作为反老药物的阿奇霉素和罗红霉素衍生物的制作方法

本公开涉及反老药物(senolyticdrug)，一类选择性诱导衰老细胞(senescentcell)死亡的化合物。
背景技术：
：随着多种生物经历时序老化(chronologicalaging)，许多遗传、表型和代谢缺陷不断积累。这种积累包括各种细胞类型中衰老的开始。累积缺陷的总体观点与老化的“累积损伤(accumulateddamage)”假说是一致的。衰老是正常时序老化的明显标志。通过诱导cdk抑制剂(例如p16-ink4a、p19-arf、p21-waf和p27-kip1)以及sasp(衰老相关的分泌表型)的起始和诱导关键的溶酶体酶(β-半乳糖苷酶)和脂褐素(一种已知的老化色素)，衰老涉及可能的不可逆的细胞周期停滞。令人感兴趣的是，sasp导致大量炎性细胞因子如il-1-β和il-6的分泌，从而使衰老细胞通过慢性炎症将衰老表型“传染性”地从一种细胞类型扩散至全身。这种慢性炎症还可以促进癌症的起始，并驱动肿瘤复发和转移。利用p16-in4ka的启动子作为转基因探针来检测和标记衰老细胞，几个研究小组现在已经建立了鼠类老化模型，其中可以以实时的时间方式遗传消除衰老细胞。尽管不能将其用作抗老化疗法，但它可以为我们提供衰老细胞的去除是否可能对生物体具有治疗益处的指示。迄今为止的结果显示出很大的希望，表明通过基因去除衰老细胞确实可以延长健康跨度和寿命。鉴于这种遗传数据的结果，大量制药公司积极地致力于发现能够靶向衰老细胞的“反老(senolytic)”药物。理论上，这样的反老药物可能会产生与老化有关的各种过度影响。然而，药物开发是一个漫长且昂贵的过程，需要进行大量的临床试验并且由于许多可能原因之一即具有失败的风险。因此，需要鉴定已经被批准用于一种或多种也具有反老活性的治疗的化合物。技术实现要素：本公开涉及可用作反老药物的具有反老活性的化合物。许多fda批准的药物具有不同程度的反老活性。鉴定此类化合物并提高其对抑制衰老细胞的选择性将极大地加速其在抗老化药物试验中的可用性。本文描述了这类化合物的鉴定，使用受控的dna损伤作为诱导人成纤维细胞中的衰老的工具来鉴定。具有长期用作dna损伤剂的历史的brdu处理(brdu-treatment)可以用作筛选化合物的反老活性的有效平台。更具体地，brdu处理允许以高效率在培养的细胞中可再现地诱导衰老。本发明人使用brdu处理作为鉴定反老活性的平台，鉴定了红霉素家族(erythromycinfamily)的两种大环内酯类抗生素，特别是阿奇霉素(azithromycin)和罗红霉素(roxithromycin)，是经临床批准的具有反老药物功效的药物。母体大环内酯类化合物(红霉素本身)在本文公开的筛选试验中不具有反老活性，直接支持这些复杂相互作用的高度特异性。然而，如阿奇霉素、罗红霉素和泰利霉素(telithromycin)的化学类似物或衍生物一样，泰利霉素(另一种大环内酯)也显示出反老活性。注意，本说明书可互换地使用术语“衍生物(derivative)”和“类似物(analog)”。筛选方法已经用于鉴定反老剂，例如本文所述的那些。此外，反老剂可以用一种或多种靶向信号修饰以改善反老活性，并且可以与其他治疗剂如线粒体生物发生抑制剂(mitochondrialbiogenesisinhibitor)联合使用，以更有效地根除衰老细胞。本方法可以采用各种形式。一些实施方案可以采取反老组合物的形式，其具有治疗量的选自阿奇霉素、罗红霉素、泰利霉素、阿奇霉素类似物、罗红霉素类似物和泰利霉素类似物中的至少一种反老剂(senolyticagent)。本公开可互换地使用术语“衍生物”和“类似物”，尽管典型用法可能不同。例如，实施方案可以是药学有效量的选自以下各项之一的化学式的形式：在这样的实施方案中，r1和r2表示官能团，可以是相同的基团或不同的基团，条件是r1和r2中的至少一个是膜靶向信号和线粒体靶向信号中的一个。否则，r1和r2选自氢、羧基、烷烃、环状烷烃、基于烷烃的衍生物、烯烃、环状烯烃、基于烯烃的衍生物、炔烃、基于炔烃的衍生物、酮、基于酮的衍生物、醛、基于醛的衍生物、羧酸、基于羧酸的衍生物、醚、基于醚的衍生物、酯、基于酯的衍生物、胺、基于胺的衍生物、酰胺、基于酰胺的衍生物、单环芳烃、多环芳烃、杂芳烃、基于芳烃的衍生物、基于杂芳烃的衍生物、苯酚、基于苯酚的衍生物、苯甲酸和基于苯甲酸的衍生物。在一些实施方案中，r1和r2中的至少一个是选自以下的膜靶向信号：棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、短链脂肪酸和中链脂肪酸。权利要求1的反老组合物，其中r1和r2中的至少一个是选自以下的线粒体靶向信号：三苯基鏻(tri-phenyl-phosphonium)(tpp)、tpp-衍生物、胍盐、胍盐衍生物和10-n-壬基吖啶橙。在反老组合物的一些实施方案中，r1和r2中的至少一个是选自以下的tpp-衍生物：2-丁烯-1,4-双-tpp；2-氯苄基-tpp；3-甲基苄基-tpp；2,4-二氯苄基-tpp；1-萘甲基-tpp；对苯二甲撑双-tpp(p-xylylenebis-tpp)；2-丁烯-1,4-双-tpp的衍生物；2-氯苄基-tpp的衍生物；3-甲基苄基-tpp的衍生物；2,4-二氯苄基-tpp的衍生物；1-萘甲基-tpp的衍生物；和对苯二甲撑双-tpp的衍生物。在一些实施方案中，反老化合物可以是阿奇霉素衍生物或类似物。例如，反老组合物可以是具有式的化合物，其中或者r1是甲基且r2是膜靶向信号和线粒体靶向信号其中之一，或者r1是膜靶向信号和线粒体靶向信号其中之一且nh-r2是n(ch3)2。当然，如本文别处所述，官能团可以不同。在术语的典型用法下，基础化合物(例如，阿奇霉素)的单一取代将被称为类似物，并且对基础化合物进行的一个或多个修饰可以被认为是衍生物。为了简单起见，本公开可互换地使用术语“类似物”和“衍生物”。在一些实施方案中，反老化合物可以是罗红霉素衍生物或类似物。例如，反老组合物可以是具有式的化合物，其中或者r1是o-ch2-o-(ch2)2-och3且r2是膜靶向信号和线粒体靶向信号中之一，或者r1是膜靶向信号和线粒体靶向信号其中之一且nh-r2是n(ch3)2。当然，如本文别处所述，官能团可以不同。在一些实施方案中，反老化合物可以是泰利霉素衍生物或类似物。例如，反老组合物可以是具有式的化合物，其中或者r1是且r2是膜靶向信号和线粒体靶向信号其中之一，或者r1是膜靶向信号和线粒体靶向信号其中之一且nh-r2是n(ch3)2。在本方法的优选实施方案中，反老组合物具有至少一个官能团靶向信号(functionalgrouptargetingsignal)以改进线粒体摄取，并因此提高化合物的反老活性。使用上述通式，r1和r2中的至少一个或者是选自以下的膜靶向信号：棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、短链脂肪酸和中链脂肪酸；或者是选自以下的线粒体靶向信号：2-丁烯-1,4-双-tpp；2-氯苄基-tpp；3-甲基苄基-tpp；2,4-二氯苄基-tpp；1-萘甲基-tpp；对苯二甲撑双-tpp；2-丁烯-1,4-双-tpp的衍生物；2-氯苄基-tpp的衍生物；3-甲基苄基-tpp的衍生物；2,4-二氯苄基-tpp的衍生物；1-萘甲基-tpp的衍生物；和对苯二甲撑双-tpp的衍生物。在一些实施方案中，反老组合物还可以包括一种或多种另外的治疗剂。例如，一些实施方案可包括治疗量的四环素、金霉素、土霉素、地美环素、甲烯土霉素、多西环素(doxycycline)、米诺环素和替加环素中的至少一种。一些实施方案可包括治疗量的双羟萘酸扑蛲宁(pyrvinium)、阿托伐醌(atovaquone)、贝达喹啉(bedaquiline)、伊立替康、索拉非尼(sorafenib)、氯硝柳胺(niclosamide)、司替戊醇(stirpentol)、氯喹和雷帕霉素中的至少一种。以及一些实施方案可包括治疗量的以下各项中的至少一种：mitoriboscin、mitoketoscin、mitoflavoscin、2-丁烯-1,4-双-tpp；2-丁烯-1,4-双-tpp的衍生物；2-氯苄基-tpp；2-氯苄基-tpp的衍生物；3-甲基苄基-tpp；3-甲基苄基-tpp的衍生物；2,4-二氯苄基-tpp；2,4-二氯苄基-tpp的衍生物；1-萘甲基-tpp；1-萘甲基-tpp的衍生物；对苯二甲撑双-tpp；和对苯二甲撑双-tpp的衍生物。应当理解，tpp衍生物可以与反老化合物的衍生物或类似物缀合，并且起到靶向信号的作用，并且可以作为单独的处理化合物存在。一些实施方案可包括维生素c、黄连素、咖啡酸苯基酯、水飞蓟宾、brutieridin和melitidin中的至少一种。采取反老组合物形式的实施方案可以以各种形式制备，包括，例如，化妆品、丸剂、洗剂、洗发剂、霜剂、肥皂、皮肤清洁剂、剃须制剂、剃须后制剂、凝胶、贴剂(stick)、糊剂、喷雾剂、气雾剂、粉末、液体、含水悬浮液、水溶液、泡沫、透皮贴剂、酊剂和蒸气。这些形式旨在作为非限制性实例。本方法的实施方案可以采取用于衰老疗法(senescencetherapy)的组合物的形式。这样的组合物包括治疗量的如上所述的反老剂。例如，反老剂可以是阿奇霉素类似物、罗红霉素类似物和泰利霉素类似物中的一种，其具有以下各项中的至少一种：(i)膜靶向信号，其选自棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、短链脂肪酸和中链脂肪酸；和(ii)线粒体靶向信号，其选自三苯基鏻(tri-phenyl-phosphonium)(tpp)、tpp-衍生物、胍盐、胍盐衍生物和10-n-壬基吖啶橙。在一些实施方案中，用于衰老疗法的组合物还可以包括治疗量的四环素、金霉素、土霉素、地美环素、甲烯土霉素、多西环素(doxycycline)、米诺环素和替加环素中的至少一种。一些实施方案可包括治疗量的双羟萘酸扑蛲宁、阿托伐醌、贝达喹啉、伊立替康、索拉非尼、氯硝柳胺、司替戊醇(stiripentol)、氯喹和雷帕霉素中的至少一种。以及一些实施方案可包括治疗量的以下各项中的至少一种：mitoriboscin、mitoketoscin、mitoflavoscin、2-丁烯-1,4-双-tpp；2-丁烯-1,4-双-tpp的衍生物；2-氯苄基-tpp；2-氯苄基-tpp的衍生物；3-甲基苄基-tpp；3-甲基苄基-tpp的衍生物；2,4-二氯苄基-tpp；2,4-二氯苄基-tpp的衍生物；1-萘甲基-tpp；1-萘甲基-tpp的衍生物；对苯二甲撑双-tpp；和对苯二甲撑双-tpp的衍生物。另外，一些实施方案可包括维生素c、黄连素、咖啡酸苯基酯、水飞蓟宾、brutieridin和melitidin中的至少一种。本方法可以采取一种诱导受试者中衰老细胞死亡的方法的形式。在这样的实施方案中，向受试者施用治疗量的反老剂。如上所述，反老剂可以是阿奇霉素、罗红霉素、泰利霉素、阿奇霉素类似物、罗红霉素类似物和泰利霉素类似物中的至少一种。衍生物或类似物可包括一个或多个靶向信号，例如膜靶向信号和线粒体靶向信号。该方法可包括施用一种或多种另外的治疗剂。例如，治疗量的四环素、金霉素、土霉素、地美环素、甲烯土霉素、多西环素、米诺环素和替加环素中的至少一种可以与反老剂一起施用。作为另一实例，可以施用治疗量的双羟萘酸扑蛲宁、阿托伐醌、贝达喹啉、伊立替康、索拉非尼、氯硝柳胺、司替戊醇、氯喹和雷帕霉素中的至少一种。作为另一实例，可以施用治疗量的以下物质中的至少一种：mitoriboscin、mitoketoscin、mitoflavoscin、2-丁烯-1,4-双-tpp；2-丁烯-1,4-双-tpp的衍生物；2-氯苄基-tpp；2-氯苄基-tpp的衍生物；3-甲基苄基-tpp；3-甲基苄基-tpp的衍生物；2,4-二氯苄基-tpp；2,4-二氯苄基-tpp的衍生物；1-萘甲基-tpp；1-萘甲基-tpp的衍生物；对苯二甲撑双-tpp；和对苯二甲撑双-tpp的衍生物。作为另一实例，可以施用治疗量的维生素c、黄连素、咖啡酸苯基酯、水飞蓟宾、brutieridin和melitidin中的至少一种。治疗剂可以与反老剂共同施用，或者在一些实施方案中可以在反老剂之前或之后施用。本方法的一些实施方案可以采取一种延缓受试者中年龄相关疾病起始的方法的形式。年龄相关疾病可以是动脉粥样硬化、关节炎、癌症、心血管疾病、白内障、痴呆、糖尿病、脱发(hairloss)、高血压、炎性疾病、肾病、肌肉萎缩、神经疾病、骨关节炎、骨质疏松症、肺病、椎间盘退变和秃头症(alopecia)中的至少一种。例如，年龄相关疾病可以是神经疾病，例如轻度认知缺损、运动神经元功能障碍、阿尔茨海默病、帕金森病和黄斑变性。在这样的实施方案中，可以向受试者施用如本文所述的治疗量的反老剂。在一些实施方案中，反老剂可以与如本文所述的另一种治疗剂一起施用。反老剂可以在发病时，即，在诊断年龄相关疾病时或之后立即施用。或者，可在诊断后常规施用反老剂，并可使用本领域已知的技术确定频率和剂量。在一些实施方案中，可以在发病之前施用反老剂，特别是在(例如由于遗传标志物或其他生物学标志物)预期或可能在受试者中发生年龄相关的疾病的情况下。本方法还可以采取用于延缓受试者中年龄相关疾病发作的组合物的形式。例如但不限于，本方法可用于延缓动脉粥样硬化、关节炎、癌症、心血管疾病、白内障、痴呆、糖尿病、脱发、高血压、炎性疾病、肾病、肌肉萎缩、神经疾病、骨关节炎、骨质疏松症、肺病、椎间盘退变和秃头症。在这样的实施方案中，如本文所述，可以施用治疗量的反老剂，其包含阿奇霉素、罗红霉素、泰利霉素、阿奇霉素类似物、罗红霉素类似物和泰利霉素类似物中的至少一种。在一些实施方案中，反老剂可以与如本文所述的另一种治疗剂一起施用。本方法还可以采取一种用于筛选化合物的反老活性的方法的形式。在这样的实施方案中，细胞群在第一时间段内暴露于dna损伤剂以产生衰老细胞群。示例性的dna损伤剂是溴脱氧尿苷(brdu)，但在不脱离本发明方法的情况下可以使用其他dna损伤剂。用候选化合物在第二时间段内处理至少一部分衰老细胞群以形成经处理的细胞群。候选化合物是针对反老活性而筛选的化合物。分析经处理的细胞群的至少一种反老活性标志物。反老活性的示例标志物包括细胞活力、有氧糖酵解、自噬、抑制活性和细胞增殖降低。例如，如本文所述，自噬lc3蛋白可以被定量测量。磺酰罗丹明b的测定和测量细胞诱导的电阻抗是可用于分析细胞群的反老活性的测定的实例。第一时间段可以变化，并且在下面描述的实施方案中为约8天。第二时间段也可以变化，并且在下面讨论的实施方案中为约3至约5天。在一些实施方案中，可以在第二时间段之前冲洗掉brdu。在回顾了以下具体实施方案之后，本领域普通技术人员可以认识到本方法的其他实施方案。附图说明图1示出了一种根据本方法的实施方案筛选和鉴定反老药物的方法。图2显示了mrc-5成纤维细胞中dna合成减少的结果。图3a显示了mrc-5成纤维细胞中阿奇霉素的srb测定的结果。图3b和3c分别显示了在未经brdu预处理和经过brdu预处理的情况下，用100μm阿奇霉素处理的mrc-5成纤维细胞的图像。图4显示了mrc-5成纤维细胞中罗红霉素的srb测定的结果。图5显示了mrc-5成纤维细胞中50μm阿奇霉素的自噬诱导结果。图6a和6b显示了用阿奇霉素处理72小时后mrc-5细胞的代谢通量分析的细胞外酸化率(extracellularacidificationrate)结果。图7a和7b显示了用阿奇霉素处理72小时后mrc-5细胞的代谢通量分析的耗氧率结果。图8显示了用brdu预处理8天以诱导衰老，然后暴露于阿奇霉素5天的衰老的人皮肤细胞中的反老活性。图9a显示了mrc-5细胞系的来自xcelligence实时细胞健康监测的代表性细胞追踪，比较了brdu预处理、brdu预处理加阿奇霉素、单独的阿奇霉素和对照。图9b总结了相同细胞系的最终细胞指数结果。图10a和图10b分别显示了mrc-5细胞系的最终细胞指数结果和来自xcelligence实时细胞健康监测的代表性细胞追踪，比较了brdu预处理、brdu预处理加罗红霉素、单独罗红霉素和对照。图11a和11b分别显示了mrc-5细胞系的最终细胞指数结果和来自xcelligence实时细胞健康监测的代表性细胞追踪，比较了brdu预处理、brdu预处理加泰利霉素、单独的泰利霉素和对照。具体实施方式以下描述包括执行本方法的示例性实施方案的当前设想的模式。以下描述不是限制性的，仅仅是为了说明本发明的一般原理。如本文所述，本方法涉及开发用于诱导衰老的筛选分析法，及其用于鉴定具有反老活性(即选择性抑制衰老细胞和诱导衰老细胞死亡)的化合物中的用途。在一些实施方案中，本方法可用于鉴定和重新使用临床批准的具有反老活性的治疗剂以治疗老化及老化相关的病症。图1示出了根据本方法的筛选方法学。在步骤s101，选择正常成纤维细胞。接下来，在步骤s102，将细胞暴露于dna损伤剂以诱导衰老。例如，溴脱氧尿苷可用作损伤剂。在步骤s103，用候选处理化合物处理衰老细胞。当然，可以使用多个部分衰老细胞来筛选多种候选处理化合物，并且在该步骤中可以包括化合物浓度和处理时间段的变化。最后，在步骤s104，针对反老活性标志物分析经处理的细胞。还可以分析作为对照的正常细胞和/或未处理的衰老细胞。所使用的反老活性标志物可以变化，并且可以包括例如细胞活力、有氧糖酵解、自噬、抑制活性和细胞增殖减少。溴脱氧尿苷(5-溴-2'-甲基-脱氧尿苷，也称为brdu)可用于诱导衰老。brdu是通常用于鉴定增殖细胞的胸腺核苷的类似物。brdu诱导受控的dna损伤，并以高效率驱动细胞衰老。本方法的brdu法要求在100μm的brdu存在下对正常成纤维细胞进行长时间培养(8天)以诱导受控的dna损伤和衰老。在说明性实施方案中，发明人在基于brdu的测定中使用两种独立的正常的非永生化人成纤维细胞系，mrc-5肺细胞(用于筛选)和bj皮肤细胞(用于验证)。然后，正常的和衰老的成纤维细胞的等基因匹配培养物可以用于药物筛选以鉴定具有反老活性的药物。可以使用磺酰罗丹明b测定(在本领域中也称为srb测定)来检测反老活性。这种测定法测量了附着于组织培养皿的蛋白残留量，并且是细胞活力的替代标志物。该方法可用于快速筛选化合物，包括如抗生素等临床批准的药物。例如，在本文所述的实施方案中，本方法用于筛选红霉素家族成员，包括阿奇霉素和罗红霉素等化合物。应当理解，本方法可用于筛选其他化合物。从机理上讲，本方法直接并行比较了“正常”成纤维细胞和“衰老”成纤维细胞的反应。优先杀死衰老的成纤维细胞而不是正常的成纤维细胞的药物可以被认为是反老活性阳性的。在本文讨论的实施方案中使用该方法，本发明人鉴定了优先靶向衰老的成纤维细胞的两个红霉素家族成员，阿奇霉素和罗红霉素。下表1显示了两种浓度的红霉素、阿奇霉素和罗红霉素的结果，并且显示了阿奇霉素和罗红霉素在100μm具有反老活性。泰利霉素(另一种大环内酯)以及阿奇霉素、罗红霉素和泰利霉素的化学类似物也显示出有益的反老活性。然而，红霉素本身没有显示出任何反老活性。衰老的mrc-5细胞的活力(相对于对照的百分比)表1.红霉素家族抗生素的反老活性筛选结果下面将在所公开的实施方案中筛选的一些红霉素家族成员的准确化学结构显示为化合物i-iv。注意，红霉素家族中的化合物的结构具有显著相似性，但反老活性仅存在阿奇霉素、罗红霉素和泰利霉素中。红霉素阿奇霉素罗红霉素泰利霉素此外，本发明人证实使用brdu诱导的dna损伤足以诱导细胞衰老。图2显示了mrc-5成纤维细胞中dna合成减少的结果。如使用muse细胞周期试剂盒所测量的，用brdu处理2天将mrc-5成纤维细胞中的dna合成显著降低了约70％。brdu处理8天后mrc-5细胞的β-半乳糖苷酶(一种细胞衰老的生物标志物)呈阳性染色。对于该数据，n＝3；且*表示p<0.05。图2中的嵌体显示了用brdu处理的细胞中β-半乳糖苷酶阳性。结果证明，用brdu处理的细胞经历了细胞周期停滞，这可以通过s期细胞数量减少约70％以及β-半乳糖苷酶活性的诱导来证明。这些结果证实，对mrc-5细胞进行brdu处理可有效抑制dna合成并诱导β-半乳糖苷酶，这都是衰老的标志。在一个实施方案中，阿奇霉素在衰老的mrc-5人肺成纤维细胞中显示出反老活性。将mrc-5细胞用brdu预处理8天(以诱导衰老)，然后冲洗brdu并再暴露于阿奇霉素5天。此后，进行srb测定以确定药物对细胞活力的影响。图3a显示了用浓度为100μm和50μm的阿奇霉素处理的经brdu-处理的mrc-5成纤维细胞相对于对照(仅brdu)的srb测定结果。100μm的阿奇霉素对正常mrc-5肺成纤维细胞的活力没有影响，但选择性杀死衰老的mrc-5成纤维细胞。5天后，该浓度的阿奇霉素有效并选择性地消除了约50％的衰老细胞，而不影响对照细胞。然而，50μm的阿奇霉素没有影响。独立地重复这些实验至少3次，结果非常相似。对于该数据，**表示p<0.01。图3b和3c分别是在未经和经过brdu预处理的情况下，用100μm阿奇霉素处理的mrc-5成纤维细胞的图像。这些图像显示了阿奇霉素对正常细胞几乎没有影响，但在衰老细胞中诱导细胞死亡。图3b和图3c的右上方的比例尺表示20μm。与之相比，相同浓度的罗红霉素能更有效地杀死衰老的mrc-5成纤维细胞(约70％)，但对正常mrc-5成纤维细胞的活力影响较小。在一个实施方案中，将mrc-5细胞用brdu预处理8天(以诱导衰老)，然后冲洗brdu并再暴露于罗红霉素5天。暴露5天后，进行srb测定以确定药物对细胞活力的影响。图4显示了用罗红霉素处理的mrc-5成纤维细胞的srb测定结果。数据显示，浓度为100μm的罗红霉素对mrc-5细胞具有有效和选择性的作用，因为其在5天后消除了超过50％的衰老细胞。然而，50μm浓度的罗红霉素没有影响。独立地重复这些实验至少3次，结果非常相似。在图4中，*表示p<0.05。图3a和4中的数据显示50μm的阿奇霉素和罗红霉素对衰老细胞活力都未显示出显著影响。这表明反老作用是浓度依赖性的。应当理解，至少具有本领域普通技术的人员可以使用本领域已知和可获得的方法确定具有反老活性的药物的适当浓度。基于所测试的浓度，阿奇霉素毒性显示出选择性靶向衰老细胞表型的最高特异性。使用mrc-5成纤维细胞进行了进一步的实验，以更好地从机理上理解阿奇霉素的表型和代谢作用。将mrc-5细胞用50μm的阿奇霉素处理72小时。然后，通过使用muse自噬lc3抗体试剂盒(museautophagylc3-antibodybasedkit)检测自噬lc3蛋白来监测自噬。图5显示了结果并证明阿奇霉素是一种强有力的自噬表型诱导剂。对于该数据，图5中的**表示p<0.01；如所示，阿奇霉素处理导致mrc-5细胞中自噬提升3倍以上。本发明人接下来使用seahorsexfe96代谢通量分析仪测量了阿奇霉素对有氧糖酵解和线粒体代谢的影响。用25μm至100μm的阿奇霉素处理72小时后，用seahorsexfe96对mrc-5细胞进行代谢通量分析以测量细胞外酸化率(ecar)。图6a和6b显示了来自该代谢通量分析的ecar数据，并且可以看出，在所有测试浓度下，阿奇霉素提升了有氧糖酵解。图6a中40分钟时、从上至下的数据分别表示阿奇霉素的浓度为100μm、50μm、25μm和对照(即仅溶媒)。在图6b中，柱状数据从左到右表示对照、100μm、50μm和25μm。对于该数据，n＝3；**表示p<0.01，且***表示p<0.001。本发明人还使用代谢通量分析来评估阿奇霉素对耗氧率(ocr)的影响。结果示于图7a和7b，表明阿奇霉素对mrc-5细胞中的ocr具有双向作用(biphasiceffect)。在用25μm至100μm的阿奇霉素处理72小时后，这些数据通过用seahorsexfe96对mrc-5细胞进行代谢通量分析来产生。在41分钟时，图7a各线条中的数据从上至下为对照(即，仅溶媒)以及浓度为25μm、50μm和100μm。注意，最高浓度(100μm)的阿奇霉素触发线粒体呼吸增加54分钟，而较低浓度(50μm)则显著降低了线粒体呼吸。然而，25μm对ocr没有任何显著影响。对于该数据，n＝3，且*表示p<0.05。图7b显示了基础呼吸、质子泄漏、atp链接呼吸(atp-linkrespiration)、最大呼吸和备用呼吸能力的ocr。柱状数据从左到右表示对照以及浓度为100μm、50μm和25μm。注意阿奇霉素的线粒体影响是浓度依赖性的和双相性的。在25μm时，阿奇霉素对ocr未显示出显著的影响。然而，在50μm时，阿奇霉素明显抑制线粒体代谢，特别是影响最大呼吸和备用呼吸量。相反，在100μm时，阿奇霉素刺激最大呼吸和两倍以上的备用呼吸量。这可能代表对阿奇霉素处理的细胞代偿反应，以克服其线粒体抑制作用。用正常的非永生化的bj人成纤维细胞验证了阿奇霉素的选择性和效力。将bj细胞用brdu预处理8天以诱导衰老，随后洗出brdu并暴露于阿奇霉素5天。此后，进行srb测定以确定阿奇霉素对细胞活力的影响。阿奇霉素对bj细胞具有有效的和选择性的作用，因为于50μm5天后它消除了超过50％的衰老细胞而不降低对照细胞的存活力。独立地重复这些实验至少3次，结果非常相似。结果示于图8。注意，在图8中，**表示p<0.01。如图8所示，阿奇霉素在bj皮肤成纤维细胞中更有效，在仅50μm就显示出显著的反老活性。阿奇霉素还使正常bj皮肤成纤维细胞活力增加了超过25％。因此，阿奇霉素在来源自两个不同解剖学部位(肺组织和皮肤)的人成纤维细胞中显示出同等的选择性和反老活性。经筛选的化合物测试细胞测试浓度多西环素bj25–200μm氯化二亚苯基碘bj0.5–10μm褪黑素bj200–400μm阿斯巴甜bj200–400μm氨基葡萄糖bj10–15μm槲皮素bj10–100μm达沙替尼bj0.1–1μm氯喹bj、mrc-5100–200μm红霉素bj、mrc-5100–200μm克拉霉素bj、mrc-5100–200μm雷帕霉素mrc-550–500μm番茄红素mrc-525–50μmα-硫辛酸mrc-525–50μm表2.以本方法测试的其他化合物的反老活性使用这种采用mrc-5或bj成纤维细胞的反老测定系统，本方法用于测试许多其他候选药物。这些化合物列于上表2中，其还鉴定了所用的细胞系以及用于测试的化合物浓度范围。遗憾的是，在保留正常成纤维细胞对应物的同时，这些其他候选药物均未显示出任何特定的反老活性。尽管红霉素家族作为一个整体并不显示出反老活性，但阿奇霉素、罗红霉素和泰利霉素显示出特异性和选择性的反老活性。应当理解，阿奇霉素、罗红霉素和泰利霉素的许多化学类似物和衍生物也具有反老活性。传统上，“类似物(analog)”仅具有不同于母体化合物的单一元素，而“衍生物(derivative)”是衍生自另一种化合物或由另一种化合物合成的化学品。在本公开中，这些术语可互换使用，尽管在该术语的通常用法下，许多公开的衍生物也可称为类似物。例如，其中进行一个取代以连接靶向信号部分的衍生物可以被认为是类似物。应当理解的是，具有靶向信号(例如脂肪酸膜靶向信号或tpp-衍生物线粒体靶向信号)的衍生物具有增加的线粒体摄取，并且因此具有增加的效力。在严重依赖线粒体生物发生的细胞(例如癌症干细胞和衰老细胞)中，这种作用尤为明显。下面的化合物v-vii是通用结构式，分别显示了阿奇霉素、罗红霉素和泰利霉素类似物的官能团位置。阿奇霉素类似物罗红霉素类似物泰利霉素类似物各通用结构v至vii具有可能的缀合或取代的位置，由编号的“r”表示并称为r基团。其中每个r基团可以选自：氢、碳、氮、硫、氧、氟、氯、溴、碘、羧基、烷烃、环烷烃、基于烷烃的衍生物、烯烃、环状烯烃、基于烯烃的衍生物、炔烃、基于炔烃的衍生物、酮类、基于酮的衍生物、醛类、基于醛的衍生物、羧酸、基于羧酸的衍生物、醚类、基于醚的衍生物、酯类、基于酯的衍生物、胺类、基于胺的衍生物、酰胺类、基于酰胺的衍生物、单环或多环芳烃、杂芳烃类、基于芳烃的衍生物、基于杂芳烃的衍生物、苯酚类、基于苯酚的衍生物、苯甲酸、基于苯甲酸的衍生物、膜靶向信号以及线粒体靶向信号。应当理解，提及单个原子(例如碳或氮)仍需要满足化合价(例如，可能需要一个或多个额外的键或氢原子)。本文所用的术语“衍生物”是指通过化学反应衍生自类似化合物的化合物。衍生的反老化合物的一个或多个r基团可以被膜靶向信号和/或线粒体靶向信号取代，以增强化合物对衰老细胞的选择性和有效性。膜靶向信号包括例如棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、短链脂肪酸和中链脂肪酸。可以根据本领域已知的技术，例如脂化反应(例如豆蔻酰化、棕榈酰化等)合成所得的缀合物，以实现脂肪酸的化学修饰。线粒体靶向信号包括例如亲脂性阳离子，例如三苯基鏻(tpp)、tpp-衍生物、胍盐、胍盐衍生物和10-n-壬基吖啶橙。tpp-衍生物的非穷举实例包括2-丁烯-1,4-双-tpp；2-氯苄基-tpp；3-甲基苄基-tpp；2,4-二氯苄基-tpp；1-萘甲基-tpp；对苯二甲撑双-tpp；2-丁烯-1,4-双-tpp的衍生物；2-氯苄基-tpp的衍生物；3-甲基苄基-tpp的衍生物；2,4-二氯苄基-tpp的衍生物；1-萘甲基-tpp的衍生物；和对苯二甲撑双-tpp的衍生物。衍生物可以使用本领域已知的技术合成。应当理解，这些是作为示例提供的非穷举列表。在本方法的进一步应用中，使用xcelligence系统验证了阿奇霉素对衰老细胞的选择性。因为衰老细胞经历所谓的衰老相关分泌表型(sasp)，其涉及蛋白的合成和分泌的显著增加，本发明人评估了蛋白测量测定系统是否低估了测试化合物的反老活性。xcelligence测定系统不依赖于蛋白质，而是使用电阻抗连续实时测量细胞增殖。图9a和9b显示了来自用于阿奇霉素的xcelligence测定的代表性数据。图9a中的代表性细胞追踪显示衰老细胞(brdu-处理的/mrc-5成纤维细胞)被有效地杀死。在308.44小时标记处，且从上到下，曲线表示仅用brdu处理的细胞、仅用阿奇霉素处理的细胞、对照和用brdu和阿奇霉素处理的细胞。对照的归一化细胞指数在处理后立即明显更高，并且与仅brdu曲线一致，直到约235小时。图9b显示了柱状图，其突出显示了最终细胞指数，表示为平均值±平均值的标准误差。可以看出，阿奇霉素靶向大约97％的衰老mrc-5细胞。相反，正常对照mrc-5细胞仅受到阿奇霉素的瞬时影响，并通过细胞增殖快速恢复。用阿奇霉素处理的细胞系显示的恢复仅超过单独的溶媒对照细胞水平大于30％。该数据证实，阿奇霉素优先靶向衰老细胞，能高效去除约97％的衰老细胞(减少近25倍)。对于图9a和9b中所示的数据，****表示p<0.001。因此，实时xcelligence测定系统补充了更静态的srb测定，并且可以在药物筛选期间更直接可视化化合物可能的反老作用。还使用xcelligence测定来确认罗红霉素和泰利霉素的反老活性。图10a分别显示了针对对照、罗红霉素处理的对照、brdu处理的对照和经受90μm罗红霉素的经brdu处理的成纤维细胞的最终细胞指数，表示为平均值±平均值的标准误差。使用mrc-5成纤维细胞进行这些测定。与对照相比，罗红霉素处理对正常成纤维细胞的活力影响最小，但是靶向82％的用brdu处理的成纤维细胞以诱导衰老。将衰老的mrc-5细胞用brdu预处理8天以诱导衰老，然后冲洗brdu，再暴露于罗红霉素5天。独立地重复这些实验至少3次，结果非常相似。注意，在图10a中，*表示p<0.01。罗红霉素的xcelligence测定的代表性数据显示在图10b中。在时间249小时，从上到下，线代表对照、仅brdu、对照和罗红霉素(90μm)以及brdu和罗红霉素。可以看出，罗红霉素引起针对衰老成纤维细胞的细胞指数持续降低。这些数据证实罗红霉素具有强的反老活性。使用相同的方法来证实泰利霉素的反老活性。图11a突出显示了最终细胞指数，表示为平均值±平均值的标准误差，且图11b显示了代表性xcelligence数据。泰利霉素处理的浓度为90μm。图11a显示泰利霉素靶向100％的衰老细胞，并且对正常mrc-5细胞的影响可忽略。在243.5小时处，从上至下，图11b显示对照、对照和泰利霉素处理、对照和brdu以及brdu和泰利霉素处理。这些数据证明泰利霉素具有强的反老活性。因此，本方法提供了一种反老筛选方法学，以系统地鉴定靶向人成纤维细胞衰老表型的化合物。如以上公开的数据和附图中所示，本方法可以用于筛选临床批准的药物，并且应当理解，范围不受限制并且可以用于筛选其他化合物。使用mrc-5和/或bj细胞(两种成熟的非永生化人成纤维细胞系)生成结果。应当理解，只要确认了诱导衰老，就可以使用其他人细胞。为诱导细胞周期停滞和衰老，成纤维细胞暴露于100μm浓度的brdu(dna损伤剂)8天。应当理解，可以使用其他dna损伤剂而不偏离本方法。浓度和暴露时间可以变化，但是应当理解，应当验证衰老诱导。在brdu处理和洗涤后，将成纤维细胞暴露于测试药物或化合物。在上述结果中，测试化合物暴露5天。然而，测试化合物的时间和浓度可以变化。在药物处理后，可以通过srb测定系统使用酶标仪评估细胞附着情况，从而允许高通量分析。也可以使用上述的xcelligence测定。使用本方法的筛选方法学，本发明人证实三种临床上批准的大环内酯抗体，阿奇霉素、罗红霉素和泰利霉素，具有对衰老细胞高度选择性的反老活性。相反，通常被认为化学结构相似的母体化合物红霉素对衰老的成纤维细胞没有显示出任何毒性。对阿奇霉素的化学效应进行代谢分析，显示其诱导自噬和糖酵解的起始。此外，阿奇霉素在高剂量(100μm)下增加线粒体活性，但在较低剂量(50μm)下具有相反的作用，表明了明显的双向作用。这些代谢作用可使阿奇霉素具有高度特异性的反老活性。总之，本方法提供了一种筛选方法以鉴定具有反老活性的化合物，例如预先存在的临床批准的抗生素和其他药物。本方法可用于药物再利用，例如，作为可用于靶向衰老的成纤维细胞的反老药物。本方法用于证明阿奇霉素、罗红霉素和泰利霉素的选择性反老活性。这些化合物的化学类似物，例如可以使用上述通用化学式形成的化学类似物，也具有反老活性。特别地，包括添加膜靶向信号和/或线粒体靶向信号的衍生物具有增强的反老作用。因此，本方法可以采取一种用于筛选化合物的反老活性的方法的形式。可将细胞群暴露于溴脱氧尿苷(brdu)以在细胞群中产生或诱导衰老。在一些实施方案中，例如如上所述，可以在100μm的brdu浓度暴露约8天，尽管本领域普通技术人员可以根据细胞群和brdu浓度确定合适的暴露时间。可以用候选化合物处理衰老细胞群以产生经处理的细胞群。对于一些实施方案，处理时间可以是约3至5天，但可以变化。在一些实施方案中，可以处理一部分衰老细胞群，允许未处理的对照部分，并且，如果需要，允许用不同的处理化合物以不同的化合物浓度和/或以不同的处理时间处理多个部分。在处理前可以将brdu洗掉。应当理解，处理化合物、浓度和处理时间可以变化。在处理后，可以分析细胞群的反老活性的指示物或标志物。例如，可以使用本文所述的和/或本领域已知的测定来分析细胞群的细胞活力、有氧糖酵解、自噬、抑制活性、自噬lc3蛋白的定量测量以及细胞增殖减少。作为另一实例，磺酰罗丹明b测定和测量细胞诱导的电阻抗中的一种或两种均可用于分析反老活性。应当理解，本领域普通技术人员可以用与本文所述的测定不同的测定来评估处理化合物的反老活性。本发明的方法还可以采用具有治疗量的至少一种反老剂的反老组合物的形式。反老剂可以是阿奇霉素、罗红霉素、泰利霉素、阿奇霉素类似物、罗红霉素类似物和泰利霉素类似物。应当理解，治疗量可以由本领域普通技术人员使用本公开和本领域已知和可用的方法来确定。在一些实施方案中，反老剂可以被至少一种靶向信号取代，该靶向信号可以是(i)膜靶向信号，其选自棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、短链脂肪酸和中链脂肪酸；或(ii)线粒体靶向信号，其选自三苯基鏻(tpp)、tpp-衍生物、胍盐、胍盐衍生物和10-n-壬基吖啶橙。靶向信号取代通过增加反老剂的线粒体摄取来增强反老活性。例如，以上任何化合物iv-vi中所示的r基团可以包含靶向信号。在一些实施方案中，靶向信号可以是在取代位置其中之一处连接到反老化合物的tpp衍生物。tpp-衍生物的实例包括但不限于2-丁烯-1,4-双-tpp；2-氯苄基-tpp；3-甲基苄基-tpp；2,4-二氯苄基-tpp；1-萘甲基-tpp；对苯二甲撑双-tpp(p-xylylenebis-tpp)；2-丁烯-1,4-双-tpp的衍生物；2-氯苄基-tpp的衍生物；3-甲基苄基-tpp的衍生物；2,4-二氯苄基-tpp的衍生物；1-萘甲基-tpp的衍生物；和对苯二甲撑双-tpp的衍生物。应当理解，用tpp-衍生物取代可能需要共价键合。在一些实施方案中，反老剂可包括四环素化合物，包括四环素、金霉素、土霉素、地美环素、甲烯土霉素、多西环素、米诺环素和替加环素。这些线粒体生物发生抑制剂可用于抑制氧化代谢，并进一步增强反老活性。数据和进一步的示例在于2018年4月20日提交的国际申请pct/us2018/028587，其通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，反老剂可以包括糖酵解抑制剂，例如双羟萘酸扑蛲宁、阿托伐醌、贝达喹啉、伊立替康、索拉非尼、氯硝柳胺、司替戊醇、氯喹和雷帕霉素。如上所述，用反老剂处理的衰老细胞转变为糖酵解表型。糖酵解抑制剂的引入使这些细胞失去了功能性代谢途径，从而增强了衰老细胞群中细胞死亡的诱导。在本方法下，许多线粒体生物发生抑制剂可以与反老剂结合使用。线粒体抑制剂的其他实例包括：mitoriboscin、氧化代谢抑制剂和糖酵解代谢抑制剂、repurposcin、antimitoscin、mitoketoscin、mitoflavoscin、mitoflavin、tpp-衍生物、mdivi-1衍生物、氯霉素、嘌呤霉素和蛋白质合成的其他抑制剂(包括，例如，氨基糖苷和雷帕霉素类似物)、抗寄生虫药物(例如，双羟萘酸扑蛲宁和氯硝柳胺)、氯喹、司替戊醇、咖啡酸苯酯(cape)、维生素c、2-脱氧-葡萄糖(2-dg)、mct1抑制剂(azd3965和ar-c155858)、d-葡糖胺、槲皮素和卡维地洛(carvedilol)。以下段落描述了某些类别的线粒体生物发生抑制剂治疗剂。为简洁起见，相关共同待决申请以引用的方式并入，如同在本文中完全阐述一样。第一类线粒体生物发生抑制剂是如2018年3月14日提交的国际申请no.pct/us2018/022403中所述的，并通过引用以其整体并入。所引用的参考文献包括用于选择mitoriboscin化合物的数据。通常，mitoriboscin是线粒体抑制剂化合物，其具有抗癌活性并且通常具有抗微生物活性、化学疗法致敏作用、放射致敏作用和光致敏作用以及反老作用。这些化合物结合线粒体核糖体的大亚基或小亚基(或在某些情况下，两者都结合)并抑制线粒体生物发生。在所并入的申请中描述了mitoriboscin基团的实例以及通用化学结构和具体化合物，并且包括mitoribocycline、mitoribomycin、mitoribosporin和mitoribofloxin。说明性mitoriboscin如以下以化合物viii-xvii所示。mitoriboscin化合物23/e9mitoriboscin化合物23/g4mitoriboscin化合物24/b10mitoriboscin化合物24/d4mitoriboscin化合物24/f9mitoriboscin化合物24/h6mitoriboscin化合物24/h9化合物25/b3mitoriboscin化合物25/e3mitoriboscin化合物26/h4mitoketoscin是另一类线粒体生物发生抑制剂，其可用于增强反老活性。这些是非致癌性化合物，可与acat1/2和oxct1/2中的至少一种结合并抑制线粒体atp产生。这些化合物更全面地描述于2018年6月25日提交的国际申请pct/us2018/039354中，并且通过引用以其整体并入本文。通常，mitoketoscin靶向负责酮再利用并且具有抗癌和抗生素性质的线粒体酶。这些化合物结合至oxct1/2和acat1/2中的一个或两个活性催化位点以抑制线粒体功能。repurposcin和antimitoscin是第三类线粒体生物发生抑制剂，其可与本方法结合使用。2018年11月29日提交并且通过引用以其整体并入的本文的国际专利申请pct/us2018/062956更全面地描述了repurposcin。通常，“repurposcin”是具有固有的抗线粒体性质的化合物，其经过化学修饰以将化合物靶向线粒体。antimitoscin是一类repurposcin，更全面的描述于2018年5月18日提交的国际专利申请pct/us2018/033466中，其全部内容通过引用并入本文。具有固有的抗线粒体特性的现有抗生素可被化学修饰以靶向线粒体并抑制线粒体的生物发生。术语“antimitoscin”泛指具有固有的抗线粒体特性的抗生素，其经过化学修饰以将抗生素靶向线粒体。以前，抗生素中固有的抗线粒体活性被认为是有害的副作用。实际上，由于过度的抗线粒体特性，一些潜在的抗生素已被排除在试验之外，并且研究者已将抗线粒体活性视为潜在的缺点。然而，在本方法下，抗生素的固有的抗线粒体活性可以成为全新治疗的基础。抗线粒体素(antimitoscin)可以是具有固有的抗线粒体特性的抗生素，其具有线粒体靶向信号(例如，化学部分)的化学修饰。化学修饰可以是例如通过共价或非共价键。在一些实施方案中，抗生素是四环素家族、红霉素家族、氯霉素、双羟萘酸扑蛲宁、阿托伐醌和贝达喹啉的成员其中之一。线粒体靶向信号可以是选自包括膜靶向信号和线粒体核糖体靶向信号的组中的至少一种化合物或部分。膜靶向信号的实例包括短链(例如，链中少于6个碳原子)脂肪酸和中链(例如，链中6-12个碳原子)脂肪酸、棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸和油酸。线粒体靶向信号的实例包括基于三苯基鏻(tpp)和基于胍盐的部分。tpp和胍盐是无毒的化学部分，其在活细胞中在功能上表现为线粒体靶向信号(mts)。或者可以通常通过使用碳间隔臂或连接链与抗生素结合。mitoflavoscin和mitoflavin是可用于本方法的第四类线粒体生物发生抑制剂。这些化合物更全面地描述于2018年10月23日提交的国际专利申请pct/us2018/057093中，并且通过引用以其整体并入本文。mitoflavoscin是与含有黄素的酶结合并抑制线粒体atp产生的化合物。氯化二亚苯基碘(dpi)是mitoflavoscin的实例。应当理解，mitoflavoscin可以用线粒体靶向信号修饰，例如以上针对antimitoscin所讨论的。mitoflavin是抑制线粒体功能的核黄素衍生物，也可以用线粒体靶向信号进行化学修饰。例如，玫瑰黄色素[8-去甲基-8-(二甲氨基)-核黄素或8-二甲氨基核黄素)]是天然存在的为核黄素衍生物的抗菌化合物，其可以被化学修饰以优化其靶向csc和抑制线粒体生物发生的潜力。光色素(7,8-二甲基咯嗪)是核黄素降解的荧光光产物，其也可以被化学修饰以优化其靶向csc的潜力。核黄素的其他常见衍生物包括：咯嗪、lumiflavine、1,5-二氢核黄素和1,5-二氢黄素。这些核黄素衍生物中的每一种可以用线粒体靶向信号进行化学修饰以形成mitoflavin，并且可以根据本方法用作线粒体生物发生抑制剂。第六类线粒体生物发生抑制剂是tpp-衍生化合物，其不仅显示针对癌细胞(大块癌细胞、癌症干细胞和高能癌症干细胞)中的摄取的强烈偏好，而且破坏这些细胞中的线粒体生物发生。这些tpp-衍生化合物更全面地描述于2018年11月21日提交的国际专利申请pct/us2018/062174中，并且通过引用以其整体并入本文。如关于tpp-衍生物所使用的，本领域已知的衍生物是可以通过将一个原子取代为另一个原子或原子团而由母体化合物合成的化合物。例如，tpp的衍生物是2-丁烯-1,4-双-tpp，其包括通过丁烯连接的两个鏻基团。然后，2-丁烯-1,4-双-tpp的衍生物可以包括用另一种化合物如卤素或有机化合物取代一个或多个苯基。为了简洁起见，本公开并未识别所有可能的衍生物，因为该描述对于本领域普通技术人员而言应该是足够的。根据本方法可用作线粒体生物发生抑制剂的tpp-衍生化合物的其他实例包括2-丁烯-1,4-双-tpp；2-丁烯-1,4-双-tpp的衍生物；2-氯苄基-tpp；2-氯苄基-tpp的衍生物；3-甲基苄基-tpp；3-甲基苄基-tpp的衍生物；2,4-二氯苄基-tpp；2,4-二氯苄基-tpp的衍生物；1-萘甲基-tpp；1-萘甲基-tpp的衍生物；对苯二甲撑双-tpp；和对苯二甲撑双tpp的衍生物。当然，应当理解，上述列表不是tpp-衍生物的穷举列表。可以在本方法中使用的线粒体生物发生抑制剂的另一个类别是mdivi-1衍生物，描述于2018年12月18日提交的国际专利申请pct/us2018/066247中,并且通过引用以其整体并入本文。线粒体分裂抑制剂-1(mdivi-1)是选择性地且可逆地抑制drp1的小分子。已显示mdivi-1通过结合和抑制drp1自组装为线粒体周围的环状结构及其催化gtp水解的能力来靶向drp1。本方法可以采取具有如下所示的通式xviii的线粒体分裂抑制剂1(mdivi-1)衍生物的形式：或其药学上可接受的盐，其中每个r1-r8中的每一个可以选自由以下组成的组：氢、碳、氮、硫、氧、氟、氯、溴、碘、羧基、烷烃、环烷烃、基于烷烃的衍生物、烯烃、环状烯烃、基于烯烃的衍生物、炔烃、基于炔烃的衍生物、酮类、基于酮的衍生物、醛类、基于醛的衍生物、羧酸、基于羧酸的衍生物、醚类、基于醚的衍生物、酯类、基于酯的衍生物、胺类、基于胺的衍生物、酰胺类、基于酰胺的衍生物、单环或多环芳烃、杂芳烃类、基于芳烃的衍生物、基于杂芳烃的衍生物、苯酚类、基于苯酚的衍生物、苯甲酸、基于苯甲酸的衍生物以及线粒体靶向信号。在一些实施方案中，至少一个r基团是靶向信号，例如上述那些。可以在本方法中使用以增强反老剂活性的其他线粒体生物发生抑制剂的实例包括维生素c、黄连素、咖啡酸苯基酯、水飞蓟宾、brutieridin和melitidin。应当理解，反老组合物具有广泛的有利用途。例如，反老组合物可以用于衰老治疗，其通过例如诱导衰老细胞的死亡和/或抑制衰老细胞的增殖而构成对衰老细胞的治疗。反老组合物可以用于延缓年龄相关疾病的发作和/或进展，该年龄相关疾病例如动脉粥样硬化、关节炎、癌症、心血管疾病、白内障、痴呆、糖尿病、脱发、高血压、炎性疾病、肾病、肌肉萎缩、骨关节炎、骨质疏松症、肺病、椎间盘退变和秃头症。神经疾病如轻度认知功能障碍、运动神经元功能障碍、阿尔茨海默病、帕金森病和黄斑变性也可以通过使用反老组合物来治疗或延缓。在一些情况下，反老组合物可以用于治疗年龄相关疾病。反老剂可以采取多种形式。例如，反老剂可以采取以下形式：化妆品、丸剂、洗剂、洗发剂、霜剂、肥皂、皮肤清洁剂、剃须制剂、剃须后制剂、凝胶、贴剂、糊剂、喷雾剂、气雾剂、粉末、液体、含水悬浮液、水溶液、泡沫、透皮贴剂、酊剂和蒸气。例如，用于治疗脱发的反老组合物可以采取针对头发、头皮和/或皮肤的局部施用的形式。应当理解的是，本领域普通技术人员熟悉使用本领域已知和可获得的不需要在本文中重复的方法来选择反老剂的形式。如上所述，阿奇霉素、罗红霉素和泰利霉素的衍生物可以在不偏离本方法的情况下用作反老剂。在一些实施方案中，衍生物可能涉及一种或多种取代的靶向信号。将膜靶向信号或线粒体靶向信号添加至阿奇霉素、罗红霉素或泰利霉素显著增加了所得缀合物的线粒体摄取，并因此提高了反老活性。例如，如下所示的化合物xix-xxi证明了其中一个或多个功能性r基团为靶向信号的衍生物。首先，化合物xix显示了根据一些实施方案的阿奇霉素衍生物的通式，其中官能团r1或r2可以相同或可以不同，并且其中一个或二者可以是靶向信号。例如，r1和/或r2可以是选自以下的膜靶向信号：棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、短链脂肪酸和中链脂肪酸。(当然，缀合物将包括其中末端氢被除去用于键合的部分，例如棕榈酸盐)。r1和/或r2可以是线粒体靶向信号，选自三苯基鏻(tpp)、tpp-衍生物、胍盐、胍盐衍生物和10-n-壬基吖啶橙。tpp-衍生物的非穷举实例包括2-丁烯-1,4-双-tpp；2-氯苄基-tpp；3-甲基苄基-tpp；2,4-二氯苄基-tpp；1-萘甲基-tpp；对苯二甲撑双-tpp；2-丁烯-1,4-双-tpp的衍生物；2-氯苄基-tpp的衍生物；3-甲基苄基-tpp的衍生物；2,4-二氯苄基-tpp的衍生物；1-萘甲基-tpp的衍生物；和对苯二甲撑双-tpp的衍生物。在一些实施方案中，r1和r2中仅一个自母体化合物偏离(deviates)，并且因此衍生物是类似物。例如，r1可以是甲基并且r2可以是靶向信号。作为另一实例，r1可以是靶向信号并且nh-r2可以是-n(ch3)2。在一些实施方案中，r1或r2可以是靶向信号，r1和r2中的另一个可以选自由以下组成的：氢、羧基、烷烃、环烷烃、基于烷烃的衍生物、烯烃、环状烯烃、基于烯烃的衍生物、炔烃、基于炔烃的衍生物、酮类、基于酮的衍生物、醛类、基于醛的衍生物、羧酸、基于羧酸的衍生物、醚类、基于醚的衍生物、酯类、基于酯的衍生物、胺类、基于胺的衍生物、酰胺类、基于酰胺的衍生物、单环或多环芳烃、杂芳烃类、基于芳烃的衍生物、基于杂芳烃的衍生物、苯酚类、基于苯酚的衍生物、苯甲酸以及基于苯甲酸的衍生物。阿奇霉素衍生物化合物xx显示了根据一些实施方案的罗红霉素衍生物的通式，其中官能团r1或r2可以相同或可以不同，并且其中一个或二者可以是靶向信号。例如，如上所述，r1和/或r2可以是膜靶向信号或线粒体靶向信号。在一些实施方案中，r1和r2中仅一个自母体化合物偏离，并且因此衍生物是类似物。例如，r1可以是甲氧基，例如罗红霉素中存在的o-ch2-o-(ch2)2-och3，并且r2可以是靶向信号。作为另一个实例，r1可以是靶向信号并且nh-r2可以是n(ch3)2。在一些实施方案中，r1或r2可以是靶向信号，r1和r2中的另一个可以选自由以下组成：氢、羧基、烷烃、环烷烃、基于烷烃的衍生物、烯烃、环状烯烃、基于烯烃的衍生物、炔烃、基于炔烃的衍生物、酮类、基于酮的衍生物、醛类、基于醛的衍生物、羧酸、基于羧酸的衍生物、醚类、基于醚的衍生物、酯类、基于酯的衍生物、胺类、基于胺的衍生物、酰胺类、基于酰胺的衍生物、单环或多环芳烃、杂芳烃类、基于芳烃的衍生物、基于杂芳烃的衍生物、苯酚类、基于苯酚的衍生物、苯甲酸以及基于苯甲酸的衍生物。罗红霉素衍生物化合物xxi显示了泰利霉素衍生物的通式，其中官能团r1或r2可以相同或不同，并且其中一个或二者可以是靶向信号。例如，如上所述，r1和/或r2可以是膜靶向信号或线粒体靶向信号。在一些实施方案中，r1和r2中仅一个自母体化合物偏离，并且因此衍生物是类似物。例如，r1可以是存在于泰利霉素氨基甲酸酯环上的烷基-芳基基团，如并且r2可以是靶向信号。作为另一实例，r1可以是靶向信号并且-nh-r2可以是-n(ch3)2。在一些实施方案中，r1或r2可以是靶向信号，r1和r2中的另一个可以选自由以下组成：氢、羧基、烷烃、环烷烃、基于烷烃的衍生物、烯烃、环状烯烃、基于烯烃的衍生物、炔烃、基于炔烃的衍生物、酮类、基于酮的衍生物、醛类、基于醛的衍生物、羧酸、基于羧酸的衍生物、醚类、基于醚的衍生物、酯类、基于酯的衍生物、胺类、基于胺的衍生物、酰胺类、基于酰胺的衍生物、单环或多环芳烃、杂芳烃类、基于芳烃的衍生物、基于杂芳烃的衍生物、苯酚类、基于苯酚的衍生物、苯甲酸以及基于苯甲酸的衍生物。泰利霉素衍生物以下实例(化合物xxii)显示了阿奇霉素衍生物，其中r1是甲基，且r2是脂肪酸膜靶向信号。在该实例中，r2是来自膜靶向信号肉豆蔻酸的脂肪酸部分。应当理解，作为实例，化合物xxii可以通过本领域已知的脂质化技术——肉豆蔻酰化(myrostoylation)形成。该反老化合物的实例相对于阿奇霉素具有增加的线粒体摄取，且结果是增加了反老活性。化合物xxii是在本方法下具有反老活性的阿奇霉素衍生物的一个实例。应当理解的是，在本方法下可以制备许多其他具有反老活性的衍生物。以下段落描述了与本文公开的实验和数据相关使用的材料和方法。应当理解，这些材料和方法是说明性的，并且具有本领域普通技术水平的人员可以在不偏离本方法的情况下进行变化。mrc-5(ccl-171)人肺成纤维细胞和bj(crl2522)人皮肤成纤维细胞购自atcc(美国菌种保藏中心)。gibco牌细胞培养基(mem)购自lifetechnologies。溴脱氧尿苷、阿奇霉素、罗红霉素和红霉素购自sigma-aldrich。阿奇霉素(来自pfizer)是经fda批准的。罗红霉素(来自gsk和sandoz)在美国不可获得，但在新西兰、澳大利亚和以色列得到临床批准。将mrc-5或bj细胞接种于24孔板中。第二天，将一半平板用100μm的brdu处理，而对照孔仅用溶媒(dmso)处理，并在37℃在5％co2潮湿气氛中孵育8天。brdu处理8天后，细胞用各种测试化合物或药物(例如，阿奇霉素、罗红霉素、泰利霉素、红霉素等)再处理3-5天。在药物处理之前洗掉brdu。磺酰罗丹明b测定：在孵育平板之后，通过磺酰罗丹明b测定(srb测定)测量细胞活力。该测定基于细胞蛋白质含量的测量。将细胞用10％三氯乙酸(tca)在室温固定1小时，并在室温干燥过夜。然后，将平板用srb孵育30分钟，用1％乙酸洗涤两次并风干至少1小时。最后，将蛋白结合染料溶解在10mmtris、ph8.8溶液中，并使用酶标仪在540nm读数。自噬和细胞周期测定：根据制造商的说明书进行自噬(使用musetm自噬基于lc3抗体的试剂盒，merckmillipore)和细胞周期(musetm细胞周期试剂盒，merckmillipore)进行实验。β-gal染色：通过衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(#9860,cellsignallingtechnologyinc.)对brdu处理的mrc-5细胞进行β-半乳糖苷酶染色，并根据制造商的方案进行。seahorsexfe96代谢通量测定：使用seahorse细胞外通量(xf96)分析仪(seahorsebioscience，ma，usa)确定mcf7细胞的细胞外酸化率(ecar)和实时耗氧率(ocr)。将mrc-5细胞保持在补充有10％fbs(胎牛血清)、2mmglutamax和1％pen-strep的mem中。将每孔40,000个细胞接种到xf96孔细胞培养板中，并于37℃在5％co2湿润的气氛中培养过夜。第二天，用阿奇霉素处理细胞72小时。在实验之前，将板在预热的xf测定培养基中洗涤(对于ocr测量，xf测定培养基补充有10mm葡萄糖、1mm丙酮酸盐并调节至ph7.4)。随后于37℃在非co2培养箱中将细胞在175μl/孔xf测定培养基中保存1小时。在孵育期间，将xf测定培养基中的25μl的80mm葡萄糖、9μm寡霉素、1m的2-脱氧葡萄糖(用于ecar测量)和25μl的10μm寡霉素、9μmfccp、10μm鱼藤酮、10μm抗霉素a(用于ocr测量)装入xfe-96传感器盒的注射口。在实验期间，仪器在给定时间点将这些抑制剂注入孔中，同时连续测量ecar/ocr。ecar和ocr测量通过蛋白质含量归一化(磺酰罗丹明b测定)。通过xfe-96软件分析数据集，使用单向anova和student’st-检验计算。所有实验至少一式三份地进行以获得本文公开的结果。xcelligence分析系统：xcelligencertca系统(aceabiosciencesinc.)简而言之，将mrc-5肺成纤维细胞(单独的溶媒和/或用100μmbrdu处理的溶媒)接种于各孔中，采用其经由细胞诱导的电阻抗的测量以rtca(实时细胞分析)来评估阿奇霉素的功效。该方法允许定量细胞反应的开始和动力学。对于每种条件使用一式四份样品独立地重复实验数次。统计学分析：使用student'st-检验确定统计显著性；小于0.05的值被认为是显著的。数据显示为平均值±sem。本文所述的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不旨在限制本方法。如本文所用，单数形式“一(a、an)”和“所述/该(the))”也旨在包括复数形式，除非上下文另外清楚地指示。还将理解，当在本说明书中使用时，术语“包括(comprises和/或comprising)”指定了所陈述的特征、整数、步骤、操作、要素和/或组分的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分和/或其群组的存在或添加。在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明可以以其他具体形式实施。因此，本实施方案在所有方面都应被认为是说明性的而不是限制性的，本发明的范围由本申请的权利要求而不是由前面的描述来指示，并且在权利要求的等同物的含义和范围内的所有改变因此旨在被包含在其中。当前第1页12