样品在37℃孵育30分钟。加入nahco3(1mol/l)以将ph升高至至少5.8，随后加入0.95ml猪胰酶(4g/l)并加入0.5ml牛磺胆酸钠和甘氨脱氧胆酸钠的混合物。用nahco3将样品的ph调节至6.5，用氮气冲洗顶部空间，随后将样品在37℃下孵育1小时。然后用nahco3将样品的ph调节至7.5，并将样品的重量调节至30g。在4℃下以3023×g离心样品30分钟。去除上清液，用氮气冲洗试管，并储存在-80℃，直到使用样品为至。

在一些实施方案中，可以将本文所述的芦荟组合物施用至哺乳动物以改善肠上皮屏障的健康。在一些实施方案中，哺乳动物是人。

在一些实施方案中，可以将本文所述的芦荟组合物施用至哺乳动物以诱导对肠上皮屏障的益处。这种对肠上皮屏障的益处包括但不限于：增加上皮屏障强度、上皮通透性、对上皮屏障损伤的修复、营养素的转运以及与肠上皮屏障健康直接或间接相关的基因的表达。

在一些实施方案中，用人小肠上皮模型测试了不同的脱色芦荟提取物的作用。为此，使caco-2细胞(美国典型培养物保藏中心)在transwell系统中生长以产生顶端(腔)和基底外侧(固有层)隔室。随后将细胞暴露于不同的消化和未消化的脱色的芦荟提取物中，并监测结果。

在一些实施方案中，用人小肠上皮模型测试了不同的脱色芦荟提取物对免疫细胞基因表达的影响。为此，使caco-2细胞(美国典型培养物保藏中心)在transwell系统中生长以产生顶端(腔)和基底外侧(固有层)隔室，同时在系统的底部储存器中使原代巨噬细胞与caco-2细胞分开生长。随后将caco-2细胞暴露于不同的脱色芦荟提取物中，并分析巨噬细胞以及caco-2细胞的基因表达。

实施例

统计分析

通过重复测量anova分析平均值之间的差异，随后进行fisher检验。在所有情况下，p<0.05被认为是显著的。

实施例1：上皮细胞活力

通过跨上皮电阻(teer)测定暴露于不同的脱色芦荟提取物的caco-2细胞的活力。teer是屏障完整性的指示。还通过作为细胞代谢活性的量度的mtt(溴化3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑；噻唑蓝)转化(thermofisher)测定caco-2细胞活力。

在暴露24小时之后分析三种样品浓度(0.5、1.0和2mg/ml)的未消化脱色产物：wlc(5x)、wld(100x)和ild(200x)的作用；三种样品浓度(在培养基中以1:1、1:2和1:3稀释的)的消化产物(120mgwlc、144.6mgwld和450mgild)的作用。所有剂量的teer值为约90％，并且mtt值为约100％。对于任何样品没有观察到有害影响。确定浓度为1mg/ml的未消化产物和1:1稀释的消化产物用于后续实验。

实施例2：对完整上皮屏障的影响

通过测量teer分析不同的脱色芦荟提取物对caco-2细胞屏障功能的影响。首先，使用传代数为30至40的caco-2细胞(美国典型培养物保藏中心)，并使其在24孔板(greinerbio-one)中的transwell小室(inserts)上在补充有10％fbs(hyclone)的dmem培养基(gibco)中生长。在顶端部用150μl中的3.375×10⁴个caco-2细胞接种培养物，并在37℃和5％co2下孵育21天以在trans-well半渗透屏障的顶端形成单层。为了开始实验，首先去除基底外侧培养基以及随后去除顶端培养基。然后，将caco-2细胞暴露于含有消化(1:1稀释)或未消化的(1mg/ml)脱色的wlc(5x)、wld(100x)和ild(200x)提取物的顶端培养基中，之后加入基底外侧培养基。

为了测量teer，将具有caco-2细胞单层的24孔板放置在设置为40℃的电热板上。通过将电极定位在顶端隔室中和将电极定位在基底外侧隔室中以及测量以欧姆为单位的电阻来进行teer测量。在不同刺激的测量之间用介质洗涤电极。如图1所示，在未消化的提取物之间处理4小时时没有发现差异。在刺激24小时之后，所有提取物显示teer值增加(p<0.001，在所有情况下)。

用更好地模拟肠道情况的消化产物进行类似的刺激(图2)。与未消化的样品相比，该模式略有不同。在处理4小时时，对于100x，teer增加(p＝0.009)，对于200x，teer降低(p＝0.000007)。在处理24小时之后，与对照相比，仅200x的增加了teer值(p＝0.000008)。

实施例3：对受到挑战的上皮屏障的影响(恢复/伤口愈合)

通过teer以及还通过4kdafitc-葡聚糖(荧光标记的标志物)的(从顶端至基底外侧)迁移(fd4通过)来测量用艰难梭菌毒素a(toxa)造成损伤之后对肠上皮的有害作用的降低。在如[0032]中所述的单层形成之后，将caco-2细胞暴露于顶端培养基中，所述顶端培养基含有与或不与0.25mg/mlfd4和/或0.25μg/mltoxa混合的wlc(5x)、wld(100x)和ild(200x)的消化(1:1稀释)或未消化(1mg/ml，在培养基中)的提取物。为了检测fd4通过，在4、8和24小时的caco-2刺激之后收获100μl的基底外侧培养基。将培养基转移至平底96孔黑板中，通过485nm激发和在酶标仪(200pro,tecan)上检测582nm发射来检测荧光。为了定量fd4，使用以500μg/ml开始的两倍稀释的标准曲线。

toxa逐渐降低屏障完整性。在用毒素处理caco-2细胞之后，分别用消化的或未消化的wlc、wld和ild样品处理细胞。如图3所示，用未消化的提取物处理细胞4小时不会导致teer增加。另一方面，用消化的wlc和wld处理的细胞在4小时时增加teer(在两种情况下，p<0.001)。与对照相比，ild也显示出非显著(p＝0.056)增加的teer(图4)。

还通过研究fd4的转移来测量细胞间屏障完整性。与teer测量相比，在用未消化的ild(200x)处理4小时之后，fd4从顶端向基底外侧的迁移降低(p<0.001)(图5)。如图6所示，在处理4小时之后，所有三个消化的样品[wlc(5xdig)、wld(100xdig)和ild(200xdig)]显示了fd4迁移降低(在所有情况下，p<0.01)。这表明尽管用teer测量的是降低屏障完整性，但这些样品减少了fd4从顶端(腔)向基底外侧(浆膜)侧的转移。

实施例4：对caco-2基因转录的影响

进行转录分析以更好地理解用脱色的芦荟样品处理的细胞的改善的屏障功能。通过将细胞暴露于不同的脱色芦荟提取物样品24小时来诱导对caco-2细胞系的转录变化。使用微阵列(affymetrix人基因1.1st阵列)分析基因转录。

关于芦荟提取物的改善的屏障功能，对与紧密连接形成和调节以及生长因子有关的基因的差异表达进行了表征。在用每种未消化的芦荟提取物处理的caco-2细胞中，密封蛋白(claudin)家族基因的亚组(密封蛋白-1/9/10/15)被下调，然而密封蛋白-14被上调。有趣的是，闭合蛋白(occludin)家族的紧密连接相关的跨膜蛋白marveld3被未消化的ild上调，然而marveld2被wlc和ild下调。另一方面，密封蛋白-6/15/18和闭合蛋白(紧密连接的主要成分)与蛋白质的密封蛋白群组一起被消化的芦荟提取物下调，然而密封蛋白-23被消化的wld和ild上调，以及marveld3分别被wlc和ild上调。

解释增强的teer值和减少的fd4通过的可选机制可以是增强的伤口愈合。尤其是在caco-2细胞受到挑战的环境下，增强的细胞生长也会增加屏障强度。生长因子基因转录的分析显示了对于未消化的样品和消化的样品有限量的显著受影响的基因。在未消化的提取物中，wlc和ild上调成纤维细胞生长因子-22(fgf22)，而wld上调血小板衍生生长因子d(pdgfd)。在消化的提取物中，wlc和ild上调胰岛素样生长因子-1(igf1)。wld上调fgf10。

在编码细胞因子和趋化因子的基因中，在用每种脱色的未消化的芦荟提取物处理的caco-2细胞中ccl3和ccl13下调，而每种消化的提取物下调il-2。被未消化的wlc上调的基因包括cxcl10、ifna13和ifna5，而il1a、il32、ccl7、tnfsf11、tnfaip8、ccl13、il18、xcl1，而ccl3被下调。相比之下，消化的wlc上调ccl8和cxcl9，而下调il17f、ccl18、il2和il20。未消化的wld上调ccl3l3、tnfsf13和ifne，而下调ifnl3、cxcl9、ccl15、tnfsf11、tnfaip8、ccl13、il18、xcl1、ccl27和ccl3。相比之下，消化的wld上调ifnl3和ifna1，而下调il2、ifng、il20和cxcl8。未消化的ild上调ccl4l2、ifna1、tnfsf18、ifnl1、ccl11、il1f10和il1b，而下调ccl13、il18、il37、ccl27和ccl3。相比之下，消化的ild上调il37和il12b，而下调tnfsf18、ifna5和il2。

巨噬细胞向m1(炎性)或m2(抗炎)的极化反映了巨噬细胞可塑性的最大程度(extremes)，这反映在显著受影响的基因的量上。由脱色的芦荟样品(wlc、wld和ild)中的每一种刺激的人原代巨噬细胞最强烈地产生cxcl8(m1)、cxcl5(m1)、ccl24(m2)、ccl4(m1和m2)以及il-6。通路分析显示了看起来涉及m1和m2极化的巨噬细胞活化，而与未刺激的巨噬细胞相比，由wlc和ild刺激的巨噬细胞显示出显著降低的吞噬作用(m1)。上述结果表明，脱色的芦荟样品具有能够吸引大量的免疫细胞的标志性免疫调节潜能。

总之，转录分析的结果表明，被测试的未消化的和消化的芦荟提取物的每种脱色样品具有关于紧密连接组装、上皮屏障功能和免疫调节的共同和独特的生物活性。