抗骨质流失的副干酪乳杆菌菌株GMNL-653的组合物的制作方法

本申请为申请号201710742942.0、申请日2017年08月25日、发明名称“副干酪乳杆菌菌株gmnl-653用于制备抗骨质流失的组合物的用途”的分案申请。本发明是有关于一种促进骨质再生的副干酪乳杆菌菌株gmnl-653及其组合物，特别是关于一种具有增加与骨质相关的细胞激素表达、抑制蚀骨相关基因rankl及降低血清中细胞激素il-17a的能力的副干酪乳杆菌菌株gmnl-653及其组合物。
背景技术：
：骨质疏松症为一种全身骨骼疾病，其特征包括骨量减少，骨组织的显微结构变差，造成骨骼脆弱，骨折危险性增高。骨再塑过程中，包括造骨细胞的骨形成作用，以及蚀骨细胞的骨吸收作用，共同维持骨组织的动态平衡，一旦骨吸收超过骨形成，即会导致骨流失，最后引起骨质疏松症。一般而言，骨质疏松症又分成停经后骨质疏松症和老年性骨质疏松症两类。停经后骨质疏松症常见于停经后妇女，由于女性停经后体内雌性素量急遽减少，蚀骨细胞活性增强而吸收骨小梁，最终使骨小梁变细、断折、数目减少、不连续，减弱骨强度；而老年性骨质疏松症为造骨细胞功能衰退，钙和维生素d摄取量不足，肠道吸收功能变差，导致骨合成减少，骨皮质变粗松大孔，骨小梁消失，骨强度明显减低。目前防治骨质疏松及骨折的药物，依其作用机转可分为抗蚀骨或抗流失类药物、促造骨或促骨生成类药物以及混合型三类。抗蚀骨类药物包括钙剂、维他命d、抑钙素、双磷酸盐、雌激素受体调节剂、性激素类、蚀骨细胞酵素抑制剂、rankl单株抗体等，混合型目前只有锶盐一种。防治骨质疏松的药物本身伴随了一些副作用。临床试验结果发现合并使用药物，并无加成效果，反而会互相抵制，或是增加副作用的发生率或强度，所以目前各国各种骨质疏松防治指引，均不建议并用两种抗流失剂，或是并用抗流失剂与促造骨剂。临床上常使用于老人及更年期妇女的骨质疏松药品，如福善美锭、克骨松锭、可骨华锭等双磷酸盐类药品，长期服用若未注意口腔卫生或进行拔牙、植牙手术，恐发生严重颚骨关节坏死；近期研究亦发现，其可能引起非典型股骨骨折的不良反应。过去虽然有部分文献指出某些特定益生菌菌株具有降低卵巢摘除大小鼠的骨质流失的能力，例如：l.reuteriatccpta6475；l.paracaseidsm13434；l.plantarumdsm15312、dsm15313及b.longum等，并发现是经由降低发炎反应的机制以达到延缓骨质流失的能力，但他们都是活菌形式的使用，在使用上易受胃酸、胆盐及抗生素药物的影响，在使用的时间点上限制较多。此外，活菌数目易受保存条件，如温度、湿度等的影响，因此在产品剂型上也较受限制。故，有必要提供一种适合的菌株用于制备抗骨质流失的组合物的用途，以解决现有技术中所存在的问题。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种抗骨质流失的副干酪乳杆菌菌株gmnl-653(lactobacillusparacaseigmnl-653)的组合物，所述副干酪乳杆菌菌株gmnl-653及组合物可通过任何形式进入消化系统内，增加细胞激素tgf-β及il-10的表达，同时可抑制及降低蚀骨相关基因(如rankl)的表现量，降低血清中与骨质流失相关的细胞激素il-17a的含量，因此达成改善骨质流失的问题。为达上述的目的，本发明的一实施例提供一种抗骨质流失的副干酪乳杆菌菌株gmnl-653的组合物，其特征在于，所述组合物包含副乾酪乳桿菌菌株gmnl-653及一载体，其中所述副干酪乳杆菌菌株是副干酪乳杆菌菌株gmnl-653(lactobacillusparacaseigmnl-653)，并以保藏编号m2016226于2016年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc；地址：中国武汉)，所述载体是一药理或生理可接受型态的载体。在本发明的一实施例中，所述副干酪乳杆菌菌株gmnl-653是死菌型态。在本发明的一实施例中，所述副干酪乳杆菌菌株gmnl-653是热杀死菌株。在本发明的一实施例中，所述副干酪乳杆菌菌株gmnl-653具有增加细胞激素il-10(interleukin-10)表达的能力。在本发明的一实施例中，所述副干酪乳杆菌菌株gmnl-653具有增加细胞激素tgf-β表达的能力。在本发明的一实施例中，所述副干酪乳杆菌菌株gmnl-653具有抑制蚀骨相关基因rankl表达的能力。在本发明的一实施例中，所述抗骨质流失的副干酪乳杆菌菌株gmnl-653的组合物是被制成片剂、胶囊、散剂或口服液体制剂。附图说明图1：显示实验2中各组的细胞激素tgf-β的表现量长条图。图2：显示实验2中各组的蚀骨相关基因rankl的表现量长条图。图3：显示实验2中各组的细胞激素il-10的表现量长条图。图4：显示实验3中各组的血清中il-17a的含量长条图。具体实施方式为了让本发明的上述及其他目的、特征、优点能更明显易懂，下文将特举本发明较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。此外，本发明所提到的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括数个引用，除非上下文另有明确规定。数值范围(如10％至11％的a)若无特定说明皆包含上、下限值(即10％≦a≦11％)；数值范围若未界定下限值(如低于0.2％的b，或0.2％以下的b)，则皆指其下限值可能为0(即0％≦b≦0.2％)。上述用语是用以说明及理解本发明，而非用以限制本发明。本发明的一实施例提供一种抗骨质流失的副干酪乳杆菌菌株及其用于制备抗骨质流失的组合物的用途，所述副干酪乳杆菌菌株是副干酪乳杆菌菌株gmnl-653(lactobacillusparacaseigmnl-653)，并以保藏编号m2016226于2016年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc；地址：中国.武汉)。所述副干酪乳杆菌菌株gmnl-653可为活菌菌株或死菌菌株，可例如是热杀死菌株。所述副干酪乳杆菌菌株gmnl-653具有抗发炎能力，且能抑制蚀骨相关基因rankl的表达及细胞激素il-17a(interleukin-17a)的产生。本发明的一实施例提供一种抗骨质流失的组合物，其包含如上所述的副干酪乳杆菌菌株gmnl-653。优选的，所述抗骨质流失的组合物也可以一医药组合物、一营养补充品、一保健食品、一医疗食品或其组合的方式呈现。所述抗骨质流失的组合物可以根据有效性或方便性来考量设计成不同的形态，例如，利用一载体，将所述抗骨质流失的组合物制成片剂、胶囊、散剂或口服液体制剂，然不限于此，也可以制成其他药理或生理可接受的型态。此外，所述抗骨质流失的组合物优选是以食用方式进入消化系统，使得所述副干酪乳杆菌菌株gmnl-653在消化系统内发挥其效果。上述实施例中的所述副干酪乳杆菌菌株gmnl-653主要是从人体肠道筛选分离获得的多个分离株的其中一株。利用表1的引子(seqidno:1及seqidno:2)进行pcr以复制多个分离株各自的16srdna片段，接着将其加以定序，定序完成后得到其中一株的16srdna基因序列如下(seqidno:3)；随后，由ncbi网站比对后的结果可知，所述分离株的16srdna序列与副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)的16srdna序列相似，相似度均为99％以上，故可知此菌株gmnl-653确实属于副干酪乳杆菌。表1、引子序列对照引子序列编号序列pafseqidno:1agagtttgatcctggctcag536rseqidno:2gtattaccgcggctgctg所述副干酪乳杆菌gmnl-653的完整16srdna序列(seqidno:3)如下：cggaggcccctatgatgggcgtcgtacgagttctcgttgatgatcggtgcttgcaccgagattctcatggaacgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccttaagtgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcatagatcctgtaaccgcatggttcttggctgatagatggcgtaagctatcgctgttggatggacccgcggcgtattatctagttggtgaggtagtggctcaccgaggccatgatacgtatccgagctgagaggttgatgggcgagtttgtgactgagacacgtcccaaactactacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttggagaagaatggtcggcagagtaactgttgtcggcgtgacggtatccaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccggggggtaataca对所述副干酪乳杆菌菌株gmnl-653进行酦酵试验，可获得如表2的结果。表2、酦酵试验结果为了验证本发明所提供的所述副干酪乳杆菌菌株gmnl-653具有抗发炎的特性，且能达到抑制骨质流失的目的，进行了以下动物模式的实验。实验1：骨组织分析菌株：副干酪乳杆菌(lactobacillusparacaseigmnl-653)菌株处理：死菌制备：分别自冻管接种副干酪乳杆菌(lactobacillusparacaseigmnl-653)及唾液乳杆菌(lactobacillussalivariusgmnl-678)到1mlmrsbroth，并于37℃有氧下静置培养20小时。次日，取15μl隔夜培养菌液至1.5mlmrsbroth(1％二次活化)，接着于37℃有氧下静置培养20小时，再以od600nm推估菌数，并将菌数调整为4.1×108cfu/ml，并进行121℃高温高压灭菌15分钟备用。骨质疏松小鼠模式：由乐斯科生技公司购入8周龄icr雌鼠，待9周龄时进行去卵巢手术。小鼠在麻醉下，于背部两侧卵巢处切开，进行去卵巢手术；所有组别均在手术后4天开始管喂投予试验物质。小鼠分为假手术组(control组，只打开腹腔，未摘除卵巢)；以及4组去卵巢组(ovariectomy；ovx)。小鼠牺牲时，检查卵巢组织，确认去除卵巢手术是否成功，手术失败的动物，实验结果不采用。4组去卵巢组的小鼠中，取1组为溶媒组(h2o组)，1组为正对照药物组(抗骨质疏松药物alendronate)。alendronate以去离子水配制浓度0.25mg/ml的悬浮液，小鼠每10公克体重投予0.1ml，一周投予4次。其余2组分别管喂gmnl-653死菌0.2ml或gmnl-678死菌0.2ml(死菌浓度为4.1×108cfu/ml；换算小鼠剂量8.2×107cells/mouse，换算人体剂量：2×1010cells/60kg成人)，两组每天各管喂一次，连续28天后，将小鼠麻醉并以腹腔静脉采血牺牲，取出股骨供分析。分析方法：右股骨远心端骨干以微型计算机断层扫描仪(microcomputedtomography；skyscan1076,kontizh,belgium，解析度为18μm)拍摄计算机断层扫描图，并以分析软体分析骨小梁区域的比率，即骨体积与组织体积的比率(bonevolume/tissuevolume)。分析的位置选择生长板下(往近心端)100片的区域，不包含皮质骨。骨矿质密度的分析选择相同区域分别分析不含皮质骨的骨矿质密度。实验所得的数据，均以双尾变异数分析(two-wayanalysisofvariance)，并进行t-test统计分析，所有数据均以平均±标准差(mean±sd)表示；各组与ovx+h2o组相比后经统计分析，以不同符号表示统计上具显著差异(*代表p＜0.05；**代表p＜0.01)。实验1的结果请见表3及表4。表3、骨小梁区域的比率(bv/tv)从表3可看出，小鼠去除卵巢后，造症组(ovx+h2o)的骨小梁区域的比率，即骨体积与组织体积的比率分析，皆显著低于假手术组(control)，表示骨质疏松动物模式造症成功。比较投喂gmnl-653死菌、gmnl-678与药物正对照组，可发现bv/tv分析显著高于造症组，表示gmnl-653、gmnl-678及药物alendronate确实可以减缓卵巢摘除后骨质流失的程度。管喂gmnl-653菌株的这一组，保护效果甚至略优于抗骨质疏松药物alendronate。表4、股骨骨矿质密度(不含皮质骨，bmd)从表4可看出，造症组(ovx+h2o)的右股骨骨矿质密度皆显著低于假手组(control)；而投喂gmnl-653死菌的组别，其骨头密度明显优于造症组(ovx+h2o)，表示管喂gmnl-653可以减缓卵巢摘除后骨质流失的程度，同时也发现了gmnl-653在保护骨质的效果上明显优于管喂gmnl-678。实验2：gmnl-653对蚀骨基因、抗发炎细胞激素的影响萃取胫骨rna：实验结束后将小鼠左股骨取下，将胫骨以剪刀剪成小块，并加入适量的液态氮使骨头迅速进行磨碎；将磨碎的骨粉加入0.5mlreagent进行rna萃取，加入0.1ml氯仿(chloroform)上下翻转15次，并置于室温反应5分钟后离心并将上层提取至新的微量离心管eppendorf中，并加入0.25ml异丙醇，在室温放置10分钟后进行离心；移除上清液，并用0.5ml75％乙醇清洗离心后的沉淀物；吹干上述离心后的沉淀物后加入20-50μl的depc水(diethylpyrocarbonatetreatedwater)回溶，测定rna浓度。rna反转cdna：取1-5μgrna并补无rna酶水(rnase-freewater)至10μl；另外则加入10×ramdonprimer(2μl)，10mmdntp(1μl)，65℃5分钟，冰上2-3分钟；作用完第一阶段后，再加入5×rtbuffer(4μl)，0.1mdtt(1μl)，rna酶抑制剂(rnaseinhibitor，invitrogen,rnaseouttm,1μl)，rt酵素((invitrogen,iii,1μl)，mixrt分钟并置于50℃中60分钟，以及70℃中15分钟，进行反转录酵素的作用。胫骨cdna进行real-timepcr分析：取1μl胫骨cdna加入4μl，1μm的f+rprimers(正向/反向引子序列如下表5所示)、5μl的2xrotor-genesybrgreenpcrmastermix(qiagen,cat.204076)，放入q-pcr机器中进行反应，tgf-β及rankl相对表达量为扣除本身gapdh所得。表5、引子序列tgf-β正向引子seqidno:4gagtaacgctttccggagtctgf-β反向引子seqidno:5acagtcaccagcatctcagcrankl正向引子seqidno:6cgtacctgcggactatcttcarankl反向引子seqidno:7cttggacacctggacgctaail-10正向引子seqidno:8ggttgccaagccttatcggail-10反向引子seqidno:9acctgctccactgccttgctgapdh正向引子seqidno:10gcacagtcaaggccgagaatgapdh反向引子seqidno:11gccttctccatggtggtgaa分析方法：实验所得的数据，均以双尾变异数分析(two-wayanalysisofvariance)，并进行t-test。统计分析各组均与ovx+h2o组相比，*代表p＜0.05；**代表p＜0.01。如图1所示，gmnl-653死菌型态能增加保护骨质流失的细胞激素tgf-β的表现。小鼠去除卵巢后与假手术组相比，抗发炎细胞激素tgf-β表现量明显降低；喂食gmnl-653死菌的组别中，tgf-β表现量与卵巢摘除组(ovx+h2o)相比有明显增加的情形，此结果表示gmnl-653具有促进tgf-β表达的功效，从而延缓骨质流失。接着，如图2所示，去除卵巢后给予gmnl-653死菌的组别，可以明显看出，在小鼠去除卵巢后，造症组(ovx+h2o)与假手术组(control)相比，其蚀骨相关基因rankl表现量有增加的情形；而给予管喂gmnl-653死菌的组别，其蚀骨相关基因rankl的表现量均明显低于造症组(ovx+h2o)，表示gmnl-653具有抑制rankl表达的功效，从而延缓骨质流失。继续参照图3，gmnl-653死菌型态也能增加细胞激素il-10的表现。小鼠去除卵巢后与假手术组相比，抗发炎细胞激素il-10表现量明显降低；喂食gmnl-653死菌的组别，il-10表现量与卵巢摘除组(ovx+h2o)相比有明显增加的情形，此结果表示gmnl-653具有促进il-10表达的功效，从而延缓骨质流失。实验3：gmnl-653对骨松相关的细胞激素il-17a的影响分析方法：将各组试验小鼠麻醉牺牲，收集血液放置室温下30分钟后，以10,000g离心10分钟，收集血清并置于-80℃中分装保存。il-17a分析是以原倍血清进行抗原抗体结合反应，并以biolegend'selisamaxtmdeluxesets分析套组执行实验，实验步骤均遵循原厂说明书，最后以elisareader测定od450nm吸光值，每组均重复二次。分析结果如图4所示，小鼠去除卵巢后，造症组(ovx+h2o)血清中的il-17a含量与假手术组(control)相比有增加的情形；而管喂gmnl-653则显示了血清中的il-17a含量有明显降低。统计分析各组均与ovx+h2o组相比，*代表p＜0.05；**p<0.01。综合上述结果，可以确定副干酪乳杆菌gmnl-653的热杀死菌的形态，在动物实验的骨组织分析(骨小梁区域的比率，bv/tv)、股骨骨矿质密度(bmd)都能显著的减缓卵巢摘除小鼠的骨质流失现象。此外，由于已有文献指出tgf-β在骨生成中的软骨内骨化(intracartilanginousossificationorendochondralossification)过程扮演相当重要的角色，实验中发现tgf-β缺陷鼠则会减少骨生长及骨矿化现象；il-10为体内重要的抗发炎细胞激素，有文献曾指出il-10可能具有间接平衡体内ca2+(calcium)/pi(phosphorous)离子的比例；而促发炎细胞激素il-17则已被证实在雌性激素缺乏的小鼠会协同rankl做为诱导蚀骨前驱细胞或蚀骨细胞的表现并进行多核作用，以促进蚀骨细胞的增生与分化。在啮齿类动物中，雌激素具有抑制il-17所调控的蚀骨细胞分化，而il-17另一方面又会抑制骨母细胞(osteoblast)的形成与矿化。因此本发明提供的含有副干酪乳杆菌gmnl-653的组合物可通过增加与骨质相关的细胞激素tgf-β及il-10的表达、抑制蚀骨基因(rankl)的表达及降低血清中细胞激素il-17a含量的能力，进而达到抑制骨质流失的目的。此外，实验结果也发现使用gmnl-653的组别在保护骨质流失的效果上优于骨质疏松用药alendronate。而目前临床上已发现alendronate具有许多的副作用，包括心脏病、顽固痛症、颚骨坏死、骨折、食道癌等；因此，安全而无副作用的副干酪乳杆菌菌株gmnl-653应用于延缓骨质流失上，应可为未来预防及改善停经后妇女的骨质疏松疾病应是一种更好的选择。本发明已通过上述相关实施例加以描述，然而上述实施例仅为实施本发明的范例。必需指出的是，已公开的实施例并未限制本发明的范围。相反地，包含于权利要求书的精神及范围的修改及均等设置均包括于本发明的范围内。sequencelisting<110>景岳生物科技股份有限公司<120>抗骨质流失的副干酪乳杆菌菌株gmnl-653的组合物<130>tp170229-cn2<160>11<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>pafprimer<400>1agagtttgatcctggctcag20<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>536rprimer<400>2gtattaccgcggctgctg18<210>3<211>523<212>dna<213>人工序列<220><223>sequencingprimer<400>3cggaggcccctatgatgggcgtcgtacgagttctcgttgatgatcggtgcttgcaccgag60attctcatggaacgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccttaagtgg120gggataacatttggaaacagatgctaataccgcatagatcctgtaaccgcatggttcttg180gctgatagatggcgtaagctatcgctgttggatggacccgcggcgtattatctagttggt240gaggtagtggctcaccgaggccatgatacgtatccgagctgagaggttgatgggcgagtt300tgtgactgagacacgtcccaaactactacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatg360gacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggctttcgggtcgtaaaactc420tgttgttggagaagaatggtcggcagagtaactgttgtcggcgtgacggtatccaaccag480aaagccacggctaactacgtgccagcagccggggggtaataca523<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>tgfbetaforwardprimer<400>4gagtaacgctttccggagtc20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>tgfbetareverseprimer<400>5acagtcaccagcatctcagc20<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>ranklforwardprimer<400>6cgtacctgcggactatcttca21<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>ranklreverseprimer<400>7cttggacacctggacgctaa20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>il-10forwardprimer<400>8ggttgccaagccttatcgga20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>il-10reverseprimer<400>9acctgctccactgccttgct20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>gapdhforwardprimer<400>10gcacagtcaaggccgagaat20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>gapdhreverseprimer<400>11gccttctccatggtggtgaa20当前第1页12