具有抗癌活性的发酵乳杆菌WIKIM0102及包含其作为有效成分的组合物的制作方法

本发明涉及从泡菜中分离的新型的发酵乳杆菌wikim0102(lactobacillusfermentum，wikim0102，保藏编号：kccm12356p)及包含其作为有效成分的组合物。

背景技术：

癌症在全世界都表现出很高的死亡率，在西欧社会中，是仅次于心血管疾病的非常普遍的死亡原因。尤其是饮食生活的西式化带来的普遍的高脂肪饮食的摄取、环境污染物质的急剧增加、饮酒量的增加等使大肠癌、乳腺癌、前列腺癌等呈持续增加的趋势，在人口老龄化的同时，因吸烟人数的增加及大气污染引起的肺癌也在增加。在这样的情况下，需要切实地创造出一种能够早期预防及治疗的，能够促进人类健康、提高健康的生活质量及促进保健的抗癌物质。

另一方面，乳酸菌广泛分布于人类和动物的口腔、肠、阴道、粪便，还有泡菜之类的发酵食品等，与人类和动物的健康有着密切的关联。乳酸菌表现出调理肠道、有害菌抑制、免疫调节、降低血液中胆固醇、抗癌等多种健康促进效果。

目前，韩国公开专利第10-2015-0068061号公开了植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)pnu(kccm11352p)或肠模形乳杆菌(lactobacillusmesenteroides)pnu(kccm11353p)的抗癌活性，韩国授权专利第10-1287120号公开了包含植物乳杆菌dsrck10(保藏编号：kfcc-11433p)或植物乳杆菌dsrm2(保藏编号：kfcc-11432p)作为有效成分的用于治疗癌症的药学组合物，但仍无有关发酵乳杆菌的抗癌活性及优秀性的报告。

技术实现要素：

技术问题

本发明的目的在于，提供抗癌活性优良的新型泡菜乳酸菌发酵乳杆菌菌株。

并且，本发明的再一目的在于，提供包含新型泡菜乳酸菌发酵乳杆菌菌株作为有效成分的用于预防或治疗癌症的药学组合物。

并且，本发明的另一目的在于，提供包含新型泡菜乳酸菌发酵乳杆菌菌株作为有效成分的用于预防或改善癌症的食品组合物或食品添加剂组合物。

并且，本发明的还有一目的在于，提供包含新型泡菜乳酸菌发酵乳杆菌菌株作为有效成分的用于预防或改善癌症的饲料组合物或饲料添加剂组合物。

并且，本发明又一目的在于，提供向除人类外的个体给药上述组合物的癌症的预防或治疗方法。

技术方案

于是，本发明人致力于在泡菜中寻找在作为益生菌而表现出优良效果的同时表现出癌症的预防及治疗效果的乳酸菌菌株，结果，分离、鉴定出作为具有抗癌活性的新型乳杆菌属乳酸菌菌株的发酵乳杆菌wikim0102，从而完成本发明。

为了实现上述目的，本发明提供抗癌活性优良的发酵乳杆菌wikim0102菌株。

上述发酵乳杆菌wikim0102为源自泡菜的发酵乳杆菌的新型菌株。虽然在本发明中是从泡菜中分离、鉴定的发酵乳杆菌wikim0102，但其获得途径不限于此。

本发明的发酵乳杆菌wikim0102作为益生菌，具有乳酸菌的通常的调理肠道效果及免疫增强效果。乳杆菌属的乳酸菌具有调理肠道效果及免疫增强效果是广为人知的。

并且，本发明提供包含发酵乳杆菌wikim0102(保藏编号：kccm12356p)或其培养物作为有效成分的用于预防或治疗癌症的药学组合物。

并且，本发明提供包含发酵乳杆菌wikim0102(保藏编号：kccm12356p)或其培养物作为有效成分的用于预防或改善癌症的食品组合物或食品添加剂组合物。

并且，本发明提供包含发酵乳杆菌wikim0102(保藏编号：kccm12356p)或其培养物作为有效成分的用于预防或改善家畜的癌症的饲料组合物或饲料添加剂组合物。

并且，本发明提供包含发酵乳杆菌wikim0102(保藏编号：kccm12356p)或其培养物作为有效成分的用于发酵的乳酸菌发酵剂。

并且，本发明提供向除人类外的个体给药上述组合物的癌症的预防或治疗方法。

发明的效果

本发明的发酵乳杆菌wikim0102在现有的动物模型及移植有人类癌细胞的动物模型中表现出优秀的抗癌活性，因此可以有用地用作用于人类或动物的癌症的治疗、预防或改善等用途的组合物。

附图说明

图1为示出向ct26细胞移植小鼠静脉注射本发明的组合物1次(single)或3次(serial)后，用来观察肿瘤细胞的大小随时间变化的小鼠的肿瘤局部照片的图。

图2为示出向ct26细胞移植小鼠静脉注射本发明的组合物1次或3次后，测定肿瘤细胞的体积随时间变化及生长率的曲线图的图。

图3为示出向mc38细胞移植小鼠静脉注射本发明的组合后，用来观察肿瘤细胞的大小随时间变化的小鼠的肿瘤局部照片的图。

图4为示出向mc38细胞移植小鼠静脉注射本发明的组合物后，测定肿瘤细胞的体积随时间变化及存活率的曲线图的图。

图5为示出向ct26细胞移植小鼠静脉注射本发明的组合物后经过1小时及24小时后测定发酵乳杆菌wikim0102在组织内分布的曲线图的图。

图6为示出向mc38细胞移植小鼠静脉注射本发明的组合物后经过1小时及24小时后测定发酵乳杆菌wikim0102在组织内分布的曲线图的图。

图7为示出向hct116人大肠癌细胞细胞移植小鼠静脉注射本发明的组合物1次或3次后，用来观察肿瘤细胞的大小随时间变化的小鼠的肿瘤局部照片的图。

图8为示出向sw620人大肠癌细胞细胞移植小鼠静脉注射本发明的组合物后，用来观察肿瘤细胞的大小随时间变化的小鼠的肿瘤局部照片的图。

图9为示出向hct116人大肠癌细胞细胞移植小鼠静脉注射本发明的组合物后，测定肿瘤细胞的体积随时间变化的曲线图的图。

图10为示出向sw620人大肠癌细胞细胞移植小鼠静脉注射本发明的组合物后，测定肿瘤细胞的体积随时间变化的曲线图的图。

图11为示出向h1650人非小细胞肺癌细胞移植小鼠静脉注射本发明的组合物后，用来观察肿瘤细胞的大小随时间变化的小鼠的肿瘤局部照片的图。

图12为示出向h1650人非小细胞肺癌细胞移植小鼠静脉注射本发明的组合物后，测定肿瘤细胞的体积随时间变化的曲线图的图。

图13为示出使用发酵乳杆菌wikim0102处理源自人的胰腺癌aspc1细胞株及panc1细胞株后，测定细胞存活率(cellviabiliyassay)的曲线图的图。

图14为示出使用发酵乳杆菌wikim0102处理源自人的肝癌hepg2细胞株后，测定细胞存活率的曲线图的图。

图15为示出使用发酵乳杆菌wikim0102处理源自人的膀胱癌t24细胞株后，测定细胞存活率的曲线图的图。

图16为示出使用发酵乳杆菌wikim0102处理源自小鼠的皮肤癌黑色素瘤b16f10细胞株后，测定细胞存活率的曲线图的图。

图17为示出使用发酵乳杆菌wikim0102处理源自人的正常皮肤ccd-986-sk细胞株后，测定细胞存活率的曲线图的图。

具体实施方式

以下，通过实施例更为详细地说明本发明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅用于更具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不受这些实施例的限制。

对本发明的实施例从泡菜中分离的发酵乳杆菌菌株进行用于鉴定及分类微生物的16s核糖体rna(16srrna)碱基序列分析的结果，显出具有序列1(seqidno：1)的核酸序列。

因此，将具有序列1的16s核糖体rna碱基序列的本发明的微生物命名为发酵乳杆菌wikim0102，于2018年10月31日保藏于韩国微生物保藏中心(保藏编号：kccm12356p)。

在本发明中，“益生菌(probiotics)”应理解为“在包括人类在内的动物的胃肠道内通过改善宿主肠内微生物环境来给宿主的健康带来有益的影响的活的微生物”。在以单独或复合菌株的形态将具有益生菌活性的活的微生物以干燥的细胞形态或发酵产物的形态提供时，益生菌可以给宿主的肠内菌群带来有益的影响。

包含本发明的发酵乳杆菌wikim0102(保藏编号：kccm12356p)或其培养物作为有效成分的组合物具有癌症的预防或治疗效果，可以用作药剂学组合物。

上述癌症可以为选自由膀胱癌、乳腺癌、黑色素瘤、甲状腺癌、甲状旁腺癌、直肠癌、咽喉癌、喉癌、食管癌、胰腺癌、胃癌、舌癌、皮肤癌、脑肿瘤、子宫癌、胆囊癌、口腔癌、结肠癌、肛周癌、肝癌、肺癌以及大肠癌组成的组中的一种癌症，优选地，可以为大肠癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌或皮肤癌，但不限定于此。上述肺癌可以为非小细胞肺癌。

包含于本发明组合物的发酵乳杆菌wikim0102能够以活菌体或死菌体的方式存在，并且，还能够以干燥或冷冻干燥的形态存在。本发明所属技术领域的普通技术人员应该知道适合包含于多种组合物的乳酸菌的形态及制剂化方法。

上述组合物可以通过口服给药或胃肠外给药的方式给药。胃肠外给药可以通过静脉内注入、皮下注入、肌肉注入、腹腔注入、经皮给药、局部给药、鼻内给药、肺内给药及直肠内给药等方式给药，优选地，可以通过静脉内注入的方法给药，但不限定于此。

上述组合物的适当给药量可以根据制剂化方法、给药方式、患者的年两、体重、性别、疾病状态、饮食、给药时间、给药途径、代谢速度及反应敏感性之类的因素给出多种处方。

在将本发明的组合物用作药剂学组合物的情况下，除上述有效成分外，本发明的药剂学组合物可以使用药剂学上适合的、生理学上可接受的辅助剂来制备，上述辅助剂可以使用赋形剂、崩解剂、甜味剂、结合剂、包衣剂、膨胀剂、润滑剂、滑泽剂或香味剂等。

为了给药，除上述有效成分以外，上述药剂学组合物还可以通过包含一种以上的药剂学上可接受的载体来优选地制剂化药剂学组合物。

例如，为了制剂化为片剂或胶囊剂，有效成分可以与乙醇、甘油、水等之类的口服、无毒性的药剂学上可接受的非活性载体结合。并且，可以根据需要包含适当的结合剂、润滑剂、崩解剂及发色剂以及混合物。适当的结合剂包括淀粉、明胶、葡萄糖或β-乳糖之类的天然糖、玉米甜味剂、阿拉伯胶、黄芪胶或油酸钠之类的天然或合成胶、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠等，但不限定于此。崩解剂包括淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等，但不限定于此。在以液体溶液的形态制剂化的组合物中可接受的药剂学载体可以使用灭菌及适于活体的生理盐水、灭菌水、林格氏液、缓冲生理盐水、白蛋白注射溶液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇及混合一种以上这些成分来使用，可以根据需要添加抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等其他普通的添加剂。并且，还可以添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂及润滑剂来制剂化为水溶液、悬浮液等之类的注射用剂型、丸药、胶囊、颗粒或片剂。

进而，可以将remington'spharmaceuticalscience，mackpublishingcompany，eastonpa中公开的方法用作本发明相关技术领域的适当的方法，根据各疾病或成分来优选地制剂化。

包含本发明的发酵乳杆菌wikim0102(保藏编号：kccm12356p)或其培养物作为有效成分的组合物可以用作用于预防或改善癌症的食品组合物或食品添加剂组合物。

上述食品组合物可以为保健功能食品的形态。

上述“保健功能食品”是指根据有关保健功能食品的法律，使用具有对人体有用的功能性的原料或成分制备及加工的食品(第三条第一项)，“功能性”是指通过调节营养素或生理学作用等之类的保健用途来在人体的结构及功能中获得有用的效果(同一条的第二项)。

上述食品组合物还可以包括食品添加物，若无特别说明，“食品添加物”是否适当则根据韩国食品药品监督管理局认可的韩国食品添加物法典的总则及通常的实验方法等并按照与相关品种有关的规格及标准来判定。

收录于上述“食品添加物法典”的品种有例如酮类、甘氨酸、柠檬酸钾、烟酸、肉桂酸等化学合成品、柿子色素、甘草提取物、结晶纤维素、瓜尔豆胶等天然添加物、l-谷氨酸钠制剂、面类添加碱剂、防腐剂、焦油色素制剂等混合制剂类。

包含本发明的有效成分的食品可以为面包、糕类、干果类、糖果类、巧克力类、口香糖、果酱类之类的饼干类、冰淇淋类、冰果类、冰淇淋粉末类之类的冰淇淋制品类、牛奶类、低脂牛奶类、乳糖分解牛奶、加工乳类、山羊奶、发酵乳类、黄油乳类、浓缩乳类、奶油类、黄油类、天然奶酪、加工奶酪、奶粉类、乳清类之类的乳加工品类、肉食加工品、蛋加工品、汉堡包之类的肉食制品类、鱼饼、火腿、香肠、培根等鱼肉制品之类的鱼肉制品类、拉面类、干面类、生面类、汤面类、豪华干面类、改良熟面类、冷冻面类、意大利面类之类的面类、水果饮料、蔬菜类饮料、碳酸饮料、豆乳类、酸奶等的乳酸菌饮料、混合饮料之类的饮料、酱油、黄豆酱、辣椒酱、干黄酱、清国酱、混合酱、食醋、酱类、番茄酱、咖喱、调味汁之类的调味食品、人造黄油、起酥油以及比萨，但不限定于此。

除上述以外，本发明的组合物还可以包含多种营养剂、维生素、电解质、风味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、乙醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂等。此外，本发明的组合物还可以包含用来制备天然果汁、果汁饮料及蔬菜饮料的果肉。这些成分可单独或组合来使用。

包含本发明的有效成分的饮料组合物对其他成分没有特别限制，可以与普通饮料一样包含多种香味剂或天然碳水化合物等。上述天然碳水化合物的例有单糖(例如葡萄糖、果糖等)、二糖(例如麦芽糖、蔗糖等)以及多糖(例如糊精、环糊精等)之类的普通的糖以及木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等糖醇。除上述以外，还可以有利地将天然香味剂(索马甜、甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙a、甘草酸等))以及合成香味剂(糖精、阿巴斯甜等)用作香味剂。

并且，包含本发明的发酵乳杆菌wikim0102(保藏编号：kccm12356p)或其培养物作为有效成分的组合物可以用作用于预防或改善家畜的癌症的饲料组合物或饲料添加剂组合物。

在将上述组合物制备为饲料添加剂的情况下，上述组合物可以制备为20％至90％的高浓缩液或粉末或颗粒形态。上述饲料添加剂还可以包含柠檬酸、富马酸、己二酸、乳酸、苹果酸等有机酸或磷酸钠、磷酸钾、酸性焦磷酸盐、聚磷酸盐(聚合磷酸盐)等磷酸盐或多酚、儿茶素、α生育酚、迷迭香提取物、维生素c、绿茶提取物、甘草提取物、甲壳素、鞣酸、植酸等天然抗氧化剂中的一种或一种以上。在制备为饲料的情况下，上述组合物可以制剂化为普通的饲料形态，可以包含普通的饲料成分。

上述饲料及饲料添加剂还可以包含由粉碎或破碎的小麦、燕麦、大麦、玉米及大米；植物蛋白饲料，例如以芸苔、大豆以及葵花为主要成分的饲料；动物蛋白饲料，例如血粉、肉粉、骨粉及鱼粉；以及糖分及乳制品，例如各种奶粉及乳浆粉末组成的干燥成分等，此外还可以包含营养补充剂、消化及吸收促进剂、生长促进剂等。

上述饲料添加剂可以单独向动物给药，或者在食用载体中与其他饲料添加剂组合来给药。并且，上述饲料添加剂可以在追肥饲料中，或是将其与动物饲料直接混合，或者在饲料外以单独剂型的方式轻松地向动物给药。在上述饲料添加剂与饲料单独给药的情况下，可以与相关领域公知的药剂学上可接受的食用载体组合制备为即时释放或缓释剂型。上述载体可以为固体或液体载体，例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、玉米片、花生油、橄榄油、芝麻油及丙二醇。在使用固体载体的情况下，饲料添加剂可以为片剂、胶囊剂、散剂、含片或糖衣片剂或微分散性形态的追肥饲料。在使用液体载体的情况下，饲料添加剂可以为明胶软质胶囊剂，或者糖浆剂或悬浮液、溶液剂的剂型。

并且，上述饲料及饲料添加剂可以包含辅助剂，例如，保存剂、稳定剂、湿润剂或润滑剂、溶液促进剂等。上述饲料添加剂通过浸注、喷雾或混合的方式添加于动物的饲料来使用。

本发明的饲料或饲料添加剂可以适用于包括哺乳类、家禽及鱼类的大多数动物饮食中。

上述哺乳类不仅可以为猪、牛、绵羊、山羊以及用于实验的啮齿动物，还可以为宠物(例如狗、猫)，上述家禽类可以为鸡、火鸡、鸭、鹅、雉鸡以及鹌鹑等，上述鱼类可以为鳟鱼等，但不限定于此。

并且，包含本发明的发酵乳杆菌wikim0102(保藏编号：kccm12356p)或其培养物作为有效成分的组合物可以用作用于发酵的乳酸菌发酵剂。

实施例1.菌株的分离及培养

1-1.菌株的分离及鉴定

本发明人从泡菜中分离乳酸菌。

首先，破碎泡菜试样后，将泡菜提取物的原液涂抹在mrs琼脂(agar)培养基，在30℃的温度下培养24小时。将培养后形成的单一菌落进行继代培养来筛选同质单一菌落，通过16s核糖体rna碱基序列分析最终鉴定筛选的同质单一菌落。通过世界泡菜研究所微生物基因银行赋予其中效果最突出的一种乳酸菌wikim0102的固有编号，将其命名为发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)wikim0102，于2018年10月31日保藏于韩国微生物保藏中心。

用于鉴定通过本发明的实施例分离的菌株的16s核糖体rna碱基序列的分析结果显出具有seqidno：1的核酸序列。

1-2.菌株的培养

将上述实施例1-1中分离及鉴定的发酵乳杆菌wikim0102菌株的单一菌落接种于10ml的mrs液体培养基后，在37℃的温度下，以200rpm的频率震动培养24小时。培养后，以8000rpm的转速进行离心分离5分钟来去除培养液后，使用磷酸盐缓冲溶液(pbs，phosphatebufferedsaline)洗涤3次来去除剩余的培养基成分。

实施例2.实验动物(小鼠)的条件

实验中使用的实验动物为雄性5周龄的balb/c小鼠(orientbio公司，韩国)，在保持室内温度20±2℃、湿度55±15％的无特定病原体(spf)环境的动物饲育室中经过1周的稳定化时间后，在实验期间进行饲育。饲料以未添加抗生素的普通托盘饲料的方式提供，水以随时可以摄取的方式提供。实验以世界泡菜研究所动物实验伦理委员会认可的规程来实施所有的动物饲育、实验及安乐死。肿瘤大小变化的观察使用3.14×(长度×高度×宽度)/6的方式来测定肿瘤的体积(mm³)。

实施例3.ct26及mc38小鼠大肠癌细胞移植动物模型中的抗肿瘤效果分析

3-1.细胞培养

购入ct26小鼠大肠癌细胞(韩国细胞株银行，韩国)来使用，而mc38小鼠大肠癌细胞(全南大学医学院)是获得提供的。使用包含10％的胎牛血清和1％的青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)的dmem培养基(hyclone公司，美国)，在5％的co2、37℃的条件下培养ct26、mc38小鼠大肠癌细胞。

3-2.细胞移植癌症动物模型的制备

为了制备ct26细胞移植动物模型，在实验中使用6周龄的balb/c小鼠(18g～21g)，为了制备mc38细胞移植动物模型，在实验中使用6周龄的c57bl/6小鼠(18g～21g)。分别获取(harvest)1×10⁵细胞(cell)个培养的小鼠大肠癌细胞ct26和mc38后，在50μl的磷酸盐缓冲溶液中重悬后，注入小鼠的右侧大腿部(thigh)皮下。

3-3.抗肿瘤效果分析

向所形成的肿瘤的体积为约80mm³～100mm³的ct26细胞移植小鼠的尾部静脉内注射发酵乳杆菌wikim0102。利用磷酸盐缓冲溶液将发酵乳杆菌wikim0102定量为1×10¹⁰cfu/ml的细菌数来准备，分别向实验动物的尾部1次或3次静脉注射0.1ml(1×10⁹cfu)，向阴性对照组给药磷酸盐缓冲溶液。通过肉眼观察ct26细胞移植小鼠的大肠癌肿瘤大小随时间变化的结果如图1所示。

如图1所示，相比于阴性对照组(pbs)，在静脉注入发酵乳杆菌wikim0102的情况下，经过12天后，观察到肿瘤细胞以能够通过肉眼确认的程度缩小了。尤其确认，比起注入1次(single)的情况，注入3次(serial)时，肿瘤的大小缩小得更大，在注入3次后经过12天的情况下，肿瘤缩小到肉眼观察不到的程度。

并且，ct26细胞移植小鼠中肿瘤大小的体积随时间变化的测定结果如图2所示。

如图2所示，在注射1次发酵乳杆菌wikim0102的情况下，经过18天后，相比于阴性对照组，可以确认对ct26细胞移植小鼠的大肠癌肿瘤的大小具有约4.2倍的抗肿瘤效果，而在以间隔6天的方式注射3次的情况下，18天后，相比于阴性对照组，观察到约27.2倍的抗肿瘤效果。

并且，向所形成的肿瘤的体积为约80mm³～100mm³的mc38细胞移植小鼠的尾部静脉内注射发酵乳杆菌wikim0102。利用磷酸盐缓冲溶液将发酵乳杆菌wikim0102定量为1×10¹⁰cfu/ml的细菌数来准备，向实验动物的尾部1次静脉注射0.1ml(1×10⁹cfu)，向阴性对照组给药磷酸盐缓冲溶液。通过肉眼观察mc38细胞移植小鼠的大肠癌肿瘤大小随时间变化的结果如图3所示。

如图3所示，相比于阴性对照组(pbs)，在静脉注入发酵乳杆菌wikim0102的情况下，可以观察到肿瘤细胞以能够通过肉眼确认的程度缩小了。经过15天时，可以观察到肿瘤缩小到肉眼观察不到的程度。

并且，mc38细胞移植小鼠中肿瘤大小的体积随时间变化的测定结果如图4所示。

如图4所示，在注射1次发酵乳杆菌wikim0102的情况下，12天后，相比于阴性对照组，可以确认对mc38细胞移植小鼠的大肠癌肿瘤的大小具有约23.8倍的抗肿瘤效果。

本发明人通过上述实验结果可以确认，发酵乳杆菌wikim0102的抗肿瘤效果优秀，尤其在连续给药的情况下，显出更为优秀的抗肿瘤效果。

实施例4.发酵乳杆菌wikim0102注射后的生物学分布(biodistributionstudy)

向移植有ct26细胞和mc38细胞的小鼠的尾部静脉注射发酵乳杆菌wikim0102后，分别在经过1小时和24小时后，摘出肿瘤组织并匀质化后，涂抹于mrsagar培养基。涂抹后在37℃的温度下培养24小时后，对生成的菌群进行计数来计算cfu/g组织。为了比较肿瘤组织与其他主要器官组织的发酵乳杆菌wikim0102靶向程度，还将肝脏及脾脏以相同的条件进行匀质化来计数细菌，其结果如图5(ct26细胞移植小鼠)及图6(mc38细胞移植小鼠)所示。

如图5及图6所示，在所有移植有ct26和mc38细胞的癌症动物模型中，在注射发酵乳杆菌wikim0102后从1小时后开始，在肿瘤组织中观察到1×10⁷cfu/g以上的细菌数，在24小时后，确认仍保持肿瘤组织的细菌数。

通过上述结果可以确认，在移植有ct26细胞和mc38细胞的小鼠模型中，发酵乳杆菌wikim0102积聚于肿瘤组织，被有效地靶向化。

实施例5.在hct116、sw620(人大肠癌)细胞与h1650(人非小细胞肺癌)细胞移植动物模型中的抗肿瘤效果分析

5-1.细胞培养

购入hct116人大肠癌细胞与sw620人大肠癌细胞(韩国细胞株银行，韩国)来使用，而h1650人非小细胞肺癌细胞(全南大学医学院)是获得提供来使用的。使用包含10％的胎牛血清和1％的青霉素-链霉素的rpmi1640培养基(hyclone公司，美国)，在5％的co2、37℃的条件下培养hct116、sw620以及h1650细胞。

5-2.hct116、sw620以及h1650细胞移植癌症动物模型的制备

为了制备hct116、sw620以及h1650细胞移植癌症动物模型，实验中使用6周龄的balb/c小鼠(17g～20g)。分别获取(harvest)5×10⁶细胞(cell)个培养的hct116、sw620以及h1650细胞后，在50μl的磷酸盐缓冲溶液中重悬后，注入小鼠的右侧大腿部皮下。

5-3.对hct116、sw620大肠癌细胞的抗肿瘤效果分析

向所形成的肿瘤的体积为约80mm³～100mm³的hct116及sw620大肠癌细胞移植小鼠的尾部静脉内注射发酵乳杆菌wikim0102。利用磷酸盐缓冲溶液将发酵乳杆菌wikim0102定量为1×10¹⁰cfu/ml或5×10⁹cfu/ml的细菌数来准备。向移植有hct116人大肠癌细胞的癌症动物模型的尾部静脉注射1次或以相隔6天的方式静脉注射3次0.1ml(1×10⁹cfu)的准备好的发酵乳杆菌wikim0102，静脉注射1次或以相隔6天的方式静脉注射3次0.1ml(5×10⁸cfu)的准备好的发酵乳杆菌wikim0102，向移植有sw620人大肠癌细胞的癌症动物模型的尾部静脉注射1次0.1ml(1×10⁹cfu)的准备好的发酵乳杆菌wikim0102。以相同方式向阴性对照组给药磷酸盐缓冲溶液，示出通过肉眼观察的26天内的肿瘤大小随时间变化的结果及肿瘤大小的体积变化的曲线图如图7至图10所示。

如图7及图8所示，在向移植有hct116及sw620人大肠癌细胞的动物模型注入发酵乳杆菌wikim0102的情况下，观察到肿瘤的大小缩小到肉眼能够观察到的程度，比起给药0.1ml(5×10⁸cfu)的发酵乳杆菌wikim0102的情况，确认给药0.1ml(1×10⁹cfu)时的肿瘤缩小效果更为优秀。尤其确认向移植有hct116人大肠癌细胞的动物模型给药3次时比给药1次时的肿瘤大小缩小效果更为优秀。

并且，如图9及图10所示，在向移植有hct116及sw620人大肠癌细胞的动物模型注入发酵乳杆菌wikim0102的情况下，可以通过数值确认肿瘤大小的体积明显缩小。在向移植有hct116人大肠癌细胞以1×10⁹cfu/0.1ml的量注射发酵乳杆菌wikim0102一次或3次的情况下，26天后与阴性对照组相比，分别观察到约4.2倍和约27.2倍的抗肿瘤效果，在以5×10⁸cfu/0.1ml的量注射发酵乳杆菌wikim0102的情况下，26天后与阴性对照组相比，观察到约2.9倍的抗肿瘤效果。另一方面，以1×10⁹cfu/0.1ml的量向移植有sw620人大肠癌细胞的癌症动物细胞的动物模型注射发酵乳杆菌wikim0102一次的情况下，26天后与阴性对照组相比，观察到约2.1倍的抗肿瘤效果。

通过上述结果确认，比起注射发酵乳杆菌wikim0102一次的情况，注射3次时在抑制肿瘤成长方面表现出更为优秀的效果。因此，在肿瘤的治疗中，适当间隔的注射给药方法比一次注射的方法更为有效，确认这种方法不仅对移植小鼠大肠癌细胞的动物模型具有优秀的抗癌活性，对移植人大肠癌细胞的动物模型也具有优秀的抗癌活性。

5-4.对h1650非小细胞肺癌的抗肿瘤效果分析

向所形成的肿瘤的体积为约80mm³～100mm³的h1650非小细胞肺癌细胞细胞移植小鼠的尾部静脉内注射发酵乳杆菌wikim0102。利用磷酸盐缓冲溶液将发酵乳杆菌wikim0102定量为1×10¹⁰cfu/ml或5×10⁹cfu/ml的细菌数来准备。向移植有h1650人非小细胞肺癌细胞的癌症动物模型的小鼠的尾部静脉注射0.1ml(1×10⁹cfu)的准备好发酵乳杆菌wikim0102一次。以相同的方式向阴性对照组给药磷酸盐缓冲溶液，通过肉眼观察的21天内的肿瘤大小随时间变化的结果及肿瘤大小的体积变化的曲线图如图11至图12所示。

如图11所示，在向移植有h1650非小细胞肺癌细胞的动物模型注入发酵乳杆菌wikim0102的情况下，观察到肿瘤的大小缩小了肉眼能够观察到的程度。

并且，如图12所示，在向移植有h1650非小细胞肺癌细胞的动物模型注入发酵乳杆菌wikim0102的情况下，可以通过数值确认肿瘤大小的体积明显缩小。在向移植有h1650非小细胞肺癌细胞的动物模型注入发酵乳杆菌wikim0102的情况下，21天后与阴性对照组相比，观察到约1.8倍的抗肿瘤效果。

实施例6.生物体外(invitro)抗癌活性功效分析

6-1.细胞株的准备

为了观察发酵乳杆菌wikim0102的抗癌活性效果，使用cellcountingkit-8测定细胞存活率。在抗癌活性功效实验中使用的细胞为源自人的胰腺癌aspc1、panc1细胞株、源自人的肝癌hepg2细胞株、源自人的膀胱癌t24细胞株、源自小鼠的皮肤黑色素瘤b16f10细胞株，还有作为正常皮肤细胞株的ccd-986-sk细胞株。

使用添加10％的胎牛血清和1％的青霉素-链霉素的rpmi培养基，在5％的co2、37℃的条件下继代培养源自人的癌细胞aspc1、panc1、hepg2以及t24细胞株后，使用生长期的细胞进行实验。使用0.25％的胰蛋白酶edta(trypsin-edta)在37℃的温度下在培养基中处理aspc1、panc1、hepg2以及t24细胞3分钟来使细胞脱落后，使用杜氏磷酸盐缓冲溶液(dpbs)洗涤2次来准备为1×10⁴cells/well。

使用添加10％的胎牛血清和1％的青霉素-链霉素的dmem培养基，在5％的co2、37℃的条件下对源自小鼠的皮肤黑色素瘤b16f10细胞株进行继代培养，使用生长期的细胞进行实验。使用0.25％的胰蛋白酶edta在37℃的温度下在培养基中处理b16f10细胞3分钟来使细胞脱落后，使用杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤2次来准备为1×10⁴cells/well。

使用添加10％的胎牛血清和1％的青霉素-链霉素的rpmi培养基，在5％的co2、37℃的条件下对于源自人的正常皮肤细胞ccd-986-sk细胞株进行继代培养后，使用生长期的细胞进行实验。使用0.25％的胰蛋白酶edta在37℃的温度下在培养基中处理ccd-986-sk细胞3分钟来使细胞脱落后，使用杜氏磷酸盐缓冲溶液洗涤2次来准备为1×10⁴cells/well。

6-2.细胞存活率测定结果

本发明在培养胰腺癌(2种)、肝癌(1种)、膀胱癌(1种)、皮肤癌(1种)细胞后，测定使用发酵乳杆菌wikim0102处理的细胞的存活率，以未使用发酵乳杆菌wikim0102处理的癌细胞的吸光度为100％的存活率基准来确认抗癌活性功效。

细胞存活率是通过在以每摩尔(moi1)的浓度处理后，培养72小时，培养后使用cellcountingkit-8试剂处理后测定吸光度(od450nm)来确认的。以未使用发酵乳杆菌wikim0102处理的细胞(comtrol)的吸光度为100％的基准，来计算使用发酵乳杆菌wikim0102处理的细胞的存活率，实验结果记录如下。

使用发酵乳杆菌wikim0102处理源自人的胰腺癌aspc1细胞株、源自人的胰腺癌细胞株panc1后测定细胞存活率的结果如图13所示。

如图13所示，在使用发酵乳杆菌wikim0102处理的源自人的胰腺癌aspc1细胞株中测定出26.3％的细胞存活率，在源自人的胰腺癌细胞株panc1中测定出49.4％的细胞存活率。通过上述结果可以确认，在使用发酵乳杆菌wikim0102处理胰腺癌细胞株的情况下细胞存活率被显著抑制，因此对胰腺癌具有优秀的抗癌活性。

并且，使用发酵乳杆菌wikim0102处理源自人的肝癌hepg2细胞株后测定细胞存活率的结果如图14所示。

如图14所示，在使用发酵乳杆菌wikim0102处理的源自人的肝癌hepg2细胞株中测定出31.4％的细胞存活率。通过上述结果可以确认，在使用发酵乳杆菌wikim0102处理肝癌细胞株的情况下细胞存活率被显著抑制，因此对肝癌具有优秀的抗癌活性。

并且，使用发酵乳杆菌wikim0102处理源自人的膀胱癌t24细胞株后测定细胞存活率的结果如图15所示。

如图15所示，在使用发酵乳杆菌wikim0102处理的源自人的膀胱癌t24细胞株中测定出66.8％的细胞存活率。通过上述结果可以确认，在使用发酵乳杆菌wikim0102处理膀胱癌细胞株的情况下细胞存活率被显著抑制，因此对膀胱癌具有优秀的抗癌活性。

并且，使用发酵乳杆菌wikim0102处理源自小鼠的皮肤黑色素瘤b16f10细胞株后测定细胞存活率的结果如图16所示。

如图16所示，在使用发酵乳杆菌wikim0102处理的源自小鼠的皮肤黑色素瘤b16f10细胞株中测定出39.7％的细胞存活率。通过上述结果可以确认，在使用发酵乳杆菌wikim0102处理皮肤癌细胞株的情况下细胞存活率被显著抑制，因此对皮肤癌具有优秀的抗癌活性。

与上述实验做对比的，使用发酵乳杆菌wikim0102处理源自人的正常皮肤ccd-986-sk细胞株后测定细胞存活率的结果如图17所示。

如图17所示，在使用发酵乳杆菌wikim0102处理的正常皮肤细胞株中测定出96.2％的细胞存活率。通过上述结果可以确认，发酵乳杆菌wikim0102对正常皮肤细胞株没有细胞毒性。

双侧检验t-test验证了阴性对照组与发酵乳杆菌wikim0102处理组之间的肿瘤生长在统计学上具有显著性差异。p＜0.05可以在所有肿瘤生长曲线图分析中考虑为具有显著性。

pct

电子版原本

序列表

<110>韩国食品研究院

<120>具有抗癌活性的发酵乳杆菌wikim0102及包含其的组合物

<130>kp181207-03_wikim0102

<160>1

<170>kopatentin3.0

<210>1

<211>1383

<212>dna

<213>发酵乳杆菌（lactobacillusfermentum）

<400>1

cacctgattgattttggtcgccaacgagtggcggacgggtgagtaacacgtaggtaacct60

gcccagaagcgggggacaacatttggaaacagatgctaataccgcataacaacgttgttc120

gcatgaacaacgcttaaaagatggcttctcgctatcacttctggatggacctgcggtgca180

ttagcttgttggtggggtaaggcctaccaaggcgatgatgcatagccgagttgagagact240

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tcttccacaatgggcgcaagcctgatggagcaacaccgcgtgagtgaagaagggtttcgg360

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tgaaagccttcggcttaaccggagaagtgcatcggaaactggataacttgagtgcagaag600

agggtagtggaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtg660

gcgaaggcggctacctggtctgcaactgacgctgagactcgaaagcatgggtagcgaaca720

ggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgagtgctaggtgttggagggtttc780

cgcccttcagtgccggagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaagg840

ttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcg900

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taa1383