一种胆汁酸复配菌剂及其应用的制作方法

本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及一种胆汁酸复配菌剂及其应用。

技术背景

孢子虫和鳃出血是鲫鱼养殖中令养殖户感到棘手和绝望的病害。孢子虫在感染初期没有相应的症状，不易被发现，但当能被肉眼看见时，孢子虫已在鲫鱼身上开始寄生，尤其是鲫鱼腮部感染孢子虫，喉孢子会导致鲫鱼吃食能力差，免疫力低，进而提高其死亡率。鲫鱼腮出血是由于鲤鱼疱疹病毒ii型导致的，鲫鱼鳃出血病一旦发病，传播速度快得令人措手不及，并且鲫鱼鳃出血病高发期的温度也适合孢子虫的生长，因此在鲫鱼的养殖中常会出现腮出血和孢子虫感染并发的情况，二者一旦同时出现，对鲫鱼危害极大。而导致腮出血和孢子虫感染同时出现的原因在于，目前使用的杀虫剂多是化学药物，化学药物在杀虫的同时也会损伤鱼体，造成鱼的免疫力下降，对病毒、细菌等病的抵抗力差，再加上虫体寄生形成的伤口在虫体脱落后为病原的侵袭提供了便捷入口，杀虫后的鲫鱼非常容易感染细菌或病毒引起鳃出血。

针对于鲫鱼鳃出血与孢子虫感染并发的情况，如果使用抗生素、杀虫药、刺激性消毒药等，反而会对鱼体造成更深层次的应激，更进一步增加其死亡量。因此，研发一种对鲫鱼无害且能够有效解决二者并发问题的制剂，具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明提供了一种胆汁酸复配菌剂及其应用。所述胆汁酸复配菌剂使用安全，能够起到预防或/和治疗淡水养殖鱼类腮出血和/或孢子虫感染的作用。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了胆汁酸复配菌剂，所述胆汁酸复配菌剂由多粘类芽孢杆菌粉、胆汁酸和多苞桉桉树精油复配而成。

进一步的，所述胆汁酸复配菌剂中多粘类芽孢杆菌粉、胆汁酸和多苞桉桉树精油的质量比为4-5∶2-3∶2-3。

最优的，所述胆汁酸复配菌剂中多粘类芽孢杆菌粉、胆汁酸和多苞桉桉树精油的质量比为4∶3∶3。

进一步的，所述多粘类芽孢杆菌粉是由保藏编号为cgmccno.20819的多粘类芽孢杆菌lcp-01经培养干燥制成的。

进一步的，所述多粘类芽孢杆菌lcp-01菌粉的菌含量不小于1×10⁹cfu/ml。

进一步的，所述胆汁酸复配菌剂中的菌含量不少于6×10⁸cfu/g。

本发明提供了所述的胆汁酸复配菌剂在用于制备防治淡水养殖鱼类腮出血和/或孢子虫感染的制剂中的应用。

进一步的，在治疗淡水养殖鱼类腮出血和/或孢子虫感染时，将所述胆汁酸复配菌剂以1.5-2.5kg/吨用量混合在淡水养殖鱼类的饲料中，每天3次，连续投喂7-10天后，暂停5-7天，再次投喂7-10天。

进一步的，在预防淡水养殖鱼类腮出血和/或孢子虫感染时，于每月固定时间，将所述胆汁酸复配菌剂以1-1.5kg/吨用量混合在淡水养殖鱼类的饲料中，每天2-3次，连续投喂4-7天，直至鱼类进入捕捞期。

最优的，在预防淡水养殖鱼类腮出血和/或孢子虫感染时，于养殖的第一个月，将所述胆汁酸复配菌剂以1.5kg/吨的用量混合在淡水养殖鱼类的饲料中，每天2-3次，连续投喂7天，从养殖的第二个月开始，于固定时间将所述胆汁酸复配菌剂以1kg/吨的用量混合在淡水养殖鱼类的饲料中，每天2次，连续投喂5天，直至鱼类进入捕捞期。

进一步的，所述胆汁酸复配菌剂能够驱除孢子虫。

进一步的，所述胆汁酸复配菌剂能够提高淡水养殖鱼类的存活率和总产量。

进一步的，所述淡水养殖鱼类包括鲫鱼、鲤鱼、草鱼、鲢鱼。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明从土壤中筛选出一株多粘类芽孢杆菌lcp-01，其具有很好的抗菌作用，并将其通过发酵干燥制备成菌粉，与胆汁酸、多苞桉桉树精油制备成一种全新的胆汁酸复配菌剂，该菌剂能够预防和治疗鲫鱼腮出血、或孢子虫感染、或二者并发的问题，其能够有效驱除鲫鱼感染的孢子虫，控制孢子虫的繁殖和爆发，还能够起到很高的杀菌消炎的作用，防止寄生虫撕裂的伤口继发细菌感染，加快伤口愈合的速度，避免病毒的侵袭，还能促进鲫鱼的生长，提高其存活率。本发明的胆汁酸复配菌剂使用简单，安全可靠，不会对鱼类产生任何的副作用，同时也不会对自然界、其他的动物或人体造成伤害，并且从养殖初期开始定时使用，能够很有效的预防腮出血的情况出现，因此本发明的胆汁酸复配菌剂有利于鲫鱼的养殖，并提高其养殖收益。

附图说明

图1为所述多粘类芽孢杆菌lcp-01的菌落图片。

图2为实施例3中孢子虫感染和腮出血并发的鲫鱼。

图3为实施例3中使用胆汁酸复配菌剂恢复后的鲫鱼。

图4为实施例4中1号鱼塘出现腮出血的鲫鱼。

图5为实施例4中2号鱼塘鲫鱼捕捞情况图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：多粘类芽孢杆菌lcp-01菌粉的制备

1、多粘类芽孢杆菌lcp-01的筛选和鉴定

以土壤为样品，将土壤和无菌水混匀混匀制成土壤的10-1稀释液，然后分别制取10-2、10-3、10-4、10-5稀释液。分别取10-3、10-4、10-5稀释液涂布于营养琼脂培养基(牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，nacl5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0l，ph7.0)上，37℃恒温培养48h，选取明显的菌落进行多次纯化后得到单菌落，并将其命名为lcp-01。

如图1所示，所述菌株lcp-01在营养琼脂培养基的菌落呈圆形、类圆形或椭圆形，米黄色，直径3-5mm，扁平，表面光滑无光泽，不透明，边缘呈不规则的波状且具半透明镶边。

提取所述菌株lcp-01的基因组dna，并以此为模板，使用16srrna通用引物进行pcr扩增，获得16srrna扩增序列后测序，然后将该序列进行blast比对，结果显示菌株lcp-01与genbank基因库中的多粘类芽孢杆菌paenibacilluspolymyxa同源性最高，因此判定菌株lcp-01为多粘类芽孢杆菌。

将筛选到的多粘类芽孢杆菌lcp-01进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年09月25日；多粘类芽孢杆菌paenibacilluspolymyxa的保藏编号为cgmccno.20819。

2、多粘类芽孢杆菌lcp-01菌粉的制备

将多粘类芽孢杆菌lcp-01在营养液体培养基(牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，nacl5.0g，蒸馏水1.0l，ph7.0)中，37℃培养36h后，再将得到的菌悬液利用真空冷冻干燥法制备成多粘类芽孢杆菌lcp-01菌粉，确保菌粉的菌含量不少于1×10⁹cfu/g。

实施例2：胆汁酸复配菌剂的制备

1、胆汁酸的制备

所述胆汁酸的制备工艺步骤如下：

(1)皂化：将粉碎过40目筛的1kg猪胆粉加入反应釜中，再加入质量浓度为10％的氢氧化钠溶液10l，加热搅拌至沸腾，并保持沸腾状态搅拌14h，然后将反应生成的皂化液冷却至固液分层，去除上清液，剩余固体即为胆汁酸皂化品；

(2)脱色：向胆汁酸皂化品中加6l水，加热至80℃使胆汁酸皂化品完全溶解，然后将其打入脱色罐中，加入300ml双氧水搅拌均匀后，常温反应24h，然后将反应溶液过滤至酸化槽中，得到滤液；

(3)酸化：将滤液冷却至室温，缓慢加入10％盐酸溶液，边加入边搅拌，待溶液ph值在3时停止加酸，离心过滤得到白色固形物；

(4)纯化：将白色固形物不断加水冲洗，将附着在白色固形物表面的水溶性杂质去除，待滤出的水检测呈中性后结束水洗；将离心过滤后的白色固形物放入烘箱中，100℃干燥至水分少于10％，得胆汁酸粗品；

(5)重结晶：将胆汁酸粗品投入萃取罐中，加入胆汁酸粗品重量10倍体积的乙酸乙酯搅拌至完全溶解，再加入0.08g无水硫酸钠脱水，过滤收集过滤液，将过滤液进行减压浓缩并回收乙酸乙酯，得到液体胆汁酸；

(6)干燥：将液体胆汁酸放入烘箱，在100℃下干燥至水分不超过1％时，得到成品胆汁酸。

成品胆汁酸中包含了78.6％的猪胆酸和猪去氧胆酸以及20.0％的鹅去氧胆酸。

2、多苞桉桉树精油的制备

将澳大利亚多苞桉桉树叶放入水洗塔清洗后，放到烘干机中烘干，再于粉碎机中粉碎后分别进入水蒸气蒸馏釜、冷凝器和油水分层器中分离油相和水相，其中水相进入乙醚萃取器分离出废水，含有乙醚的液体进入乙醚回收塔中回收乙醚，将回收的乙醚和油相液体添加到固体床吸附干燥器进一步去除油相中的水分，最后将油相液体加入到减压精馏塔中精馏以此去除杂质油后便得到多苞桉桉树精油。制备出的多苞桉桉树精油保存在密封、不透光的容器中并避光放置。

3、胆汁酸复配菌剂的制备

将上述制备的多粘类芽孢杆菌lcp-01菌粉、胆汁酸、多苞桉桉树精油以4∶3∶3的质量比均匀混合后，得到复合菌剂；复合菌剂中的菌含量不少于6×10⁸cfu/g。

实施例3

2020年8月，湖北鲫鱼养殖户中有5家发现自家鱼塘的鲫鱼感染孢子虫，其中2家的鲫鱼同时出现喉孢子和鳃出血的现象(图2)。

选择这2家鱼塘使用实施例2制备的胆汁酸复配菌剂：首先使用环烷酸铜外泼鱼塘进行杀菌，再将胆汁酸复配菌剂以2kg的用量拌在1吨鲫鱼饲料中，投喂给鲫鱼，每天投喂3次，连续使用7日后，暂停5日，再将胆汁酸复配菌剂拌于饲料中，继续给鲫鱼投喂7天。共计19天后，使用胆汁酸复配菌剂后鱼塘，鲫鱼的死亡量减少，鲫鱼的喉部组织和腮部颜色均恢复正常，肉眼可见的生长速度加快(图3)。由此说明本发明的胆汁酸复配菌剂能够有效驱杀鲫鱼感染的孢子虫并控制孢子虫的繁殖，还能够起到很高的杀菌消炎的作用，防止寄生虫撕裂的伤口继发细菌感染，加快伤口愈合的速度，避免病毒的侵袭，改善了鲫鱼的腮出血问题，另外，胆汁酸复配菌剂还提高了鲫鱼的免疫力和吃食能力，提高其存活率和生长速度。

实施例4

江苏射阳，某养殖鱼塘，养殖规模共计200余亩。其中有2个鲫鱼成鱼塘，1号鱼塘70亩，4月养鲫鱼1500尾/亩，2号鱼塘40/亩，同时养鲫鱼1800尾/亩，鲫鱼均为1-1.3两/尾。在养殖过程中，5月份于1号鱼塘均发现了孢子虫，于是使用常规杀虫药，避免了孢子虫的大面积爆发，9月份提前给1号鱼塘使用杀虫药，但仍然出现孢子虫，且随着养殖时间的增长，孢子虫感染情况越来越严重，此时1号鱼塘采用增加用药量的方式，但鲫鱼却出现了鳃出血的问题(图4)，鲫鱼死亡数量逐渐增加；2号鱼塘于5月份同样出现孢子虫，于6日采用胆汁酸复配菌剂1.5kg拌1吨饲料投喂鲫鱼，每天2-3次，连续投喂7天后，避免了孢子虫的爆发，随后2号鱼塘每个月定期(即6日)使用胆汁酸复配菌剂以1kg/吨混于饲料中投喂鲫鱼5天，每天2次，9月份也未出现大规模的孢子虫感染。11月下旬，两个鱼塘均进入捕捞期，收获情况如表1和图5所示，与1号鱼塘相比，使用了胆汁酸复配菌剂的2号鱼塘，不仅没有出现孢子虫大规模爆发，鲫鱼还没有出现可怕的腮出血，并且鲫鱼死亡数量明显减少且单尾鲫鱼重量更重。由此说明本发明的胆汁酸复配菌剂能够有效驱除鲫鱼感染的孢子虫，控制孢子虫的繁殖和爆发，并对鲫鱼的腮出血具有很好的预防作用，还能促进鲫鱼的生长，提高其存活率。

表1：鲫鱼养殖情况统计表

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。