一种含EB病毒gHgLgp42蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种含eb病毒ghglgp42蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用。

背景技术：

eb病毒(epstein-barrvirus，ebv)在人群中感染率高达95％，它是许多恶性肿瘤比如鼻咽癌等的重要发病因素。然而至今仍未有上市的ebv预防性或治疗性疫苗。因此亟需研发ebv疫苗以改善ebv相关肿瘤的生存和预后。ebv是包膜病毒，通过自身暴露在外的膜蛋白完全与宿主细胞的膜融合过程以感染细胞。其中参与的膜蛋白不仅包括有融合特性的蛋白gb，也包括gp42、gp350、ghgl等直接或间接与宿主细胞受体相互作用的辅助蛋白。机体能针对这些膜蛋白产生相应的中和抗体，进而减少ebv对细胞的感染。

研究表明，ghgl通过gp42与b细胞的hlaii分子结合，并最终触发gb的构象转换，开始膜融合。因此，ghgl/gp42组合的纳米颗粒有望阻断b细胞的ebv感染。目前认为感染的b细胞可能是上皮细胞感染之前ebv的中转站或贮存点，若能消除ebv在b细胞的感染，极有可能利于减少甚至消除ebv从b细胞到上皮细胞的扩散感染。

技术实现要素：

为了克服现有技术所存在的不足，本发明的第一方面的目的，在于提供一种含ghglgp42蛋白的自组装纳米颗粒。

本发明的第二个方面的目的，在于提供一种含ghglgp42蛋白的自组装纳米颗粒的制备方法。

本发明的第三个方面的目的，在于提供上述自组装纳米颗粒在制备预防eb病毒感染的药品中的应用。

本发明的第四个方面的目的，在于提供上述一种包含上述自组装纳米颗粒的疫苗。

本发明的第五方面的目的，在于提供上述自组装纳米颗粒在制备治疗eb病毒感染所引起的疾病的药品中的应用。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种含ghglgp42蛋白的自组装纳米颗粒，包含第一纳米颗粒亚基和第二纳米颗粒亚基；所述第一纳米颗粒亚基包含第一多肽和第二多肽；所述第二纳米颗粒亚基包含第二多肽；所述第一多肽包含ghgl蛋白和第一载体亚基，所述第二多肽包含gp42蛋白，所述第三多肽包含第二载体亚基；所述第一载体亚基为i53-50a1，所述第二载体亚基为i53-50b.4pt1；所述ghgl蛋白与第一载体亚基通过铰链连接，可以使得组装后的纳米颗粒外展示ghgl蛋白，更好地激发机体的免疫反应。

优选的，所述铰链包含柔性序列和刚性接头，铰链用于ghgl蛋白与载体蛋白(载体蛋白由第一载体亚基和第二载体亚基组成)的连接，不影响ghgl蛋白的免疫原性以及蛋白的正确折叠。

优选的，所述柔性序列为含5～9个氨基酸的多肽；进一步为seqidno：12～seqidno：16中任一种的多肽；更进一步为如seqidno：15所示的多肽。

优选的，所述刚性接头的氨基酸序列为ekaakaeeaa(seqidno：31)。

优选的，所述第一多肽与所述第二多肽通过非共价相互作用形成异源二聚体的稳定结构；进一步的，所述第一多肽中的ghgl蛋白与所述第二多肽中的gp42蛋白通过非共价相互作用形成异源二聚体的稳定结构。

优选的，所述第一多肽与所述第三多肽以非共价相互作用自组装形成纳米结构；进一步的，所述第一多肽中的第一载体亚基与所述第三多肽中的第二载体亚基以非共价相互作用自组装形成纳米结构；所述第一载体亚基包覆于所述第二载体亚基的表面，所述ghglgp42异源二聚体展示在纳米结构表面。

优选的，所述ghgl蛋白包含gh蛋白和gl蛋白。

优选的，所述gh蛋白的氨基酸序列如seqidno：28所示，所述gl蛋白的氨基酸序列如seqidno：29所示。

优选的，所述ghgl蛋白还包含链接序列，所述链接序列用于连接gh蛋白和gl蛋白。

所述链接序列的氨基酸序列如seqidno：30所示。

优选的，所述gp42蛋白的氨基酸序列如seqidno：39所示。

优选的，所述i53-50a1的氨基酸序列如seqidno：26所示。

优选的，所述i53-50b.4pt1的氨基酸序列如seqidno：27所示。

优选的，所述第一多肽还包含稳定蛋白。

优选的，所述稳定蛋白位于铰链与ghgl蛋白之间。

优选的，所述稳定蛋白为t4噬菌体纤维蛋白原(t4fibritin)(seqidno：32)或gcn4肽段(seqidno：33)；进一步为t4噬菌体纤维蛋白原。

优选的，所述第一纳米颗粒亚基为第一纳米颗粒亚基三聚体。

优选的，所述第二纳米颗粒亚基为第二纳米颗粒亚基五聚体。

优选的，所述第一纳米颗粒亚基三聚体的拷贝数为18～22，所述第二纳米颗粒亚基五聚体的拷贝数为10～14；进一步优选的，所述第一纳米颗粒亚基三聚体的拷贝数为20，所述第二纳米颗粒亚基五聚体的拷贝数为12。

优选的，所述含ghglgp42蛋白的自组装纳米颗粒具有20面体对称性。

本发明的第二个方面，提供一种含ghglgp42蛋白的自组装纳米颗粒的制备方法，将第一纳米颗粒亚基与第二纳米颗粒亚基孵育，得到；所述第一纳米颗粒亚基包含第一多肽和第二多肽；所述第二纳米颗粒亚基包含第二多肽；所述第一多肽包含ghgl蛋白和第一载体亚基，所述第二多肽包含gp42蛋白，所述第三多肽包含第二载体亚基；所述第一载体亚基为i53-50a1，所述第二载体亚基为i53-50b.4pt1；所述ghgl蛋白与第一载体亚基通过铰链连接，可以使得组装后的纳米颗粒外展示ghgl蛋白，更好地激发机体的免疫反应。

优选的，所述i53-50a1的氨基酸序列如seqidno：26所示。

优选的，所述i53-50b.4pt1的氨基酸序列如seqidno：27所示。

优选的，所述第一纳米颗粒亚基和第二纳米颗粒亚基的摩尔比为1:(3～6)；进一步为1:5。

优选的，所述孵育的条件为在组装缓冲液中孵育0.5～2h。

优选的，所述组装缓冲液的组成为250mmnacl,50mmtris-hclph8.0,5％甘油(质量分数)。

优选的，所述ghgl蛋白包含gh蛋白和gl蛋白。

优选的，所述gh蛋白的氨基酸序列如seqidno：28所示，所述gl蛋白的氨基酸序列如seqidno：29所示。

优选的，所述ghgl蛋白还包含链接序列，所述链接序列用于连接gh蛋白和gl蛋白。

优选的，所述链接序列的氨基酸序列如seqidno：30所示。

优选的，所述gp42蛋白的氨基酸序列如seqidno：39所示。

优选的，所述铰链包含柔性序列和刚性接头，铰链用于ghgl蛋白与载体蛋白(载体蛋白由第一载体亚基和第二载体亚基组成)的连接，不影响ghgl蛋白的免疫原性以及蛋白的正确折叠。

优选的，所述柔性序列为含5～9个氨基酸的多肽；进一步为seqidno：12～seqidno：16中任一种的多肽；更进一步为如seqidno：15所示的多肽。

优选的，所述刚性接头的氨基酸序列为ekaakaeeaa(seqidno：31)。

优选的，所述第一多肽还包含稳定蛋白。

优选的，所述稳定蛋白位于铰链与ghgl蛋白之间。

所述稳定蛋白优选为t4噬菌体纤维蛋白原(t4fibritin)(seqidno：32)或gcn4肽段(seqidno：33)；更优选为t4噬菌体纤维蛋白原。

优选的，所述第一多肽、第二多肽和第三多肽还包含纯化标签。

所述纯化标签优选为组氨酸标签(his标签)，链霉亲和素标签(strep标签)和麦芽糖结合蛋白(mbp)中的至少一种；更优选为组氨酸标签(his标签)；最优选为氨基酸序列如seqidno：34或seqidno：35所示的组氨酸标签。

优选的，所述第一多肽的纯化标签位于稳定蛋白和铰链之间。

优选的，所述第一多肽还包含连接序列。

优选的，所述连接序列位于稳定蛋白和纯化标签之间。

优选的，所述连接序列如seqidno：40所示。

优选的，所述第二多肽的纯化标签位于gp42蛋白的末端。

优选的，所述第三多肽的纯化标签位于第二载体亚基的末端。

所述第一多肽还含有信号肽，使目的蛋白在表达后能够分泌至上清。

所述信号肽选自cd5信号肽(seqidno：36)。

所述第一纳米颗粒亚基优选通过如下方式获得：将表达第一多肽的核酸和表达第二多肽的核酸共同引入第一宿主细胞；孵育第一宿主细胞表达第一纳米颗粒亚基。

所述第一宿主细胞优选为真核细胞；更优选为人类胚胎肾293细胞(hek293f)，犬肾细胞(madin-dabycaninekidneycells,mdck)，非洲绿猴(chlorocebussabaeus)肾细胞(vero)，sf9(spodopterafrugiperda9)细胞，highfive细胞、cho(chinesehamsterovary，中国仓鼠卵巢)细胞和酵母细胞中的至少一种；最优选为人类胚胎肾293细胞。

所述第二纳米颗粒亚基优选通过如下方式获得：将表达第三多肽的核酸引入第二宿主细胞；孵育第二宿主细胞表达第二纳米颗粒亚基。

所述第二宿主细胞优选为原核细胞；更优选为大肠杆菌；最优选为rosetta(de3)。

本发明的第三个方面，提供第一方面的自组装纳米颗粒在制备预防eb病毒感染的药品中的应用。

本发明的第四个方面，提供一种包含第一方面的自组装纳米颗粒的疫苗。

一种疫苗，包含上述含ghglgp42蛋白的自组装纳米颗粒。

所述疫苗还包括佐剂。

所述佐剂优选为铝佐剂，油乳佐剂如水包油、油包水、双向型乳液，微生物来源类佐剂如肽聚糖(pg)、革兰氏阴性菌外膜脂多糖(lipopolysccharide,lps)、分枝杆菌及其组份、gpg寡核苷酸(gpgodn)、霍乱毒素(choleratoxin,ct))，微粒抗原递送体系如脂质体、聚合微球体、惰性纳米微球、纳米铝佐剂、免疫刺激复合物(immunostimulatingcomples,is-com)、细胞因子，多糖类如菊粉(mpi)，天然来源类如蜂胶(propolis)、皂苷(sapoin)中的至少一种；更优选为mf59佐剂。

本发明的第五方面，提供第一方面的自组装纳米颗粒在制备治疗eb病毒感染所引起的疾病的药品中的应用。

所述疾病优选为传染性疾病、恶性肿瘤、慢性疾病和自身性免疫疾病中的至少一种；更优选为单核细胞增多症、鼻咽癌、胃癌、上皮细胞性肿瘤、burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性疲劳综合征、多发性硬化和强直性脊髓炎中的至少一种。

所述药品还包括药学上可接受的载体。

本发明的有益效果是：

本发明提供的自组装纳米颗粒首次将eb病毒的ghglgp42蛋白展示在纳米颗粒表面，其粒径较抗原(ghgl、gp42)大，具有更好的抗原驻留体积，热稳定与抗原(ghgl、gp42)相当，同时其展示的ghglgp42数量更多能够更强地刺激b细胞，并且能够诱导更高的抗体滴度，可用于预防eb病毒感染及治疗eb病毒感染所引起的疾病。

本发明提供的自组装纳米颗粒，虽然引入了异源基因，但其由于是来源于细菌的蛋白，避免了引起自身免疫疾病，具有安全性高的优势，且不影响免疫效果。

附图说明

图1是ghglgp42-i53-50a1、ghglgp42-i53-50np的结构示意图：其中，a为ghglgp42-i53-50a1三聚体结构拟合图：可观察其并未发现蛋白链的显著冲突；b为ghglgp42-i53-50np纳米颗粒的结构示意图：其是通过输出结构与i53-50anp(pdbid:6p6f)进行蛋白结构拟合后的结果。

图2是自组装纳米颗粒的sds-page电泳的考马斯亮蓝染色图。

图3是ghgl、gp42、ghglgp42-i53-50a1和ghglgp42-i53-50np自组装纳米颗粒的分子筛色谱图。

图4是ghgl、gp42、ghglgp42-i53-50a1和ghglgp42-i53-50np自组装纳米颗粒的动态光散射结果图。

图5是ghglgp42-i53-50np自组装纳米颗粒的负染电镜图：其中，a为ghglgp42-i53-50np自组装纳米颗粒在200nm分辨率下的负染电镜图；b为ghglgp42-i53-50np自组装纳米颗粒在100nm分辨率下的负染电镜图。

图6是ghgl、gp42、ghglgp42-i53-50a1和ghglgp42-i53-50np自组装纳米颗粒的内在荧光扫描结果图。

图7是小鼠免疫后血清ghgl和gp42的总抗滴度图：a为免疫二周后血清ghgl和gp42的总抗滴度图；b为免疫五周后血清ghgl和gp42的总抗滴度图；图中，**表示p<0.001；*表示p<0.005。

具体实施方式

以下结合具体的实施例及附图对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

本申请的纳米颗粒疫苗制备方法包括以下：

a.通过rosetta等计算机辅助设计，确定ghgl与三聚体稳定蛋白融合相容性，并根据结果设计表达序列。

b.通过第一宿主细胞，利用瞬时转染技术将真核表达载体转入第一细胞中表达，获得ghglgp42-i53-50a1的纳米颗粒亚基(第一纳米颗粒亚基)，同时利用第二宿主细胞，转化另一个i53-50b.4pt1的表达质粒，在iptg诱导后表达获得i53-50b.4pt1这另一纳米颗粒亚基(第二纳米颗粒亚基)，两种蛋白通过亲和层级以及分子排阻色谱进行进一步纯化后经过sds-page凝胶电泳鉴定确定纯度。

c.在组装缓冲液中按一定比例加入ghglgp42-i53-50a1及i53-50b.4pt1亚基，在室温下孵育，利用分子排阻色谱分离组装成功的纳米颗粒，并利用负染电镜、动态光散射和差示扫描荧光确定蛋白的粒径分布和稳定性。

d.将纳米颗粒与佐剂进行混匀，通过balb/c小鼠进行免疫，验证小鼠产生针对ghglgp42的抗体水平。

以下进一步具体阐述本申请的纳米颗粒疫苗的。

实施例1铰链(linker)设计

通过rosetta等计算机软件辅助设计，利用rosettaremodel软件进行结构域插入设计(domaininsertiondesign)，将三聚体稳定化蛋白与ghgl抗原(seqidno：1)进行结构对接，从而判断其是否需要插入铰链(linker)，最后利用pymol进行结构可视化进行目测判断，最终选择如下铰链：铰链由柔性序列和刚性接头组成，不同铰链的区别仅在于柔性序列的不同，不同铰链的柔性序列的氨基酸序列和核苷酸序列如表1所示，刚性接头的氨基酸序列如seqidno：31所示，核苷酸序列如seqidno：17所示。

设计采用的软件：

rosettaremodel:https://www.rosettacommons.org/docs/latest/application_documentation/design/rosettaremodel；

pymolopen-source:https://github.com/schrodinger/pymol-open-source。

实施例2重组载体的构建和蛋白表达

1.实验材料

(1)表达载体：真核表达载体：pcdna3.1(+)(thermofisher)，原核表达载体：pet28a(+)(thermofisher)，大肠杆菌感受态细胞dh5α(tiangen)。

(2)表达系统：真核表达系统细胞hek293f(atcc)，改造大肠杆菌细胞rosetta(de3)(tiangen)。

(3)试剂与耗材：pcr酶(genestar)，重组酶(vazyme)，限制性核酸内切酶(neb)，胶回收试剂(genestar)，质粒中提试剂盒(mn)细胞转染试剂pei(polyscience),293f培养基(union)，tb培养基(翔博生物)，组氨酸标签蛋白纯化琼脂糖珠(roche)，等其他常规试剂以及耗材均为商品化购买所得。

(4)基因：eb病毒(m81毒株)的gh基因、gl基因、gp42基因以及基于细菌蛋白优化的i53-50a1/i53-50b颗粒亚单位基因均通过南京金斯瑞生物有限公司optimumgenetm密码子平台优化和合成。

2.铰链的筛选

我们尝试了不同铰链(linker)，铰链由柔性序列和刚性接头组成，不同铰链的区别仅在于柔性序列的不同，同样构建了表达载体转染表达后，通过最后纯化浓缩测定蛋白浓度，具体步骤如下：(1)通过pcr扩增、酶切重组方法将eb病毒gh基因(seqidno：2)、链接序列(seqidno：3)、gl基因(seqidno：4)、t4fibritin(seqidno：5)、i53-50a1(seqidno：6)及铰链(不同铰链的柔性序列的氨基酸序列和核苷酸序列如表1所示，刚性接头的核苷酸序列如seqidno：17所示)插入到载体pcdna3.1(+)中，而其前端带有cd5信号肽(seqidno：18)用于使表达的多肽分泌到细胞外，t4fibritin与铰链之间有8个组氨酸的组氨酸标签(seqidno：19)方便纯化，组氨酸标签前端接有连接序列(seqidno：20)，最终得到的表达载体表达的目的基因ghgl-i53-50a1；(2)将重组载体于pcdna3.1的基因转化至dh5α感受态细菌中，利用氨苄抗性筛选阳性克隆，随后将阳性克隆挑入含0.1％氨苄(0.1mg/ml)的tb培养基中扩大，随后利用中提试剂盒进行抽提，具体方法见产品说明书；(3)将293f细胞置于293f培养基(union)中悬浮培养扩增，待扩大到一定数量后准备进行瞬时转染，稀释细胞至1l密度为1*10⁶/ml，随后用新鲜培养基配置1mgpcdna3.1-目标蛋白载体5mgpei的转染体系，静置30min后加入到稀释后的293f细胞中，在37℃、30％湿度、5％co2浓度以及120rpm震荡培养7天，随后通过离心去除细胞沉淀，上清用0.22μm滤膜过滤，进行蛋白亲和层析和分子筛纯化得到高纯度目的蛋白ghgl-i53-50a1亚单位。结果如表1所示：铰链的柔性序列为ggsggsgs(seqidno：15)时，ghgl-i53-50a1亚单位产量最高。

表1不同柔性序列的铰链(linker)的载体的蛋白产量

3.自组装纳米颗粒的制备步骤

(1)通过pcr扩增、酶切重组方法将eb病毒gh基因(seqidno：2)、链接序列(seqidno：3)、gl基因(seqidno：4)、t4fibritin(seqidno：5)、i53-50a1(seqidno：6)及铰链(铰链的柔性序列的核苷酸序列如seqidno：10所示，刚性接头的核苷酸序列如seqidno：17所示)插入到载体pcdna3.1(+)中，而其前端带有cd5信号肽(seqidno：18)用于使表达的多肽分泌到细胞外，t4fibritin与铰链之间有8个组氨酸的组氨酸标签(seqidno：19)方便纯化，组氨酸标签前端接有连接序列(seqidno：20)，最终得到的表达载体表达的目的基因ghgl-i53-50a1(seqidno：21)；同时，通过pcr扩增、酶切重组方法将eb病毒gp42基因(seqidno：37)插入到pcdna3.1(+)载体中，其前端带有cd5信号肽(seqidno：18)用于使表达的多肽分泌到细胞外，末端带有6个组氨酸的组氨酸(seqidno:23)标签便于纯化。而i53-50b.4pt1(seqidno:22)则在合成中直接插入到pet28a(+)载体中，并且其尾端带有6个组氨酸的组氨酸(seqidno:23)标签便于纯化，通过测序比对后选择成功构建的载体进行下一步的实验。

(2)将重组载体于pcdna3.1的基因转化至dh5α感受态细菌中，利用氨苄抗性筛选阳性克隆，随后将阳性克隆挑入含0.1％氨苄(0.1mg/ml)的tb培养基中扩大，随后利用中提试剂盒进行抽提，具体方法见产品说明书。

(3)将重组载体于pet28a(+)的基因转化至rosetta(de3)感受态细菌中，利用卡那霉素抗性筛选阳性克隆，随后将阳性克隆挑入含0.1％卡那霉素(0.03g/ml)的tb培养基中扩大，随后利用锥形瓶进一步扩大到1l培养，并加入卡那霉素和氯霉素用于筛选阳性细胞，在18℃加入0.2mm化学诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(iptg)诱导目的蛋白表达，经过20h诱导，收集菌体，高压破碎，离心取上清和0.22μm过滤，进行蛋白亲和层析和分子筛纯化得到高纯度的带组氨酸标签的第二纳米颗粒亚基(i53-50b.4pt1亚单位(seqidno：24))。

(4)将293f细胞置于293f培养基(union)中悬浮培养扩增，待扩大到一定数量后准备进行瞬时转染，稀释细胞至1l密度为1*10⁶/ml，随后用新鲜培养基配置1mgpcdna3.1-目标蛋白载体(其中包括0.75mgghgl-i53-50a1表达载体以及0.25mggp42表达载体)+5mgpei的转染体系，静置30min后加入到稀释后的293f细胞中，在37℃、80％湿度、5％co2浓度以及120rpm震荡培养7天，随后通过离心去除细胞沉淀，上清用0.22μm滤膜过滤，进行蛋白亲和层析和分子筛纯化得到高纯度的带组氨酸标签的第一纳米颗粒亚基(包含带组氨酸标签的ghgl-i53-50a1亚单位(seqidno：25)和带组氨酸标签的gp42蛋白亚单位(seqidno：38)，即ghglgp42-i53-50a1)，ghglgp42-i53-50a1的结构示意图如图1所示。

(5)将两带组氨酸标签的纳米颗粒亚基(ghglgp42-i53-50a1和i53-50b.4pt1)按1：5的摩尔比例加入到组装缓冲液(250mmnacl,50mmtris-hclph8.0,5％甘油(质量分数)中，常温孵育1小时后利用分子筛分离组装好的纳米颗粒(ghglgp42-i53-50np)，ghglgp42-i53-50np的结构示意图如图1所示。

4.结果

如图2、3所示，图2为纳米颗粒的sds-page电泳的考马斯亮蓝染色的结果：从左到右显示了ghgl抗原蛋白(seqidno：41，制备方法同第3点中ghglgp42-i53-50a1第一纳米颗粒亚基制备过程，区别在于：步骤(1)中载体pcdna3.1(+)中不包含t4fibritin(seqidno：5)、i53-50a1(seqidno：6)、连接序列(seqidno：20)及铰链(铰链的柔性序列的核苷酸序列如seqidno：10所示，刚性接头的核苷酸序列如seqidno：17所示)，同时也未导入gp42表达载体)、i53-50b.4pt1亚单位(制备方法同第3点中i53-50b.4pt1亚单位制备过程)、gp42抗原蛋白亚单位(seqidno：38)(制备方法同第3点中ghglgp42-i53-50a1第一纳米颗粒亚基制备过程，区别在于：未导入ghgl-i53-50a1表达载体))、第一纳米颗粒亚基(ghglgp42-i53-50a1(制备方法同第3点中ghglgp42-i53-50a1第一纳米颗粒亚基制备过程))以及第3点得到的ghglgp42-i53-50np自组装纳米颗粒；图3为纳米颗粒的分子筛色谱图：可以看出，重组载体构建成功，并且能获得高纯度的纳米颗粒蛋白(ghglgp42-i53-50np)；ghglgp42-i53-50a1比ghgl和gp42分子质量要大。

实施例3检测纳米颗粒的结构特征和化学稳定性

1.实验材料

(1)unchaineduncle高通量蛋白质稳定性分析仪(unchainedlabs)。

(2)120kv透射电镜(fei)。

2.实验步骤

(1)检测纳米颗粒的粒径分布

首先将实施例2中ghglgp42自组装纳米颗粒(ghglgp42-i53-50np)、第一纳米颗粒亚基(ghglgp42-i53-50a1)、抗原(ghgl和gp42)稀释至0.5mg/ml，加入200ul样品至uncle专用的加样槽中，静置5min后，使用unchained公司的uncle仪器进行纳米颗粒粒径的检测。

(2)检测纳米颗粒的结构特征

稀释实施例2中ghglgp42自组装纳米颗粒(ghglgp42-i53-50np)浓度为0.1mg/ml，将蛋白孵育在碳涂层铜网格上，然后与2％乙酸铀孵育染色2min，风干。随后利用120kv透射电镜观察颗粒的大小和形态。

(3)检测纳米颗粒的热稳定性

首先将实施例2中ghglgp42自组装纳米颗粒(ghglgp42-i53-50np)、第一纳米颗粒亚基ghglgp42-i53-50a1、抗原(ghgl和gp42)稀释至0.5mg/ml，随后我们使用unchained公司的uncle仪器从25℃到90℃进行升温扫描，记录其全波长广谱偏移(bcm)的变化。

3.实验结果

如图4所示，ghglgp42自组装纳米颗粒(ghglgp42-i53-50np)具有较均一的粒径分布特征，且其粒径显著大于第一纳米颗粒亚基ghglgp42-i53-50a1以及抗原(ghgl和gp42)，说明了已经组装成为纳米颗粒。

如图5所示，负染电镜下可以看到ghglgp42-i53-50np具有较好的均一性，且ghgl-i53-50np的颗粒表面有明显的外部的突起，说明ghglgp42成功展示在了纳米颗粒载体表面。

如图6所示，图6展示了gp42、ghgl、ghglgp42-i53-50a1、ghglgp42-i53-50np的差示荧光扫描结果，三者随着温度从25℃上升至95℃，其bcm偏移相近，证实了该改造对ghglgp42本身蛋白的稳定性无显著影响，同时由于ghglgp42-i53-50np具有纳米颗粒的特征，其发生荧光改变的斜率也较ghgl和gp42小。

实施例4纳米颗粒蛋白的动物免疫原性

1.实验材料

(1)小鼠：雌性6～8周的balb/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)。

(2)佐剂：mf59佐剂{0.5％(v/v)tween80，0.5％(v/v)span85，4.3％(v/v)角鲨烯，10nm柠檬酸钠缓冲液}。

(3)其他试剂耗材均为商品化常规试剂耗材。

2.实验步骤

(1)将2ug空载的纳米载体(empty-np，即i53-50anp，制备方法同实施例2中第3点，区别仅在于：不含gh基因(seqidno：2)、链接序列(seqidno：3)、gl基因(seqidno：4)、t4fibritin(seqidno：5)、)、铰链、连接序列(seqidno：20))、2ugeb病毒gp42蛋白(seqidno：38，制备方法同实施例2中第3点中ghglgp42-i53-50a1亚基制备过程，区别在于：未导入ghgl-i53-50a1表达载体)、2ugeb病毒ghglgp42蛋白(制备方法同实施例2中第3点中ghglgp42-i53-50a1亚基制备过程，区别在于：步骤(1)中载体pcdna3.1(+)中不包含t4fibritin(seqidno：5)、i53-50a1(seqidno：6)及铰链(铰链的柔性序列的核苷酸序列如seqidno：10所示，刚性接头的核苷酸序列如seqidno：17所示))、以及含等摩尔质量ghglgp42的ghglgp42纳米颗粒(实施例2中的ghglgp42-i53-50np)，分别与上述mf59佐剂混合，即将佐剂与抗原按质量比1：1的混合，在4℃摇晃孵育过夜，经皮下免疫的方式免疫小鼠。

(2)在免疫之后的第三周再进行一次免疫，在免疫后第二周以及第五周采集小鼠眼眶血分离收集血清，通过间接酶联免疫吸附试验检测小鼠血清ghgl和gp42的总抗滴度。

3.实验结果

如图7所示，在第2周和第5周的血清抗体滴度检测中，ghglgp42自组装纳米颗粒(ghglgp42-i53-50np)诱导的血清总抗体滴度相对于单体gp42以及ghglgp42来说均要更高，证实了ghglgp42纳米颗粒能够诱导更强的抗体产生。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>中山大学

中山大学肿瘤防治中心(中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究

所)

<120>一种含eb病毒ghglgp42蛋白的自组装纳米颗粒及其制备方法与应用

<130>

<160>41

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>789

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

trpalatyrprocyscyshisvalthrglnleuargalaglnhisleu

151015

leualaleugluasnileseraspiletyrleuvalserasnglnthr

202530

cysaspglypheserleualaserleuasnserprolysasnglyser

354045

asnglnleuvalileserargcysalaasnglyleuasnvalvalser

505560

phepheileserileleulysargserserseralaleuthrserhis

65707580

leuarggluleuleuthrthrleugluserleutyrglyserpheser

859095

valgluaspleupheglyalaasnleuasnargtyralatrphisarg

100105110

glyglyglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglygly

115120125

serserleusergluvallysleuhisleuaspilegluglyhisala

130135140

serhistyrthrileprotrpthrgluleumetalalysvalprogly

145150155160

leuserproglualaleutrpargglualaasnvalthrgluaspleu

165170175

alasermetleuasnargtyrlysleuiletyrlysthrserglythr

180185190

leuglyilealaleualagluprovalaspileproalavalserglu

195200205

glysermetglnvalaspalaserlysvalhisproglyvalileser

210215220

glyleuasnserproalacysmetleuseralaproleuglulysgln

225230235240

leuphetyrtyrileglythrmetleuproasnthrargprohisser

245250255

tyrvalphetyrglnleuargcyshisleusertyrvalalaleuser

260265270

ileasnglyasplyspheglntyrthrglyalametthrserlysphe

275280285

leumetglythrtyrlysargvalthrglulysglyaspgluhisval

290295300

leuserleuilepheglylysthrlysaspleuproaspleuarggly

305310315320

prophesertyrproserleuthrseralaglnserglyasptyrser

325330335

leuvalilevalthrthrphevalhistyralaasnphehisasntyr

340345350

phevalproasnleulysaspmetpheserargalavalthrmetthr

355360365

alaalasertyralaargtyrvalleuglnlysleuvalleuleuglu

370375380

metlysglyglycysarggluprogluleuaspthrgluthrleuthr

385390395400

thrmetphegluvalservalalaphephelysvalglyhisalaval

405410415

glygluthrglyasnglycysvalaspleuargtrpleualalysser

420425430

phephegluleuthrvalleulysaspileileglyilecystyrgly

435440445

alathrvallysglymetglnsertyrglyleugluargleualaala

450455460

metleumetalathrvallysmetglugluleuglyhisleuthrthr

465470475480

glulysglnglutyralaleuargleualathrvalglytyrprolys

485490495

alaglyvaltyrserglyleuileglyglyalathrservalleuleu

500505510

seralatyrasnarghisproleupheglnproleuhisthrvalmet

515520525

arggluthrleupheileglyserhisvalvalleuarggluleuarg

530535540

leuasnvalthrthrglnglyproasnleualaleutyrglnleuleu

545550555560

serthralaleucysseralaleugluileglygluvalleuarggly

565570575

leualaleuglythrgluserglyleupheserprocystyrleuser

580585590

leuargpheaspleuthrargasplysleuleusermetalaprogln

595600605

glualametleuaspglnalaalavalserasnalavalaspglyphe

610615620

leuglyargleuserleugluarggluaspargaspalatrphisleu

625630635640

proalatyrlyscysvalaspargleuasplysvalleumetileile

645650655

proleuileasnvalthrpheileileserserasparggluvalarg

660665670

glyseralaleutyrglualaserthrthrtyrleuserserserleu

675680685

pheleuserprovalilemetasnlyscysserglnglyalavalala

690695700

glygluproargglnileprolysileglnasnphethrargthrgln

705710715720

lyssercysilephecysglyphealaleuleusertyraspglulys

725730735

gluglyleugluthrthrthrtyrilethrserglngluvalglnasn

740745750

serileleuserserasntyrpheasppheaspasnleuhisvalhis

755760765

tyrleuleuleuthrthrasnglythrvalmetgluilealaglyleu

770775780

tyrglugluargala

785

<210>2

<211>342

<212>dna

<213>epstein-barrvirus

<400>2

tgggcatatccatgctgtcacgtgacccagctgagggcacagcacctgctggccctggag60

aatatctctgacatctacctggtgagcaaccagacatgcgatggcttctctctggccagc120

ctgaacagccccaagaacggctccaatcagctggtcatctctcgctgtgccaacggcctg180

aatgtggtgtctttctttatcagcatcctgaagcggagctcctctgccctgacctcccac240

ctgagagagctgctgaccacactggagtctctgtacggcagcttttccgtggaggacctg300

ttcggcgccaacctgaatcggtatgcctggcacagaggagga342

<210>3

<211>45

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ggaggaggaggatctggaggaggaggcagcggcggcggcggcagc45

<210>4

<211>1980

<212>dna

<213>epstein-barrvirus

<400>4

tccctgagcgaggtgaagctgcacctggacatcgagggccacgcctcccactacacaatc60

ccctggaccgagctgatggccaaggtgccaggactgtccccagaggccctgtggcgggag120

gccaatgtgaccgaggatctggcctctatgctgaacagatacaagctgatctataagaca180

agcggcaccctgggaatcgccctggcagagcctgtggacatcccagccgtgtctgagggc240

agcatgcaggtggatgcctccaaggtgcaccctggcgtgatctccggcctgaactctcct300

gcctgcatgctgtctgccccactggagaagcagctgttttactatatcggcacaatgctg360

cccaataccaggcctcacagctacgtgttctatcagctgcgctgtcacctgtcctacgtg420

gccctgtctatcaacggcgacaagtttcagtatacaggcgccatgaccagcaagttcctg480

atgggcacatacaagcgggtgaccgagaagggcgatgagcacgtgctgtccctgatcttt540

ggcaagacaaaggacctgcccgatctgagaggcccattctcctacccctctctgaccagc600

gcccagtccggcgactattccctggtcatcgtgaccacatttgtgcactacgccaacttt660

cacaattatttcgtgcccaatctgaaggatatgttcagcagggccgtgacaatgaccgca720

gcatcctacgcaagatatgtgctgcagaagctggtgctgctggagatgaagggcggctgt780

cgggagcctgagctggatacagagaccctgaccacaatgtttgaggtgagcgtggccttc840

tttaaagtgggacacgcagtgggagagacaggaaacggctgcgtggacctgagatggctg900

gccaagtctttctttgagctgacagtgctgaaggatatcatcggcatctgttacggcgcc960

accgtgaagggcatgcagagctatggcctggagaggctggccgccatgctgatggccacc1020

gtgaagatggaggagctgggccacctgaccacagagaagcaggagtacgcactgaggctg1080

gcaacagtgggataccctaaggcaggcgtgtattccggactgatcggaggagccaccagc1140

gtgctgctgtccgcctataatcggcaccctctgtttcagccactgcacacagtgatgaga1200

gagaccctgttcatcggaagccacgtggtgctgagggagctgcgcctgaatgtgaccaca1260

cagggcccaaacctggccctgtaccagctgctgagcaccgccctgtgctccgccctggag1320

atcggagaggtgctgaggggactggccctgggcacagagtctggcctgtttagcccatgt1380

tatctgtccctgaggttcgacctgactcgcgataagctgctgtctatggcaccacaggag1440

gcaatgctggaccaggcagccgtgagcaatgccgtggatggcttcctgggcaggctgtcc1500

ctggagagggaggacagagatgcctggcacctgcccgcctacaagtgcgtggaccgcctg1560

gataaggtgctgatgatcatccctctgatcaacgtgacctttatcatctctagcgacagg1620

gaggtgcgcggaagcgccctgtacgaggcctccaccacatatctgtcctctagcctgttc1680

ctgtcccccgtgatcatgaataagtgttctcagggagcagtggcaggagagccaaggcag1740

atccctaagatccagaactttacaagaacccagaagtcttgcatcttttgtggcttcgcc1800

ctgctgagctacgatgagaaggagggcctggagaccacaacctatatcacatctcaggag1860

gtgcagaacagcatcctgtcctctaattacttcgactttgataacctgcacgtgcactat1920

ctgctgctgacaaccaacggcaccgtgatggagatcgccggcctgtacgaggagagggca1980

<210>5

<211>81

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ggatacatcccagaggcaccaagggacggacaggcctatgtgcgcaaggatggcgagtgg60

gtgctgctgtctaccttcctg81

<210>6

<211>627

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

atgaagatggaggagctgtttaagaagcacaagatcgtggccgtgctgagggccaactcc60

gtggaggaggccatcgagaaggcagtggccgtgttcgcaggaggagtgcacctgatcgag120

atcacctttacagtgcctgacgccgatacagtgatcaaggccctgagcgtgctgaaggag180

aagggagcaatcatcggagcaggaaccgtgacatccgtggagcagtgcaggaaggcagtg240

gagtccggagccgagttcatcgtgtctccccacctggacgaggagatctctcagttctgt300

aaggagaagggcgtgttttacatgcctggcgtgatgaccccaacagagctggtgaaggcc360

atgaagctgggccacgatatcctgaagctgttcccaggagaggtggtgggacctcagttt420

gtgaaggccatgaagggccccttccctaatgtgaagtttgtgccaaccggcggcgtgaac480

ctggacaacgtgtgcgagtggttcaaggcaggcgtgctggcagtgggagtgggcgatgcc540

ctggtgaagggcgaccccgatgaggtgagggagaaggccaagaagtttgtggagaagatc600

cgcggctgtacagagggctccctggag627

<210>7

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

ggaggaagcggaagc15

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

ggaggaagcggaggctct18

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

ggaggaagcggaggctctgga21

<210>10

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

ggaggaagcggaggctctggaagc24

<210>11

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

ggaggaagcggaggctctggaggctct27

<210>12

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<400>12

glyglyserglyser

15

<210>13

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<400>13

glyglyserglyglyser

15

<210>14

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<400>14

glyglyserglyglysergly

15

<210>15

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<400>15

glyglyserglyglyserglyser

15

<210>16

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<400>16

glyglyserglyglyserglyglyser

15

<210>17

<211>54

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

ggaggaagcggaggctctggaagcgagaaggcagcaaaggcagaggaggcagcc54

<210>18

<211>72

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

atgccaatgggctctctgcagcccctggccacactgtacctgctgggaatgctggtggca60

agctgcctggga72

<210>19

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

catcatcaccaccaccaccaccac24

<210>20

<211>12

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

ggaagcggatcc12

<210>21

<211>3237

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

atgccaatgggctctctgcagcccctggccacactgtacctgctgggaatgctggtggca60

agctgcctgggatgggcatatccatgctgtcacgtgacccagctgagggcacagcacctg120

ctggccctggagaatatctctgacatctacctggtgagcaaccagacatgcgatggcttc180

tctctggccagcctgaacagccccaagaacggctccaatcagctggtcatctctcgctgt240

gccaacggcctgaatgtggtgtctttctttatcagcatcctgaagcggagctcctctgcc300

ctgacctcccacctgagagagctgctgaccacactggagtctctgtacggcagcttttcc360

gtggaggacctgttcggcgccaacctgaatcggtatgcctggcacagaggaggaggagga420

ggaggatctggaggaggaggcagcggcggcggcggcagctccctgagcgaggtgaagctg480

cacctggacatcgagggccacgcctcccactacacaatcccctggaccgagctgatggcc540

aaggtgccaggactgtccccagaggccctgtggcgggaggccaatgtgaccgaggatctg600

gcctctatgctgaacagatacaagctgatctataagacaagcggcaccctgggaatcgcc660

ctggcagagcctgtggacatcccagccgtgtctgagggcagcatgcaggtggatgcctcc720

aaggtgcaccctggcgtgatctccggcctgaactctcctgcctgcatgctgtctgcccca780

ctggagaagcagctgttttactatatcggcacaatgctgcccaataccaggcctcacagc840

tacgtgttctatcagctgcgctgtcacctgtcctacgtggccctgtctatcaacggcgac900

aagtttcagtatacaggcgccatgaccagcaagttcctgatgggcacatacaagcgggtg960

accgagaagggcgatgagcacgtgctgtccctgatctttggcaagacaaaggacctgccc1020

gatctgagaggcccattctcctacccctctctgaccagcgcccagtccggcgactattcc1080

ctggtcatcgtgaccacatttgtgcactacgccaactttcacaattatttcgtgcccaat1140

ctgaaggatatgttcagcagggccgtgacaatgaccgcagcatcctacgcaagatatgtg1200

ctgcagaagctggtgctgctggagatgaagggcggctgtcgggagcctgagctggataca1260

gagaccctgaccacaatgtttgaggtgagcgtggccttctttaaagtgggacacgcagtg1320

ggagagacaggaaacggctgcgtggacctgagatggctggccaagtctttctttgagctg1380

acagtgctgaaggatatcatcggcatctgttacggcgccaccgtgaagggcatgcagagc1440

tatggcctggagaggctggccgccatgctgatggccaccgtgaagatggaggagctgggc1500

cacctgaccacagagaagcaggagtacgcactgaggctggcaacagtgggataccctaag1560

gcaggcgtgtattccggactgatcggaggagccaccagcgtgctgctgtccgcctataat1620

cggcaccctctgtttcagccactgcacacagtgatgagagagaccctgttcatcggaagc1680

cacgtggtgctgagggagctgcgcctgaatgtgaccacacagggcccaaacctggccctg1740

taccagctgctgagcaccgccctgtgctccgccctggagatcggagaggtgctgagggga1800

ctggccctgggcacagagtctggcctgtttagcccatgttatctgtccctgaggttcgac1860

ctgactcgcgataagctgctgtctatggcaccacaggaggcaatgctggaccaggcagcc1920

gtgagcaatgccgtggatggcttcctgggcaggctgtccctggagagggaggacagagat1980

gcctggcacctgcccgcctacaagtgcgtggaccgcctggataaggtgctgatgatcatc2040

cctctgatcaacgtgacctttatcatctctagcgacagggaggtgcgcggaagcgccctg2100

tacgaggcctccaccacatatctgtcctctagcctgttcctgtcccccgtgatcatgaat2160

aagtgttctcagggagcagtggcaggagagccaaggcagatccctaagatccagaacttt2220

acaagaacccagaagtcttgcatcttttgtggcttcgccctgctgagctacgatgagaag2280

gagggcctggagaccacaacctatatcacatctcaggaggtgcagaacagcatcctgtcc2340

tctaattacttcgactttgataacctgcacgtgcactatctgctgctgacaaccaacggc2400

accgtgatggagatcgccggcctgtacgaggagagggcaggatacatcccagaggcacca2460

agggacggacaggcctatgtgcgcaaggatggcgagtgggtgctgctgtctaccttcctg2520

ggaagcggatcccatcatcaccaccaccaccaccacggaggaagcggaggctctggaagc2580

gagaaggcagcaaaggcagaggaggcagccatgaagatggaggagctgtttaagaagcac2640

aagatcgtggccgtgctgagggccaactccgtggaggaggccatcgagaaggcagtggcc2700

gtgttcgcaggaggagtgcacctgatcgagatcacctttacagtgcctgacgccgataca2760

gtgatcaaggccctgagcgtgctgaaggagaagggagcaatcatcggagcaggaaccgtg2820

acatccgtggagcagtgcaggaaggcagtggagtccggagccgagttcatcgtgtctccc2880

cacctggacgaggagatctctcagttctgtaaggagaagggcgtgttttacatgcctggc2940

gtgatgaccccaacagagctggtgaaggccatgaagctgggccacgatatcctgaagctg3000

ttcccaggagaggtggtgggacctcagtttgtgaaggccatgaagggccccttccctaat3060

gtgaagtttgtgccaaccggcggcgtgaacctggacaacgtgtgcgagtggttcaaggca3120

ggcgtgctggcagtgggagtgggcgatgccctggtgaagggcgaccccgatgaggtgagg3180

gagaaggccaagaagtttgtggagaagatccgcggctgtacagagggctccctggag3237

<210>22

<211>483

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

atgaaccagcacagccacaaggaccacgagaccgtgcgtattgcggtggttcgtgcgcgt60

tggcatgcggagattgtggatgcgtgcgttagcgcgttcgaagcggcgatgcgtgacatc120

ggtggcgatcgtttcgcggtggacgtttttgatgtgccgggtgcgtacgagattccgctg180

catgcgcgtaccctggcggaaaccggtcgttatggcgcggttctgggcaccgcgttcgtg240

gttaacggtggcatctaccgtcacgaatttgtggcgagcgcggttattaacggtatgatg300

aacgtgcaactgaacaccggcgtgccggttctgagcgcggttctgaccccgcacaactat360

gacaagagcaaagcgcacaccctgctgttcctggcgctgtttgcggtgaagggtatggaa420

gcggcgcgtgcgtgcgttgagatcctggcggcgcgtgaaaaaattgcggcgggcagcctg480

gaa483

<210>23

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

catcatcaccaccaccac18

<210>24

<211>167

<212>prt

<213>人工序列

<400>24

metasnglnhisserhislysasphisgluthrvalargilealaval

151015

valargalaargtrphisalagluilevalaspalacysvalserala

202530

pheglualaalametargaspileglyglyaspargphealavalasp

354045

valpheaspvalproglyalatyrgluileproleuhisalaargthr

505560

leualagluthrglyargtyrglyalavalleuglythralapheval

65707580

valasnglyglyiletyrarghisgluphevalalaseralavalile

859095

asnglymetmetasnvalglnleuasnthrglyvalprovalleuser

100105110

alavalleuthrprohisasntyrasplysserlysalahisthrleu

115120125

leupheleualaleuphealavallysglymetglualaalaargala

130135140

cysvalgluileleualaalaargglulysilealaalaglyserleu

145150155160

gluhishishishishishis

165

<210>25

<211>1055

<212>prt

<213>人工序列

<400>25

trpalatyrprocyscyshisvalthrglnleuargalaglnhisleu

151015

leualaleugluasnileseraspiletyrleuvalserasnglnthr

202530

cysaspglypheserleualaserleuasnserprolysasnglyser

354045

asnglnleuvalileserargcysalaasnglyleuasnvalvalser

505560

phepheileserileleulysargserserseralaleuthrserhis

65707580

leuarggluleuleuthrthrleugluserleutyrglyserpheser

859095

valgluaspleupheglyalaasnleuasnargtyralatrphisarg

100105110

glyglyglyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglygly

115120125

serserleusergluvallysleuhisleuaspilegluglyhisala

130135140

serhistyrthrileprotrpthrgluleumetalalysvalprogly

145150155160

leuserproglualaleutrpargglualaasnvalthrgluaspleu

165170175

alasermetleuasnargtyrlysleuiletyrlysthrserglythr

180185190

leuglyilealaleualagluprovalaspileproalavalserglu

195200205

glysermetglnvalaspalaserlysvalhisproglyvalileser

210215220

glyleuasnserproalacysmetleuseralaproleuglulysgln

225230235240

leuphetyrtyrileglythrmetleuproasnthrargprohisser

245250255

tyrvalphetyrglnleuargcyshisleusertyrvalalaleuser

260265270

ileasnglyasplyspheglntyrthrglyalametthrserlysphe

275280285

leumetglythrtyrlysargvalthrglulysglyaspgluhisval

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leuserleuilepheglylysthrlysaspleuproaspleuarggly

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prophesertyrproserleuthrseralaglnserglyasptyrser

325330335

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<212>prt

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glu

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glu

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glygly

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thrvallysglymetglnsertyrglyleugluargleualaalamet

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hishishishishishis

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