秦皮素在制备抗肠炎药物中的应用的制作方法

本发明属于医药领域，尤其涉及一种秦皮素在制备抗肠炎药物中的应用。

技术背景

炎症性肠病(inflammatoryboweldisease，ibd)主要包括溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，uc)和克罗恩病(crohn′sdisease，cd)，是一组以慢性复发性非特异性组织炎症为特征的肠道炎症性疾病，主要表现为长期反复发作的腹痛、腹泻、粘液脓血便。至今其发病机制尚未完全明确，目前普遍认为肠道感染、肠道粘膜屏障受损、肠道粘膜免疫调节异常、遗传和环境等多因素共同参与ibd的发生发展，其中免疫调节异常在ibd的发病中起着重要作用。

其中，溃疡性结肠炎(uc)是一种以结肠粘膜炎症和粘膜下炎症为特征的慢性全身性疾病。其特征是反复腹泻、粘液便或脓液、腹痛等。近年来，由于生活水平的不断提高，随着饮食计划和习惯的改变，疾病的发病率呈逐年上升趋势。而且溃疡性结肠炎难于治愈，康复后易复发，与结肠癌的发病率也有一定关系。

目前炎症性肠病(ibd)的药物治疗主要以5-氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂(6-巯基嘌呤、甲氨蝶吟)和生物制剂(抗肿瘤坏死因子)为主，然而传统的治疗方法存在诸多不足，持续解率低，严重感染的风险高及副作用大使得临床疗效不佳。比如柳氮磺胺吡啶水杨酸制剂是主要治疗炎症性肠病或溃疡性结肠炎的药物。皮质类固醇常用药为强的松或地塞米松，但目前尚无证据表明长期激素维持可防止复发。在急性发作期亦可用氢化考的松或地塞米松静脉滴注，以及每晚用氢化考的松加入生理盐水中作保留灌肠，在急性发作期应用激素治疗的价值是肯定的，但在慢性期是否应持续使用激素则尚有分歧，由于它有一定副作用，故多数不主张长期使用。另外，免疫抑制剂在溃疡性结肠炎中的价值尚属可疑。据rosenberg等报道硫唑嘌呤在疾病恶化时并无控制疾病的作用，而在慢性病例中它却有助于减少皮质类固醇的使用。

秦皮是一种常用的中草药。最早记载于《神农本草经》，来源于秦岭地区的秦皮、小叶秦皮或白蜡的树皮或茎。其主要功效为清热燥湿、平喘止咳、清热明目。临床用于治疗肠炎、白带、慢性支气管炎、细菌性痢疾、牛皮癣等。秦皮的主要化学成分是香豆素，其中秦皮素是主要的香豆素单体。

秦皮素是一种天然香豆素类化合物，被命名为7，8-二羟基-6-甲氧基香豆素。它是一种片状晶体，正常情况下呈淡黄色。秦皮素极易溶于乙醇、甲醇等有机溶剂，但在水中的溶解度较低。作为一味珍贵的中草药，秦皮素有广泛的临床应用，如抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗糖尿病、抗氧化、神经保护作用等。但有关秦皮素的抗肠炎作用鲜见报道。

技术实现要素：

本发明提供一种秦皮素在制备抗结肠炎药物中的应用。

进一步提供在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用。

免疫因素在溃疡性结肠炎的发病原因中占据极其重要的地位。人体内促炎因子与抗炎因子时刻处于动态平衡，它们的失衡能够引发溃疡性结肠炎。抗炎细胞因子如il-4、il-l0参与维持肠道正常的免疫功能；致炎效应细胞(t细胞、nk细胞)产生的促炎细胞因子il-1β、il-6、il-8及tnf-α等可以介导uc发病，它们参与细胞免疫反应，并形成级联放大效应，进而加重肠道炎症反应。此外，uc的发病与细胞的异常凋亡有关。pandiyan等发现调节性t细胞(treg)参与细胞凋亡，它可通过与t细胞竞争细胞因子而导致效应t细胞凋亡。影响uc发病的另一项重要因素是treg/t平衡，当treg/t平衡因treg数量不足或功能异常而遭到破坏时，则可能会诱导或加剧uc的病变。更多研究表明抗中性粒细胞抗体(antineutrophilcytoplasmicantibodies，anc)、细胞黏附分子(cams)均与uc有关。

sod和mda也是溃疡性结肠炎中的关键因子。mda是由细胞膜上的多不饱和脂肪酸通过脂质过氧化反应产生，其含量高低与机体脂质过氧化程度正相关。sod则属于体内消除超氧阴离子的主要抗氧化酶系，其水平常作为临床上观察结肠黏膜损伤水平以及抗炎水平的一个重要指标。

我们研究还发现，crp是人体重要的时相蛋白，在机体发生感染、炎性损伤时迅速升高，因此可以作为判断结肠炎的重要指标。而pge2是典型的炎症介质，在腹泻型肠炎中起着关键作用。

本发明中，秦皮素通过调节多种转录因子的活性，抑制多种炎症因子及趋化因子的表达，减少中性粒细胞浸润，改善肠炎组织损伤及症状。

本发明中，秦皮素对炎症性肠病，尤其是溃疡性结肠炎的治疗效果明显，而且毒副作用小。

附图说明

本发明中图1为各组大鼠血清中il-1β、il-6、tnf-α、crp、peg2和il-10等因子的表达情况(血清理化指标检测结果)。

本发明中图2为各组大鼠结肠组织中的il-1β、il-6、tnf-α、crp、peg2和il-10等因子的表达情况。

本发明中图3表示不同治疗方法大鼠肝脏组织病理学分析。

本发明中图4表示不同治疗方法大鼠结肠组织病理学分析。

(图1-2中，从左至右依次为空白对照组、模型组、阳性组、秦皮素高剂量组、秦皮素中剂量组和秦皮素低剂量组；图3-4中，a：正常对照组；b：模型组；c：阳性对照组；d：秦皮素高剂量组；e：秦皮素中剂量组；f：秦皮素低剂量组)

具体实施方式

实验1

1、实验材料：实验动物60只健康成年sprague-dawley(sd)大鼠(200±20g，雄性)由南京中医药大学附属张家港中医医院动物实验中心提供。

实验主要设备：显微镜(尼康，日本)，市售试剂盒，酶标仪(美国bio-rad公司)

主要实验试剂：

(1)秦皮素：上海福盛生物有限公司

(2)tnbs：美国sigma-aldrichlab&productionmaterials公司

(3)elisa试剂盒：上海钰博生物科技有限公司

2、实验方法：

1)实验动物分组及模型建立

将60只雄性sd大鼠随机分为6组(n＝10)，即a：正常对照组(nc)、b：模型对照组(m)、c：阳性对照组(p)、d：秦皮素高剂量组(f-h，100mg/kg)、e：秦皮素中剂量组(f-m，50mg/kg)、f：秦皮素低剂量组(f-h，25mg/kg)。除nc组不接受tnbs外，其余各组均给予tnbs溶液，并进行为期4周的药物干预。m组禁食24h后麻醉，然后将充分润滑后的直径2mm的橡皮管轻轻插入肛门，深度约8cm。灌肠后(4ml剂量)，给予tnbs50％乙醇溶液(25mg/ml)。随后，一边用手握住肛门，一边慢慢拔出塑料软管。同时将大鼠尾巴抬起，倒置1min，使造模剂完全渗透到大鼠的肠腔内。

2)理化指标测定

将大鼠取血后处死，取结肠和肝脏以便进一步实验。

取结肠和血清进行理化检查。用市售试剂盒检测血清及结肠组织中白细胞介素-1β(il-1β)、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-10(il-10)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、丙二醛(mda)、超氧化物歧化酶(sod、c反应蛋白(crp)、前列腺素e2(peg2)的活性。所有的测量都是按照制造商提供说明书进行。

3)病理组织学检查

处死大鼠后，取结肠和肝脏，用4％多聚甲醛溶液固定。然后，石蜡包埋前用无水乙醇洗涤，5μm切片，苏木精伊红染色。制备的样品在显微镜(尼康，日本)下观察。

3、实验结果与分析

1)秦皮素对大鼠理化指标的影响

为了探讨秦皮素治疗肠炎的可能机制，测定了大鼠血清和结肠中炎症因子的水平。本发明中图1为各组大鼠血清中il-1β、tnf-α、il-6、il-10、crp和peg2等因子的表达情况(从左至右依次为空白对照组、模型组、阳性组、秦皮素高剂量组、秦皮素中剂量组和秦皮素低剂量组)。由图可知，模型组血清中il-1β、il-6、tnf-α、crp、peg2水平高于正常对照组组(p<0.01)，且il-10水平低于正常对照组组(p<0.01)。与模型组相比，不同剂量给药组大鼠血清中il-1β、il-6、tnf-α、crp和peg2含量明显降低，同时il-10含量升高。

本发明中图2为各组大鼠结肠中il-1β、tnf-α、il-6、il-10、crp和peg2等因子的表达情况(从左至右依次为空白对照组、模型组、阳性组、秦皮素高剂量组、秦皮素中剂量组和秦皮素低剂量组)。如图2所示，与空白对照组相比，模型组结肠组织中il-1β，il-6，mda，sod和tnf-α的水平显著升高(p<0.01)，而il-10水平降低(p<0.01)。与模型组相比，不同剂量给药组大鼠结肠组织中的il-10水平显著升高(p<0.01)，而il-1β，il-6，mda，sod和tnf-α的il-10水平明显降低(p<0.01)。且呈剂量依赖性低于游离药物组。结果表明，秦皮素可以显著抑制这些细胞因子的表达。

2)组织病理学分析

本发明中图3表示不同治疗方法大鼠肝脏组织病理学分析(其中a为正常对照组；b为模型组；c为阳性组；d为秦皮素高剂量组；e为秦皮素中剂量组；f为秦皮素低剂量组)。观察各组大鼠肝组织形态学变化，与空白对照组相比，模型组大鼠肝组织有明显的水肿、坏死、变性等病理改变，提示肠炎可能损害了大鼠的肝脏。但给药不同剂量秦皮素组大鼠脏器的组织形态学恢复程度有所不同，表明秦皮素有一定的器官修复效果，且呈剂量依赖性。

本发明中图4表示不同治疗方法大鼠结肠组织病理学分析(其中a为正常对照组；b为模型组；c为阳性组；d为秦皮素高剂量组；e为秦皮素中剂量组；f为秦皮素低剂量组)。观察各组大鼠结肠组织形态学变化，空白对照组结肠粘膜结构完整光滑，粘膜、粘膜下层、肌层、浆膜层边界清晰，细胞形态正常，固有层腺体排列规则，无糜烂和溃疡形成(图4中a)，而模型组有穿壁性炎症和深部溃疡，腺体结构紊乱。同时，随着溃疡愈合的开始，给药不同剂量秦皮素组的炎症程度得到一定程度改善，但表现出纤维组织增生。

本实验中实验模型组大鼠精神萎靡、毛发粗糙、排稀便和血便，其肝脏及结肠组织大体形态及组织学损伤较为严重，elisa试剂盒检测血清和结肠组织中il-1β、il-6、tnf-α、crp、peg2水平较其他组明显升高，而il-10水平明显降低；肝组织有明显的水肿、坏死、变性等病理改变。观其结肠组织，发现模型组有穿壁性炎症和深部溃疡，腺体结构紊乱。给药秦皮素组大鼠经秦皮素治疗后一般情况显著改善、各项指标均明显改善；各组大鼠脏器的组织形态学恢复程度有所不同，但显示出明显改善。同时，随着溃疡愈合的开始，给药不同剂量秦皮素组的炎症程度得到一定程度改善，但表现出一定纤维组织增生。综上所述，秦皮素能够通过改善血清和结肠组织中的炎症因子水平，继而对tnbs诱导的大鼠溃疡性结肠炎有明显的抗炎治疗效果。