管花苷B作为TAK1抑制剂在制备抗炎药物中的应用的制作方法

文档序号:25992644发布日期:2021-07-23 21:05阅读:285来源:国知局
管花苷B作为TAK1抑制剂在制备抗炎药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域,尤其涉及管花苷b作为tak1抑制剂在制备抗炎药物中的应用。



背景技术:

管花苷b(tubulosideb)是从管花肉苁蓉中分离纯化的一种苯乙醇苷类化合物,苯乙醇苷类是管花肉苁蓉的主要活性成分,目前报道具有显著抗氧化、促进物质代谢、改善学习记忆等作用。

类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,ra)是以关节和关节周围组织病变为主的多器官受累的慢性自身免疫性疾病。全球发病率0.5%~1.0%,在我国的发病率约为0.42%,女性患者居多,在任何年龄段均可见。迄今为止其发病机制尚不清楚,主流学说认为与免疫系统失调有关。大量数据表明,肿瘤坏死因子(tnf-α)会引起细胞炎症因子风暴,其大量分泌会引起白介素-1(il-1)、血小板获得性生长因子(pdgf)、表皮细胞生长因子(egf)、巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)表达增加,促进滑膜增生,导致滑膜炎。目前临床上治疗ra的方法包括西药治疗、中医治疗、中西医结合治疗、基于纳米载药系统的药物治疗等。西药治疗包括:(1)非甾体类抗炎药,如阿司匹林、吲哚美辛等,通过抑制关节炎症部位环氧合酶-2活性减少前列腺素的生成从而减轻炎症反应;(2)抗风湿药,如甲氨蝶呤、环孢素等,防止患者关节影像学损害,结构和机制不尽相同,但临床特征相似;(3)糖皮质激素,如泼尼松、甲泼尼松龙等,主要发挥免疫抑制作用;(4)靶向生物制剂通过阻断某种特定炎症细胞因子或细胞表面分子而发挥作用,根据作用机制可分为tnf抑制剂、b细胞耗竭剂、t细胞阻断剂、il-6受体单克隆抗体等。中医治疗除使用中药治疗包括单药雷公藤、青风藤等以及复方或中成药桂枝芍药知母汤、祛风止痛胶囊、祖师麻片等,还常配合针灸、熏蒸、拔罐、推拿、外敷等综合疗法。ra常用的临床药物均可通过纳米载药系统经被动靶向、主动靶向、微环境响应靶向以及仿生靶向策略被运送至炎症区域从而缓解病情。此外,ra后期出现严重功能障碍时可考虑滑膜切除术、膝关节置换术、关节成形术、关节固定术等。尽管目前已有不少治疗方式,但是仍然没有一种能彻底治愈ra,治疗目的也主要是避免关节损伤或残疾,减轻炎症反应,控制全身症状,最终实现缓解疼痛、控制病情进展,提高患者的生活质量的目标。

tak1是map3k家族成员之一,是炎症和免疫信号通路中的关键调节因子,可调节炎症介质的表达和细胞死亡等。tak1可以与tab1、tab或tab3结合形成三元复合物,被一系列促炎刺激物,如tgf-β、tnf-α、il-1等激活,进而通过核因子κb(nf-κb)和map激酶p38和c-jun激酶(jnk)激活调节炎性基因表达。tak1作为炎症信号传导中的一个关键节点,抑制它可能可以作为炎症性疾病和癌症的一种新的治疗方式。已证实口服tak1抑制剂lytak1可降低nf-κb活化,并使癌细胞对吉西他滨的体外和体内杀伤敏感。5z-7-氧代玉米醇,一种间苯二酚内酯,首次被报道为tak1的高效化学抑制剂,可抑制苦皮素氯化物诱导的耳肿胀。5z-7-氧代玉米醇在体外和体内通过nf-κb依赖性机制证实了神经母细胞瘤对化疗药物多柔比星和依托泊苷敏感性的相似数据。选择性化学tak1抑制剂全身给药在动物模型中显示出显著的抗炎和抗肿瘤活性。然而目前尚无关于管花苷b可作为tak1抑制剂应用在治疗相关疾病中的报道。



技术实现要素:

本发明针对现有技术的不足,提供了管花苷b作为tak1抑制剂在制备抗炎药物中的应用,具体地,由于化合物管花苷b可用于抑制tak1活性,所以可进而用于制备tak1抑制剂药物、用于制备治疗类风湿性关节炎药物、用于制备治疗自身免疫性疾病药物、用于制备治疗抗炎药物和用于制备免疫调节药物的用途。

为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:

第一方面,本发明提供了管花苷b在制备tak1抑制剂中的应用,其中,管花苷b的化学结构如下式:

第二方面,本发明提供了管花苷b在制备抗炎药物中的应用,其中,管花苷b的化学结构如下式:

第三方面,本发明提供了管花苷b在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用,其中,管花苷b的化学结构如下式:

进一步地,管花苷b的有效剂量为10~30mg/kg。

进一步优选地,管花苷b的有效剂量为20mg/kg。

进一步地,上述药物在施用后,具有以下效果:

a.关节炎指数下降;

b.足掌肿胀症状减轻;

c.滑膜组织炎症减轻;和/或

d.炎症因子il-1β、il-6、tnf-α、mmp-1表达水平下降。

第四方面,本发明提供了管花苷b在制备治疗自身免疫性疾病中的应用,其中,管花苷b的化学结构如下式:

本发明采用以上技术方案,与现有技术相比,具有如下技术效果:

本发明首次发现化合物管花苷b具有tak1抑制活性,可以用于制备tak1抑制剂药物,而tak1是map3k家族成员之一,可以介导炎症的发生发展;在细胞受细胞因子、神经递质、激素、细胞应激等外部刺激时,tak1被激活,介导下游转录调控因子入核,调控炎症因子转录;炎症因子异常与类风湿性关节炎及其他自身免疫病有密切联系,因此化合物管花苷b具有开发成治疗类风湿性关节炎、治疗自身免疫病、抗炎及免疫调节药物的前景。

附图说明

图1显示了本发明一实施例中类风湿性关节炎(cia)大鼠的关节炎指数(a)与足肿胀程度(b);其中,“control”表示对照组,“model”表示模型组,“tub”表示管花苷b给药组,“met”表示甲氨蝶呤组;

图2为本发明一实施例中cia大鼠滑膜组织的he染色结果;

图3显示了本发明一实施中cia大鼠炎症因子水平;其中,a-e为血清中炎症因子(il-6、il-1β、tnf-α、peg2、rankl)水平;f-i为滑膜组织中炎症因子(il-1β、il-6、tnf-α、mmp-1)转录水平;###为模型组与空白组具有显著性差异;*为p<0.05;**为p<0.01;***为p<0.001;

图4为本发明一实施例中mh7a细胞中炎症因子转录水平;其中,图a-d分别表示了il-1β、il-6、adamts4、adamts5的转录水平;###为模型组与空白组具有显著性差异;*为p<0.05;**为p<0.01;***为p<0.001;

图5显示了本发明一实施例中mh7a细胞中tak1及其相关信号通路蛋白表达水平;

图6为本发明一实施例中管花苷b与tak1的atp输水口袋理论结合模式图。

具体实施方式

本发明提供了化学结构如下的管花苷b作为tak1抑制剂在制备抗炎药物中的应用,具体地,由于化合物管花苷b可用于抑制tak1活性,所以可进而用于制备tak1抑制剂药物、用于制备治疗类风湿性关节炎药物、用于制备治疗自身免疫性疾病药物、用于制备治疗抗炎药物和用于制备免疫调节药物的用途。

在本发明一优选的实施方式中,上述药物除了包括管花苷b之外,还包括药学上可接受的的载体或赋形剂。术语“药学上可接受的”是指适用于人而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应),即有合理的效益/风险比的物质。“载体或赋形剂”包括粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、湿润剂中的一种或几种。

在本发明一优选的实施方式中,上述药物的给药途径为口服、透皮、肌肉、皮下或静脉注射。

在本发明一优选的实施方式中,上述药物的剂型可以为片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍,以使更好的理解本发明,但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法,使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

以下实施例采用的实验材料包括苯乙醇苷类化合物管花苷b(hplc纯度不低于98%)、弗氏完全佐剂(sigam货号:f5881)、弗氏不完全佐剂(sigam货号:f5506)、牛ⅱ型胶原蛋(源叶生物货号:s12010)、工具细胞:mh7a(成纤维样滑膜细胞)、whister大鼠(spf级)。

以下实施例的实验结果以平均值±标准差(mean±sd)的形式表示,使用ibmspss20.0统计软件进行oneway-anova中的lsd多重比较检验;当p<0.05,认为差异具有统计学意义。

实施例1

本实施通过cia大鼠模型,验证管花苷b的抗炎作用,具体的实验方法和结果如下:

一、实验方法

(1)制备牛ⅱ型胶原蛋白乳化剂

取0.572ml冰醋酸,加水至100ml,用0.22μm滤径滤膜过滤除菌后备用。称取36mg牛ⅱ型胶原蛋白,溶于6ml0.1m醋酸中,制备成6mg/ml牛ⅱ型胶原蛋白溶液。将弗氏完全佐剂与牛ⅱ型胶原蛋白在15ml离心管中按照1:1的比例充分混悬制成3mg/ml胶原蛋白弗氏完全佐剂乳化剂。具体方法为:在15ml离心管预先加入弗氏完全佐剂,将匀浆器探头深入佐剂液面以下开始工作,同时逐滴加入胶原蛋白溶液,使弗氏完全佐剂与胶原蛋白溶液充分混悬乳化,弗氏完全佐剂与胶原蛋白溶液的终比例为1:1;滴加完胶原蛋白溶液后继续用匀浆器混悬5min,检查乳化状态。乳化情况判断为:乳液滴入清水中,乳液不分散,即乳化情况良好,可以用于注射;否则,可向乳液中再滴加少许弗氏完全佐剂,继续匀浆乳化。用相同的方法可制备1.5mg/ml弗氏不完全佐剂乳化剂。

(2)胶原诱导型大鼠分组与造模

采用二次免疫法建立胶原诱导cia大鼠模型。将32只200±20gwistar大鼠分为对照组、模型组、管花苷b给药组、甲氨蝶呤组,每组8只。造模方法具体如下:除对照组外,其余三组wistar大鼠尾部及双后肢多点皮内注射共200μl牛ⅱ型胶原蛋白弗式完全佐剂乳化剂,第一次注射为初次免疫,记为第0天;初次免疫14天后,向wistar大鼠尾部皮内注射200μl牛ⅱ型胶原蛋白弗式不完全佐剂乳化剂,为二次免疫。初次免疫后第21天开始给药,对照组及模型组尾静脉注射1ml生理盐水;管花苷b给药组按20mg/kg给药剂量尾静脉注射1ml药物;甲氨蝶呤给药组按0.2mg/kg给药剂量尾静脉注射1ml药物。每2天给药一次,共给药5次,给药期间测量关节炎指数及足肿胀程度,末次给药2天后处死大鼠。

(3)关节炎指数及足肿胀程度检测

初次免疫后第21天开始给药,每2天给药一次;第一次给药后进行关节炎指数评分,每隔2天评分一次,末次给药后2天最后一次评分,然后处死大鼠,共评分6次。评分标准为:每只脚最多记4分,无肿胀记0分;踝关节出现红斑及轻微肿胀记1分;踝关节轻微肿胀伴随1-2跟脚趾肿胀记2分;踝关节肿胀伴随足掌轻微肿胀记3分;踝关节至足掌及各脚趾关节均重度肿胀记4分;四肢分数相加为关节评分总分,每只鼠最多记16分。每次评分后用游标卡尺测量双后肢足掌厚度,取两只足掌厚度平均值记录。

(4)大鼠组织病理学观察

划开右后肢膝关节部位,取下髌骨,暴露出膝关节腔体,可见淡黄色清亮滑膜组织,用眼科镊小心完整剥离滑膜组织,切2×2mm小块置于10%中性福尔马林固定24h后梯度乙醇脱水,石蜡包埋、切片、he染色。

(5)大鼠血清炎症因子测定

取1ml10%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠后打开胸腔,用5ml注射器插入心脏,取心脏血约4ml置于普通15ml灭菌离心管,取出后4℃保存过夜;第二日3000rpm离心15min后取上层血清。将酶联免疫吸附测定试剂盒内试剂及抗体包被的96孔板室温平衡60min,检测时设置标准品孔、样本空及空白孔,标准品孔中各加入不同浓度的标准品50μl,样本孔中加入大鼠血清50μl,空白孔中加入样本稀释液50μl;在空白孔、标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μl,用封板膜封住反应孔,37℃恒温箱孵育60min;弃去液体,用洗涤液洗板5次;吸干洗涤液后,每孔加入显色底物a、b各50μl,37℃避光孵育15min;每孔加入终止液50μl,在450nm处检测各孔od值。以标准品浓度作横坐标,对应的od值作纵坐标,绘制标准品线性回归曲线,按照拟合曲线,计算各孔od值对应浓度。

二、实验结果

(1)管花苷b减轻cia大鼠关节炎症状

如图1中显示,在给药5次后,管花苷b给药组与甲氨蝶呤(阳性药物)给药组两组大鼠足掌肿胀程度均大幅减轻,两组足掌厚度均下降;初次给药后第10天,测得管花苷b组与甲氨蝶呤组大鼠足掌厚度已与正常组相当;而模型组大鼠足掌厚度呈上升趋势,肿胀症状有加重趋势,管花苷b组及甲氨蝶呤组与模型组在足掌厚度上存在显著性差异。给药后,管花苷b组大鼠与甲氨蝶呤组大鼠关节炎指数评分均呈现下降趋势,至初次给药后第10天,甲氨蝶呤组关节炎指数评分平均值已低于2分,管花苷b给药组关节炎指数评分平均值为2.1分,而模型组大鼠关节炎指数呈上升趋势,至初次给药后第10天,模型组大鼠关节炎指数评分平均值达8分,管花苷b给药组及甲氨蝶呤给药组与模型组之间在关节炎指数上存在显著性差异。实验结果表明,管花苷b可减轻cia大鼠关节炎症状。

(2)滑膜组织学观察

图2展示了各组大鼠在实验后滑膜组织的病理图片,模型组组织切片he染色显示,胶原诱导型大鼠的滑膜组织边缘存在大量炎性细胞浸润,中性粒细胞及嗜酸性粒细胞大量增殖侵入滑膜组织管花苷b组与甲氨蝶呤组大鼠滑膜组织边缘炎性细胞浸润现象均有所减少。实验结果表明,管花苷b可减轻cia大鼠滑膜组织炎症。

(3)管花苷b对cia大鼠炎症因子的影响

管花苷b及甲氨蝶呤可降低胶原诱导关节炎大鼠血清中炎症因子水平。与正常组相比,胶原诱导关节炎大鼠的血清il-6、il-1β、tnf-α、rankl、peg2水平均显著升高;如图3a~e中,正常组与模型组在上述炎症因子蛋白水平上存在显著性差异;管花苷b与甲氨蝶呤组大鼠血清il-6、il-1β、tnf-α、rankl均有显著下降,管花苷b组peg2与模型组相比有轻微下降,甲氨蝶呤组peg2与模型组无显著性差异。

管花苷b及甲氨蝶呤可降低炎症因子转录水平。如图3f~i中,与空白组相比,模型组滑膜组织中il-1β、il-6、tnf-α、mmp-1转录水平均有显著上升,管花苷b与甲氨蝶呤均能降低滑膜组织中il-1β、il-6、tnf-α、mmp-1转录水平。

实施例2

本实施例从细胞水平进一步探究管花苷b的抗炎作用,具体的实验方法和结果如下:

一、实验方法

(1)mh7a细胞炎症模型造模及给药

将mh7a细胞传入6孔板中,当细胞汇合度到70%~80%时,给予0.1%dmso为空白对照组,给予20ng/mltnf-α刺激为模型组,给予20ng/mltnf-α刺激后分别给予25、50、100mg/ml管花苷b治疗为低、中、高三个治疗组。

(2)炎症基因转录水平检测

收集细胞,使用rna试剂盒提取总rna,cdna逆转录。利用合成的引物在forget-me-nottmqpcrmastermix进行pcr分析,将靶基因的mrna水平标准化为gapdh,并进一步标准化为阴性对照。各组实验数据先以内参gapdh的表达水平均一化后再与阴性对照组比较。最后表达水平的差异通过公式(2-δδct)进行相对定量。

(3)蛋白水平检测

收集各组细胞,使用裂解液(包括20mmtris,150mmnacl,1%tritonx-100,1mmedta,1mmegta,0.1%sds)并补充1mmpmsf进行裂解。通过sds-page分离蛋白并转移到聚偏二氟乙烯膜,5%脱脂乳封闭1h,相应的抗体孵育,使用ecl试剂显影,曝光扫描存档。

二、实验结果

(1)管花苷b降低mh7a细胞炎症因子转录

如图4中,关节滑膜细胞mh7a在20ng/mltnf-α刺激下,成为高表达炎症因子的炎性滑膜细胞模型。通过qpcr检测,确定其高表达il-1β、il-6、adamts4、adamts5,且施用管花苷b之后可降低il-1β、il-6、adamts4、adamts5mrna水平。

(2)管花苷b抑制tak1磷酸化,抑制tak1及其下游蛋白活性

如图5中tnf-α刺激后,tak1磷酸化水平明显增高,显示其被激活,其所在的mapk信号通路也被激活从而激活nf-κb通路,调控炎症因子表达增加。tub给药后,抑制tak1磷酸化,抑制p38磷酸化,抑制p65入核,调控减少炎症因子表达。

实施例3

本实施例使用autodockvina1.1.2包进行分子对接以研究管花苷b和tak1之间的相互作用:

从rcsb蛋白质数据库检索tak1(pdbid:5v5n)的三维(3d)坐标。使用chembiodrawultra14.0绘制管花苷b的3d结构,并通过chembio3dultra14.0软件将其转换为3d结构。使用autodocktools1.5.6软件包生成对接输入文件。tak1活性位点的坐标为:centre_x:-10.937,centre_y:-50.494,centre_z:-16.733;size_x:24,size_y:26,size_z:22。其他参数均采用默认值。最后,选取打分值最高的构象用pymol1.7.6进行结果分析。

由图6可知,管花苷b具有结合tak1atp疏水口袋能力。从右侧的细节图可以看到,管花苷b可以与氨基酸残基lys158、ala107、arg44、asn114形成长为氢键作用,此外,与氨基酸残基tyr113、trp195、pro160、leu163、gly43、tyr106、met104、ala61和val50形成疏水相互作用力;管花苷b与tak1的结合能为-8.2kcal/mol;阳性对照药物tak1抑制剂taknib与tak1的结合能为-8.3kcal/mol,管花苷b与阳性药物tak1抑制剂taknib的结合能接近。

综上所述,化合物管花苷b具有tak1抑制激活性,可以用于制备tak1抑制剂药物。本领域内技术人员公认:tak1是丝裂源激活蛋白激酶激酶激酶(map3k)家族成员之一,可以介导炎症的发生发展;在细胞受细胞因子、神经递质、激素、细胞应激等外部刺激时,tak1被激活,介导下游转录调控因子入核,调控炎症因子转录;炎症因子异常与类风湿性关节炎及其他自身免疫病有密切联系。因此化合物管花苷b具有开发成治疗类风湿性关节炎、治疗自身免疫病、抗炎及免疫调节药物的前景。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述,但其只是作为范例,本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言,任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此,在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改,都应涵盖在本发明的范围内。

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