本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及一种局部减脂组合物及其在治疗甲状腺相关眼病和局部减脂领域的应用。
背景技术：
甲状腺相关眼病是与甲状腺疾病密切相关的成年人最常见的自身免疫性眼病，表现为眼球突出、眼睑退缩迟落、眶周肿胀、限制性眼外肌病变、暴露性角膜炎和压迫性视神经病变等。眼眶脂肪增多、眼眶脂肪结缔组织和眼外肌内炎性细胞浸润及多糖沉积引起眼球突出。约52％的患者因眼眶脂肪增多而导致眼球突出。眼眶脂肪的增多是脂肪细胞数量的增加和脂肪细胞体积增大所共同造成的。脂肪细胞内脂肪生成增多和水解减少均可导致脂肪细胞体积的增大。研究证实甲状腺相关眼病患者眼眶脂肪细胞内脂肪生成加速。
抑制脂肪生成只能抑制新的脂肪细胞增加，并不能治疗已经存在的眼眶脂肪组织的堆积。因此只有促进眼眶脂肪水解才能治疗因眼眶脂肪组织堆积导致的眼球突出。脂肪水解使脂肪细胞内的甘油三酯变成游离脂肪酸和甘油并释放入循环中，脂肪细胞体积变小，眼眶内容减少，眼球突出度恢复正常。脂肪水解的过程受很多内分泌因子和激素的调控，脂肪特异性磷脂酶(adpla)是其中最重要的自分泌和旁分泌的脂肪水解调控因子，它水解磷脂的sn-2位产生花生四烯酸和游离脂肪酸，花生四烯酸通过环氧合酶(cox)产生前列腺素e2，后者与脂肪细胞表面的gai偶联的前列腺素受体3(ep3)相结合，抑制腺苷酸环化酶而减少脂肪水解。
rna干扰技术又被形象地称为基因敲低(knock-down)或基因沉默(genesilencing)，是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默(post-transcriptionalgenesilencing，ptgs)。双链sirna与细胞源性的相关酶和蛋白质形成rna诱导的沉默复合体(rna-inducedsilencingcomplex,risc)。在rna干扰过程中，双链sirna中的正义链被排除出复合体，反义链指导risc结合到靶mrna的同源位点，然后由复合物中的核糖核酸酶iii降解靶mrna，从而关闭靶基因的表达。
研究表明adpla在小鼠模型的脂肪细胞脂肪水解中起关键作用，adpla缺陷小鼠出现了无限制性的全身脂肪水解。但是，这种方法不适用于甲状腺相关眼病脂肪堆积的治疗，因为该技术水解全身的脂肪，而且不受控制。受该研究的启发，我们使用rna干扰技术仅沉默眼眶脂肪内的adpla基因，仅水解眼眶脂肪而不影响全身脂肪，达到治疗眼球突出的目的，而不产生全身副作用。由此可以推广到身体其他部位的局部减脂，从而达到美体的效果。
技术实现要素：
本发明提供了一种含有针对adpla基因的小干扰核酸分子的减脂组合物，并使用该组合物来改善甲状腺眼病的眼突症状或是用于局部减脂。
本发明提供的局部减脂组合物，包括溶媒、透皮肽(在本发明中也称透皮十肽-4)和针对adpla基因的小干扰核酸(adpla基因sirna)，其中溶媒由下述原料制备而成：水、甘油、凝血酸、谷胱甘肽、丁二醇、牛磺酸、甲氧基水杨酸钾、甘油辛酸酯、辛酰羟肟酸、对羟基苯乙酮、肌肽、产碱杆菌多糖类、甘草酸二钾、苯氧乙醇；溶媒、透皮十肽-4和adpla基因sirna的比例为1g溶媒：0.1-0.5mg透皮十肽-4：10-100ngadpla基因sirna。具体地，1g溶媒包含下述原料：
0.93克水、0.05克甘油、0.003克凝血酸、0.002克谷胱甘肽、0.001克丁二醇、0.001克牛磺酸、0.001克甲氧基水杨酸钾、0.001克甘油辛酸酯、0.002克辛酰羟肟酸、0.001克对羟基苯乙酮、0.001克肌肽、0.002克产碱杆菌多糖类、0.003克甘草酸二钾和0.002克苯氧乙醇。。
本发明还提供了局部减脂组合物的制备方法，将制备溶媒的原料按如下配方加入均质乳化机的水相锅中以400转/分搅拌：0.93克水、0.05克甘油、0.003克凝血酸、0.002克谷胱甘肽、0.001克丁二醇、0.001克牛磺酸、0.001克甲氧基水杨酸钾、0.001克甘油辛酸酯、0.002克辛酰羟肟酸、0.001克对羟基苯乙酮、0.001克肌肽、0.002克产碱杆菌多糖类、0.003克甘草酸二钾和0.002克苯氧乙醇，搅拌二十分钟后加入透皮十肽-4和adpla基因sirna，三者的比例为1g溶媒：0.1-0.5mg透皮十肽-4：10-100ngadpla基因sirna，再继续搅拌十分钟。
本发明中制备溶媒所用的原料均采购自广州元基生物科技有限公司，产品目录号如下：
水目录编号：06260
甘油目录编号：02421
凝血酸目录编号：04866
谷胱甘肽目录编号：02586
丁二醇目录编号：0003
牛磺酸目录编号：04876
甲氧基水杨酸钾目录编号：03354
甘油辛酸酯目录编号：02478
辛酰羟肟酸目录编号：07218
对羟基苯乙酮目录编号：02021
肌肽目录编号：03150
产碱杆菌多糖类目录编号：01616
甘草酸二钾目录编号：02397
苯氧乙醇目录编号：01294
透皮十肽-4的序列如中国授权专利cn106084006b所示，由自广州元基生物科技有限公司合成。
adpla基因sirna由广州市锐博生物科技有限公司合成。
本发明的有益效果
本发明提供的局部减脂产品，能够高效、特异地抑制adpla基因的表达，有效水解脂肪。在实验动物上使用本产品10天以后，脂肪水解率最高可达到40％以上，可长期使用并达到标本兼治的目标。
具体实施方式
本发明设计了针对adpla基因的sirna，可以针对性的降低乃至沉默adpla基因的表达，水解脂肪，配合本发明局部高效透皮渗透组合物，起到局部减脂的效果。
本发明实施例公开了一种设计、获得针对adpla基因的小干扰核酸分子的方法以及应用这些小干扰分子制备局部减脂组合物的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数和辅料/原料组分实现，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明的范围内。本发明的小干扰核酸及产品组合物已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施例仅仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。
本发明基于adpla基因(geneid:11145)序列设计、筛选活性小干扰核酸(sirna)序列。
adpla-sirna1：正义链5’-gcgagcacuuugugaaugadtdt-3’seqidno.1
反义链5’-ucauucacaaagugcucgcdtdt-3’seqidno.2
adpla-sirna2：正义链5’-ggucagggauugucuuucadtdt-3’seqidno.3
反义链5’-ugaaagacaaucccugaccdtdt-3’seqidno.4
adpla-sirna3：正义链5’-cccacacaauauucauaaudtdt-3’seqidno.5
反义链5’-auuaugaauauugugugggdtdt-3’seqidno.6
adpla-sirna4：正义链5’-gccgugacauacaucuugudtdt-3’seqidno.7
反义链5’-acaagauguaugucacggcdtdt-3’seqidno.8
adpla基因核苷酸序列的小干扰核酸化学合成的具体步骤如下：
(1)寡聚核糖核苷酸的合成：寡聚核糖核苷酸的合成是在自动dna/rna合成仪上进行。由于小干扰核酸是由一段19个寡聚核糖核苷酸和2个脱氧胸苷酸组成。因此，起始物为固相连接的5’-0_对二甲氧基-胸苷，具体的每一个循环合成可分为四步来完成，第一步是将与固定连接的胸苷上5’位的保护基在三氯乙酸的作用下洗脱；第二步在活性催化剂s-乙基四唑的作用下，将5’-0-对二甲氧基三苯甲基_胸苷亚磷酰胺偶联至已脱去保护的上一个胸苷上，形成二胸苷亚磷酸三酯，偶合时间偶合次数均按仪器厂家提供的程序来完成；第三步是将偶合的二胸苷亚磷酸三酯在0.05m碘水作用下，氧化成二胸苷磷酸三酯；第四步是乙酰化，将固相上的少量未反应的活性基团(例如羟基和胺基)在乙酸酐的作用下形成酯或酰胺，从而达到封闭的作用，以减少整体副产物的产生，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。
(2)脱保护：将合成好的固相小干扰核酸放入至一个可以密封的小瓶中，并加入1毫升的乙醇/胺(体积比为1：3)，然后密封，置于55-70℃温箱中，孵育2-30小时，取出溶液，并将固相再次用双蒸水淋洗，收集洗脱液，并干燥去除溶剂。然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(im)，室温放置4-12小时，再经过乙醇沉淀，得到小干扰核酸的粗产物。
(3)纯化分离：将小干扰核酸的粗产物溶解于2毫升的乙酸铵水溶液中，然后经过反应c18高压液相色谱的分离，运用梯度淋洗的方法，收集小干扰核酸主产物(淋洗液a:0.1m乙酸铵；淋洗液b:20％的0.1m乙酸铵和80％的乙腈)，除去主产物中的溶剂，并加入5毫升80％的乙酸水溶液，在室温静置15分钟，然后将此溶液进行阴离子交换的分离(deae-5pw，阴离子交换柱)，即可得到纯度在90％以上的小干扰核酸(梯度淋洗，淋洗液a：0.025m的tris-hcl,0.025m的nacl，ph＝8，5％的乙腈；淋洗液b：0.025m的tris-hcl，2om的nacl，ph＝8，5％的乙腈)。
(4)脱盐：纯化的小干扰核酸经过透析，除去盐份，随后将小干扰核酸溶液进行过滤消毒和干燥结晶。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸经过退火处理形成稳定的双链小干扰核酸，其方法是将正义链和反义链的寡聚核糖核苷酸混合溶解在1-2毫升的缓冲液中(10mmtris,ph＝7.5-8.0,50mmnacl)，将此溶液加热至95℃，然后缓缓将此溶液冷却至室温，最后将此溶液存放在4℃冰箱中保存，以备随时使用。
实施例1
将制备溶媒的原料按如下配方加入均质乳化机的水相锅中以400转/分搅拌：0.93克水、0.05克甘油、0.003克凝血酸、0.002克谷胱甘肽、0.001克丁二醇、0.001克牛磺酸、0.001克甲氧基水杨酸钾、0.001克甘油辛酸酯、0.002克辛酰羟肟酸、0.001克对羟基苯乙酮、0.001克肌肽、0.002克产碱杆菌多糖类、0.003克甘草酸二钾和0.002克苯氧乙醇，搅拌20分钟后加入透皮十肽-4和adpla-sirna1，三者的比例为1g溶媒：0.1mg透皮十肽-4：10ngadpla-sirna1，再继续搅拌10分钟得到实施例1的局部减脂产品。
实施例2
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：三者的比例为1g溶媒：0.1mg透皮十肽-4：25ngadpla-sirna1，得到实施例2的局部减脂产品。
实施例3
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：三者的比例为1g溶媒：0.1mg透皮十肽-4：50ngadpla-sirna1，得到实施例3的局部减脂产品。
实施例4
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：三者的比例为1g溶媒：0.1mg透皮十肽-4：75ngadpla-sirna1，得到实施例4的局部减脂产品。
实施例5
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：三者的比例为1g溶媒：0.1mg透皮十肽-4：100ngadpla-sirna1，得到实施例5的局部减脂产品。
实施例6
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：三者的比例为1g溶媒：0.5mg透皮十肽-4：10ngadpla-sirna1，得到实施例6的局部减脂产品。
实施例7
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：三者的比例为1g溶媒：0.5mg透皮十肽-4：25ngadpla-sirna1，得到实施例7的局部减脂产品。
实施例8
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：三者的比例为1g溶媒：0.5mg透皮十肽-4：50ngadpla-sirna1，得到实施例8的局部减脂产品。
实施例9
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：三者的比例为1g溶媒：0.5mg透皮十肽-4：75ngadpla-sirna1，得到实施例9的局部减脂产品。
实施例10
与实施例1基本相同，区别仅仅在于：三者的比例为1g溶媒：0.5mg透皮十肽-4：100ngadpla-sirna1，得到实施例10的局部减脂产品。
实施例11
与实施例10基本相同，区别仅仅在于：将adpla-sirna1换成adpla-sirna2，三者的比例为1g溶媒：0.5mg透皮十肽-4：100ngadpla-sirna2，得到实施例11的局部减脂产品。
实施例12
与实施例10基本相同，区别仅仅在于将adpla-sirna1替换成adpla-sirna3，得到实施例12的局部减脂产品。
实施例13
与实施例10基本相同，区别仅仅在于将adpla-sirna1替换成adpla-sirna4，得到实施例13的局部减脂产品。
实施例14甲状腺眼病裸鼠实验
从接受眼眶减压手术的患者获得眼眶脂肪。洗涤组织进行体积测量，植入70只裸鼠的腹侧皮肤下。根据实施例1-13制备得到局部减脂组合物分别编号为1-13，仅含溶媒的对照组别为14。将裸鼠随机分为不同的组，每组5只。每天一次将各组别产品涂抹在接种区域。应用上述配方10天后，处死裸鼠，将皮下脂肪取出。一部分组织提取rna用qrt-pcr测量adplamrna的表达，剩余组织切片做油红染色：①油红o稀释液配置：油红饱和液6ml加蒸馏水4ml混匀后过滤使用。②制作的冰冻切片充分洗涤，油红o稀释液避光染色10min。③60％乙醇镜下分化，水洗。④苏木精复染核，水洗后70％甘油封片。2h内显微镜下观察拍照，之后用pbs清洗，加入100-200ul的异丙醇抽提油红o，然后在510波长测定od值(od值越高，表明脂滴越多)。
表1各组别抑制adplamrna的效果
表2各组别油红od值以及脂肪降解率
根据表1和表2所示的结果，在仅有溶媒的情况下，adplamrna的抑制率为0，在使用本发明提供的产品后10天，小鼠移植眼眶脂肪明显降低，组合10即1g溶媒，0.5mg透皮肽，100ngadpla基因sirnano.1，对脂肪的降解效果最好，降解率高到46.84％。
实施例15小鼠皮下脂肪实验
上述所示的实施例得到局部减脂组合物1-13，仅含溶媒的对照组别为14。将70只成年雌性c57bl/6小鼠安置在环境控制的动物护理实验室中，使用标准的小鼠饮食。用剪刀仔细修剪腹部1cm×1cm区域的毛发(不使用任何有明显皮肤损伤迹象的小鼠)。选择小鼠并将其随机分为不同的组，每组5只。每天一次将各组别产品涂抹在腹部剔除毛发的区域。应用上述配方10天后，处死小鼠，将皮下脂肪取出。如上述方法切片做油红染色。
表3各组别油红od值以及脂肪降解率
根据表3所示的结果，在使用本发明提供的产品后10天，小鼠皮下脂肪明显降低，组合10即1g溶媒，0.5mg透皮肽，100ngadpla基因sirnano.1，对皮下脂肪的降解效果最好，降解率高达45.71％。
sequencelisting
<110>汤涛
<120>一种局部减脂组合物及其应用
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