一种三叶青的提纯物及提纯方法与流程

本发明属于三叶青提纯
技术领域：
，具体涉及一种三叶青的提纯物及提纯方法。
背景技术：
：胰腺癌是恶性度极高的实体肿瘤之一。近年来，胰腺癌的发病在全世界范围内均呈现逐年升高的趋势。其中95％的胰腺癌为胰腺导管细胞癌(pancreaticductaladenocarcinoma，pdac)。pdac具有高侵袭转移的特性，早期缺乏明显的临床症状和体征，约60％的患者在确诊时已经出现了远处转移，25％的患者处于晚期，无法进行根治性切除手术，而根治术后早期的转移和复发也是导致其预后不良的重要原因。在美国，pdac的五年生存率为8％左右，而英国只有3％，故pdac可以被认为是一种致死性的癌症。由于胰腺癌早期诊断困难，手术切除率低，放化疗联合的多学科治疗是目前临床上治疗胰腺癌的主要手段。随着吉西他滨等化疗药物的研发和应用，如吉西他滨联合卡培他滨的辅助化疗方案是欧美胰腺癌切除术后的标准治疗，但是化疗药物的不良反应、低应答率及其在亚洲人群的治疗效果仍在进一步研究中，需要新的循证医学证据。因此，寻找新的胰腺癌的化疗药物治疗靶点具有重要意义。在前期的研究阶段，我们发现三叶青的粉剂对胰腺癌具有一定的抑制作用，但对于其有效成分尚不明确，因此，本发明通过相应的提取手段提取出有效成分。技术实现要素：发明目的：针对现有技术中存在问题或不足，本发明提供一种三叶青的提纯物及提纯方法。为实现上述发明目的，本发明的实施例提供一种三叶青的提纯物，其特征在于，所述提纯物至少包括syq-d30-1s8p2、syq-d30-2s9p1、syq-d30-3s11p3、syq-d30-3s14p2、syq-d30-4s5p1、syq-d30-4s8p2p1、syq-d30-5s11p1、syq-d30-1s8p4、syq-d30-5s8p1p1。本发明的实施例还提供一种三叶青的提纯方法，其特征在于，包括以下过程：s1、三叶青药材提取及检测干燥三叶青药材粉末5kg，用70％乙醇回流提取3次，每次1.5h；提取液经lcms检测；s2、hp-20大孔吸附树脂富集将提取液浓缩至小体积，用10％乙醇超声溶解，经hp-20大孔树脂吸附后，分别用10％、30％、50％、95％乙醇梯度洗脱收集，各部分洗脱液经lcms检测；s3、正相中压柱分离将30％、50％、95％乙醇洗脱液合并，减压浓缩后得到的干燥样品，采用二氯甲烷-甲醇，按照1:1溶解，硅胶拌样，正相中压硅胶柱分离，采用二氯甲烷-甲醇体系梯度洗脱(100:0-0:100)，共收集到馏分15份；lcms分析合并相似组分，合并后组分分别为syq-d30-1(1)、syq-d30-2(2)、syq-d30-3(3)、syq-d30-4(4)、syq-d30-5(5～6)、syq-d30-7(7～10)、syq-d30-11(11～15)；取样分析，lcms检测；s4、馏分syq-d30-12.3g经凝胶柱分离，甲醇体系洗脱，每40ml收集一份，共收集18馏分，lcms分析合并相似组分，得到syq-d30-1s8(8-10)；该馏分经semi-pre-hplc分离得到化合物：syq-d30-1s8p2、syq-d30-1s8p4；馏分syq-d30-20.62g经凝胶柱分离，二氯甲烷-甲醇体系洗脱，每40ml收集一份，共收集10馏分，lcms分析合并相似组分，得到syq-d30-2s9(9-10)；该馏分经semi-pre-hplc分离得到化合物：syq-d30-2s9p1；馏分syq-d30-31.2g经凝胶柱分离，甲醇体系洗脱，每40ml收集一份，共收集15个馏分，lcms分析合并相似组分，得到syq-d30-3s11(11-12)、syq-d30-3s14(14-15)；2个馏分经semi-pre-hplc分离得到化合物：syq-d30-3s11p3、syq-d30-3s14p2；馏分syq-d30-43.0g经凝胶柱分离，甲醇体系洗脱，每40ml收集一份，共收集15个馏分，lcms分析合并相似组分，得到syq-d30-4s5(5)、syq-d30-4s8(7-8)；2个馏分经semi-pre-hplc分离得到化合物：syq-d30-4s5p1、syq-d30-4s8p2p1；馏分syq-d30-58.5g经凝胶柱分离，甲醇体系洗脱，每40ml收集一份，共收集15个馏分，lcms分析合并相似组分，得到syq-d30-5s8(8)、syq-d30-5s11(11)；2个馏分经semi-pre-hplc分离得到化合物：syq-d30-5s8p1p1、syq-d30-5s11p1。本发明的上述技术方案的有益效果如下：(1)本发明提取这九种化合物的提取方法，提取效率高，提取纯度高。(2)本发明的所提取的9种化合物能够有效治疗或抑制胰腺癌的化合物。本发明的实施例中通过三叶青的提纯物在抑制胰腺癌方面的实验验证了一种三叶青的提纯物能够抑制胰腺癌，为制备抑制胰腺癌的化疗药物、用于抑制胰腺癌的药物为胰腺癌的化疗药物、治疗药物提供了新的治疗靶点。附图说明图1为本发明的提取流程图；图2为本发明的三叶青所提取的9种化合物的色谱图；图3为本发明的三叶青所提取的化合物syq-d30-1s8p2的肿瘤细胞抑制试验图。图4为本发明的三叶青所提取的化合物syq-d30-2s9p1的肿瘤细胞抑制试验图。图5为本发明的三叶青所提取的化合物syq-d30-3s11p3的肿瘤细胞抑制试验图。图6为本发明的三叶青所提取的化合物syq-d30-1s14p2的肿瘤细胞抑制试验图。图7为本发明的三叶青所提取的化合物syq-d30-4s5p1的肿瘤细胞抑制试验图。图8为本发明的三叶青所提取的化合物syq-d30-4s8p2p1的肿瘤细胞抑制试验图。图9为本发明的三叶青所提取的化合物syq-d30-5s11p1的肿瘤细胞抑制试验图。图10为本发明的三叶青所提取的化合物syq-d30-1s8p4的肿瘤细胞抑制试验图。图11为本发明的三叶青所提取的化合物syq-d30-5s8p1p1的肿瘤细胞抑制试验图。具体实施方式为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。一种三叶青的提纯方法，如图1所示，具体包括以下步骤：s1、三叶青药材提取及检测干燥三叶青药材粉末5kg，用70％乙醇回流提取3次，每次1.5h。提取液经lcms检测；s2、hp-20大孔吸附树脂富集将提取液浓缩至小体积，用10％乙醇超声溶解，经hp-20大孔树脂吸附后，分别用10％、30％、50％、95％乙醇梯度洗脱收集，各部分洗脱液经lcms检测；s3、正相中压柱分离将30％、50％、95％乙醇洗脱液合并，减压浓缩后得到的干燥样品，采用二氯甲烷-甲醇(1:1)溶解，硅胶拌样，正相中压硅胶柱分离，采用二氯甲烷-甲醇体系梯度洗脱(100:0-0:100)，共收集到馏分15份。lcms分析合并相似组分，合并后组分分别为syq-d30-1(1)、syq-d30-2(2)、syq-d30-3(3)、syq-d30-4(4)、syq-d30-5(5～6)、syq-d30-7(7～10)、syq-d30-11(11～15)。取样分析，lcms检测；s4、馏分syq-d30-1(～2.3g)经凝胶柱分离，甲醇体系洗脱，每40ml收集一份，共收集18馏分，lcms分析合并相似组分，得到syq-d30-1s8(8-10)。该馏分经semi-pre-hplc分离得到化合物：syq-d30-1s8p2(30mg,purity:96.20,compound1)、syq-d30-1s8p4(110mg,purity:96.48％,compound8)，分离方法及hplc检测结果如下：分离方法：馏分syq-d30-2(～0.62g)经凝胶柱分离，二氯甲烷-甲醇体系(1:1，v/v)洗脱，每40ml收集一份，共收集10馏分，lcms分析合并相似组分，得到syq-d30-2s9(9-10)。该馏分经semi-pre-hplc分离得到化合物：syq-d30-2s9p1(14mg,purity:98.86％,compound2)，分离方法及hplc检测结果如下：分离方法：仪器gilsongx-281semi-prep-hplcsystem函数phenomenexlunac18(2)250×21.2mm，5μm液体或气体色谱度a:h2ob:acn流速15ml/min显示器波长210nm&220nm梯度20％-40％12min；40％-40％5min柱温室温。馏分syq-d30-3(～1.2g)经凝胶柱分离，甲醇体系洗脱，每40ml收集一份，共收集15个馏分，lcms分析合并相似组分，得到syq-d30-3s11(11-12)、syq-d30-3s14(14-15)。2个馏分经semi-pre-hplc分离得到化合物：syq-d30-3s11p3(55mg,purity:97.69％,compound3)、syq-d30-3s14p2(50mg,purity:97.01％,compound4)，分离方法及hplc检测结果如下：分离方法：(syq-d30-3s11)分离方法：(syq-d30-3s14)仪器gilsongx-281semi-prep-hplcsystem函数phenomenexlunac18(2)250×21.2mm，5μm液体或气体色谱度a:h2ob:acn流速15ml/min显示器波长210nm&220nm梯度10％-35％12min；35％-35％5min柱温室温。馏分syq-d30-4(～3.0g)经凝胶柱分离，甲醇体系洗脱，每40ml收集一份，共收集15个馏分，lcms分析合并相似组分，得到syq-d30-4s5(5)、syq-d30-4s8(7-8)。2个馏分经semi-pre-hplc分离得到化合物：syq-d30-4s5p1(135mg,purity:95.53％,compound5)、syq-d30-4s8p2p1(27mg,purity:99.93％,compound6)，分离方法及hplc检测结果如下：分离方法：(syq-d30-4s5)仪器gilsongx-281semi-prep-hplcsystem函数phenomenexlunac18(2)250×21.2mm，5μm液体或气体色谱度a:h2ob:acn流速15ml/min显示器波长210nm&220nm梯度15％-30％12min；30％-30％5min柱温室温；分离方法：(syq-d30-4s8)仪器gilsongx-281semi-prep-hplcsystem函数phenomenexlunac18100×30.0mm，5μm液体或气体色谱度a:h2ob:meoh流速25ml/min显示器波长210nm&220nm梯度25％-55％12min；55％-55％5min柱温室温；馏分syq-d30-5(～8.5g)经凝胶柱分离，甲醇体系洗脱，每40ml收集一份，共收集15个馏分，lcms分析合并相似组分，得到syq-d30-5s8(8)、syq-d30-5s11(11)。2个馏分经semi-pre-hplc分离得到化合物：syq-d30-5s8p1p1(16mg,purity:98.93％,compound9)、syq-d30-5s11p1(30mg,purity:95.44％,compound7)，分离方法及hplc检测结果如下：分离方法：(syq-d30-5s8)仪器gilsongx-281semi-prep-hplcsystem函数phenomenexlunac18(2)250×21.2mm，5μm液体或气体色谱度a:h2ob:meoh流速15ml/min显示器波长210nm&220nm梯度25％-55％12min；55％-55％5min柱温室温；分离方法：(syq-d30-5s11)通过以上的提取方法提取到syq-d30-1s8p2、syq-d30-2s9p1、syq-d30-3s11p3、syq-d30-3s14p2、syq-d30-4s5p1、syq-d30-4s8p2p1、syq-d30-5s11p1、syq-d30-1s8p4、syq-d30-5s8p1p1化合物，这九种化合物的色谱分析图如图2所示，将以上9种化合物用于肿瘤细胞抑制试验，实验具体包括以下过程：(1)在96孔板中分别种入四种pdac细胞，每孔5×103个细胞；(2)在24小时后细胞贴壁，分别加入三叶青所提取的的9种化合物：syq-d30-1s8p2、syq-d30-2s9p1、syq-d30-3s11p3、syq-d30-3s14p2、syq-d30-4s5p1、syq-d30-4s8p2p1、syq-d30-5s11p1、syq-d30-1s8p4、syq-d30-5s8p1p1；其中syq-d30-2s9p1设置浓度梯度为0、20、50、100、200μm；syq-d30-1s8p2、syq-d30-2s9p1、syq-d30-3s11p3、syq-d30-3s14p2、syq-d30-4s5p1、syq-d30-4s8p2p1、syq-d30-5s11p1、syq-d30-1s8p4、syq-d30-5s8p1p1等8种化合物设置浓度梯度为0、100、200、500、1000μm；(3)三叶青提取物诱导pdac细胞死亡：用细胞计数试剂盒-8(cck-8)测定在规定浓度下处理后的细胞存活率。得到以下的实验结果，如图3-图11所示：syq-d30-1s8p2处理panc-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、0、10.35％±12.79％(t＝0.8093，p＝0.4637)、24.59％±10.99％(t＝2.237，p＝0.0889)；处理bxpc-3，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：27.12％±14.34％(t＝1.891，p＝0.1316)、24.02％±9.847％(t＝4.713，p＝0.0092)、21.55％±9.674％(t＝2.228，p＝0.0898)、46.41％±7.36％(t＝11.39，p＝0.0003)；处理cfpac-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、0、0、0.09％±6.20％(t＝0.01428，p＝0.9893)；处理aspc-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、0、0、0。syq-d30-2s9p1处理panc-1，在20μm、50μm、100μm、200μm浓度下的抑制率分别是：1.98％±7.54％(t＝0.2621，p＝0.8062)、15.88％±9.19％(t＝1.729，p＝0.1588)、49.82％±6.99％(t＝7.125，p＝0.0021)、83.81％±7.36％(t＝11.39，p＝0.0003)；处理bxpc-3，在20μm、50μm、100μm、200μm浓度下的抑制率分别是：8.14％±8.78％(t＝0.9265，p＝0.4066)、0、18.34％±4.30％(t＝4.268，p＝0.0130)、95.07％±2.53％(t＝37.64，p＜0.0001)；处理cfpac-1，在20μm、50μm、100μm、200μm浓度下的抑制率分别是：1.62％±5.66％(t＝0.2855，p＝0.7894)、12.94％±3.57％(t＝3.623，p＝0.0223)、59.64％±2.62％(t＝22.73，p＜0.0001)、94.28％±2.52％(t＝37.46，p＜0.0001)；处理aspc-1，在20μm、50μm、100μm、200μm浓度下的抑制率分别是：0、0、0、16.19％±1.66％(t＝9.75，p＝0.0006)。syq-d30-3s11p3处理panc-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：2.93％±9.99％(t＝0.2932，p＝0.7839)、0、5.80％±12.51％(t＝0.4641，p＝0.6667)、4.28％±12.94％(t＝0.3309，p＝0.7573)；处理bxpc-3，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0.26％±2.52％(t＝0.1039，p＝0.9223)、1.53％±5.10％(t＝0.3012，p＝0.7783)、7.80％±2.39％(t＝3.26，p＝0.0311)、28.36％±2.40％(t＝11.82，p＝0.0003)；处理cfpac-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、0、0、0；处理aspc-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、0、1.15％±2.70％(t＝0.4252，p＝0.6926)、15.28％±1.7％(t＝8.988，p＝0.0008)。syq-d30-3s14p2处理panc-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、8.10％±4.35％(t＝1.86，p＝0.1364)、4.81％±8.36％(t＝0.5757，p＝0.5957)、18.78％±6.75％(t＝2.784，p＝0.0496)；处理bxpc-3，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、8.05％±7.14％(t＝1.129，p＝0.3221)、9.51％±3.14％(t＝3.024，p＝0.0390)、35.34％±2.39％(t＝14.79，p＝0.0001)；处理cfpac-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、9.49％±3.15％(t＝3.017，p＝0.0393)、10.03％±2.27％(t＝4.413，p＝0.0116)、13.15％±2.63％(t＝5.011，p＝0.0074)；处理aspc-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：10.87％±6.09％(t＝1.784，p＝0.1489)、9.33％±5.91％(t＝1.579，p＝0.1894)、11.38％±6.20％(t＝1.836，p＝0.1403)、16.33％±6.02％(t＝2.715，p＝0.0533)。syq-d30-4s5p1处理panc-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、0.19％±3.74％(t＝0.04975，p＝0.9627)、0、0；处理bxpc-3，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、0、3.04％±7.45％(t＝0.4077，p＝0.7044)、8.59％±4.78％(t＝1.798，p＝0.1467)；处理cfpac-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、0、2.51％±2.56％(t＝0.98，p＝0.3826)、2.25％±2.46％(t＝0.9146，p＝0.4121)；处理aspc-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、5.12％±1.72％(t＝2.983，p＝0.0406)、12.44％±4.46％(t＝2.786，p＝0.0495)、12.11％±3.403％(t＝3.56，p＝0.0236)。syq-d30-4s8p2p1处理panc-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0.38％±8.61％(t＝0.04443，p＝0.9667)、4.99％±9.23％(t＝0.5403，p＝0.6177)、5.25％±11.07％(t＝0.4738，p＝0.6604)、27.42％±9.56％(t＝2.869，p＝0.0455)；处理bxpc-3，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、4.23％±7.48％(t＝0.5658，p＝0.6018)、10.62％±5.22％(t＝2.037，p＝0.1113)、14.79％±5.24％(t＝2.825，p＝0.0476)；处理cfpac-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、0、1.45％±8.55％(t＝0.1699，p＝0.8733)、0；处理aspc-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、1.37％±4.75％(t＝0.289，p＝0.7869)、10.74％±2.87％(t＝3.746，p＝0.0200)、10.3％±6.29％(t＝1.64，p＝0.1765)。syq-d30-5s11p1处理panc-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、23.85％±18.27％(t＝1.305，p＝0.2618)、18.96％±17.52％(t＝1.082，p＝0.3401)、29.75％±16.16％(t＝1.841，p＝0.1394)；处理bxpc-3，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、3.84％±7.45％(t＝0.5151，p＝0.6337)、4.43％±9.03％(t＝0.4907，p＝0.6493)、14.13％±7.17％(t＝1.971，p＝0.1200)；处理cfpac-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、13.44％±10.00％(t＝1.345，p＝0.2499)、20.17％±9.52％(t＝2.119，p＝0.1015)、18.97％±9.53％(t＝1.99，p＝0.1174)；处理aspc-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0.08％±10.07％(t＝0.008436，p＝0.9937)、0.29％±8.58％(t＝0.0342，p＝0.9744)、8.67％±7.75％(t＝1.119，p＝0.3256)、13.87％±8.24％(t＝1.684，p＝0.1675)。syq-d30-1s8p4处理panc-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、14.08％±3.23％(t＝4.359，p＝0.0121)、15.68％±5.46％(t＝2.869，p＝0.0455)、17.9％±5.38％(t＝3.325，p＝0.0292)；处理bxpc-3，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、0、3.28％±3.03％(t＝1.081，p＝0.3405)、4.26％±2.70％(t＝1.576，p＝0.1902)；处理cfpac-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、0、0、0；处理aspc-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：4.19％±2.87％(t＝1.464，p＝0.2171)、6.85％±3.82％(t＝1.794，p＝0.1473)、7.14％±4.46％(t＝1.599，p＝0.1851)、7.20％±4.55％(t＝1.583，p＝0.1886)。syq-d30-5s8p1p1处理panc-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：2.26％±9.99％(t＝0.2262，p＝0.8322)、7.30％±9.55％(t＝0.7638，p＝0.4875)、9.49％±10.89％(t＝0.872，p＝0.4324)、26.93％±7.89％(t＝3.416，p＝0.0269)；处理bxpc-3，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：11.9％±2.92％(t＝4.078，p＝0.0151)、24.75％±3.03％(t＝8.168，p＝0.0012)、27.23％±3.76％(t＝7.24，p＝0.0019)、29.72％±4.66％(t＝6.372，p＝0.0031)；处理cfpac-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：0、0、0、7.59％±4.56％(t＝1.666，p＝0.1711)；处理aspc-1，在100μm、200μm、500μm、1000μm浓度下的抑制率分别是：7.52％±2.79％(t＝2.692，p＝0.0545)、9.35％±5.03％(t＝1.86，p＝0.1364)、22.83％±2.41％(t＝9.462，p＝0.0007)、29.91％±3.64％(t＝8.21，p＝0.0012)。可见，所提取的9种化合物能够有效治疗或抑制胰腺癌。本发明的实施例中通过三叶青的提纯物在抑制胰腺癌方面的实验验证了一种三叶青的提纯物能够抑制胰腺癌，为制备抑制胰腺癌的化疗药物、用于抑制胰腺癌的药物为胰腺癌的化疗药物、治疗药物提供了新的治疗靶点。以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12