一种水痘-带状疱疹疫苗组合物及其制备方法和应用

本发明属于疫苗领域，特别涉及一种水痘-带状疱疹疫苗组合物及其制备方法和应用。

背景技术：

几乎所有儿童在长大成人前均感染过水痘-带状疱疹病毒（varicella-zostervirus,vzv），初次感染产生水痘，水痘自愈后病毒潜伏在神经节内，年龄老化或其他原因导致的细胞免疫应答削弱（如感染hiv或免疫抑制）会诱导体内病毒的再活化，从而导致带状疱疹的发生。

由日本人高桥理明（michiakitakahashi）开发的oka株减毒活疫苗1995年被fda批准用于接种儿童和成人预防水痘（接种量1000-5000pfu<空斑形成单位，plaqueformingunit>），之后广泛应用于全世界。后续的研究发现，oka株和野生型病毒一样会建立潜伏感染，进而同样可能导致带状疱疹的发生。

对既往感染vzv病毒的50岁以上人群一次性加强免疫高剂量oka株减毒活疫苗（接种量约20000pfu）可有效预防带状疱疹，默克公司（merk）相应产品zostavax2005年上市，对50-59，60-69以及70岁以上人群的保护率分别为70%，64%和38%左右。这种保护率随年龄增长的降低主要归因于伴随免疫系统老化出现的细胞免疫应答削弱。另外，由于相对于制备低滴度的水痘疫苗，技术方面制备和储存高病毒滴度的带状疱疹减毒活疫苗技术难度较大，国内疫苗企业尚无相关产品上市。

葛兰素史克（gsk）于2017年底上市的带状疱疹基因工程亚单位疫苗shingrix使用中国仓鼠卵巢细胞（chinesehamsterovary，cho）表达的保守性病毒糖蛋白e（ge）作为抗原，使用佐剂as01b有效增强针对vzv-ge特异的细胞免疫应答，使其在50岁以上健康人群中的保护率高达97.2%（对50-59，60-69和70岁以上人群保护率分别为96.6%，97.3%和91.3）且在包括hiv携带者在内的免疫缺陷人群中表现出了良好的安全性和有效性。as01b的关键成分qs21是一种仅能从南美皂角树（quillajasaponaria）的皂角苷经反向高效液相色谱提取的多糖混合物，目前无法人工合成，存在来源受限（全球年产量仅为600万人份<与其2018年销售量相符>且主要出产国智利已经开始限制对相关皂角树的采伐）、制备过程质量控制难度大（纯化组分为成分复杂的非单体、活性成分对温度敏感）、因具有溶血活性需要加入脱毒剂等严重局限性。另外根据shingrix的使用说明，其中的佐剂成分as01b在使用前需同抗原临时混合（bedsidemix），间接提示该脂质体佐剂系统用于疫苗时稳定性有待进一步提高。以上背景导致带状疱疹亚单位疫苗价格昂贵（150-200美元/针剂），但仍供不应求（2018年93.3%的疫苗在美国本土销售，目前美国以外基本有价无市）。

因此，如何进一步降低水痘疫苗接种导致罹患带状疱疹的风险，并增强细胞免疫应答，是一个需要解决的问题。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种水痘-带状疱疹疫苗组合物及其制备方法和应用，所述疫苗组合物用作水痘疫苗时不存在因疫苗接种导致潜在罹患带状疱疹的风险；同时可有效增强针对vzv-ge特异的细胞免疫应答，在用作带状疱疹亚单位疫苗时可有效降低疫苗成本、提高疫苗产量。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种水痘-带状疱疹疫苗组合物，所述疫苗组合物包含水痘-带状疱疹糖蛋白e（ge）、脂质纳米颗粒（lnp）、双链聚胞嘧啶核苷酸片段（polyi:c）和富含gc的单链寡聚脱氧核苷酸片段（cpgodn），或包含ge、lnp和cpgodn。

进一步的，所述ge为使用中国仓鼠卵巢细胞（cho）分泌表达制备的病毒糖蛋白e的亲水性胞外区。

进一步的，所述lnp是由包含4-(n,n-二甲基氨基)丁酸（二亚油基）甲酯（mc3）在内的阳离子脂质体、二硬脂酰基磷脂酰胆碱（dspc）、胆固醇（cholesterol）和1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000（dmg-peg2000）组成的混合物。

进一步的，所述polyi:c的平均分子量在0.2kb-8kb之间。

进一步的，所述cpgodn包括a、b、c三类，具体形式包括天然结构和硫代氧化形式。

进一步的，单针剂的疫苗组合物中各原料的含量分别为：

进一步的，所述疫苗组合物为直径介于20～400纳米的颗粒组合物。

进一步的，所述疫苗组合物的施用方式包括皮下或肌肉注射。

本发明的另一方面：

所述水痘-带状疱疹疫苗组合物是采用微流控设备制备得到的。

所述水痘-带状疱疹疫苗组合物的应用，所述疫苗组合物用于制备预防或改善水痘和/或带状疱疹和/或带状疱疹后神经痛的药物。

本发明相比现有技术的有益效果为：

1、本发明所述水痘-带状疱疹疫苗组合物用作水痘疫苗时，不存在因疫苗接种导致潜在罹患带状疱疹的风险；

2、本发明所述的水痘-带状疱疹疫苗组合物中，利用lnp制备成脂质纳米颗粒：①可有效促进抗原提呈细胞吞噬和高效递送抗原，并实现疫苗的缓释持续刺激机体产生针对vzv-ge特异的细胞免疫应答；②可避免通过加入硫酸卡那霉素和氯化钙的方式提升polyi:c的稳定性而在疫苗中引入本该严格控制的抗生素；③脂质纳米颗粒包裹的非硫代氧化形式cpgodn可有效避免核酸酶的降解，可以起到同成本较高的硫代氧化形式cpgodn近似的效果（两者在体内裸露形式的半衰期分别为5-10min和30-60min）；另一方面，在被提呈细胞吞噬前逃逸出的非硫代氧化形式cpgodn可迅速被体内的核酸酶降解，从而有效避免了cpgodn从疫苗注射部位非特异性扩散可能引起的系统性炎症副作用，符合安全佐剂“局域性”和“一过性”的特点；

3、本发明所述的水痘-带状疱疹疫苗组合物，使用的polyi:c可被分布于内吞体内的tlr3摄取，进而促进相应树突状细胞的成熟和起始下游的细胞免疫应答。逃逸至细胞质中的短链（＞20bp）和长链（＞1kb）polyi:c可能分别激活胞浆中的retinoicacid-induciblegene1（rig-i）和melanomadifferentiation-associatedprotein5（mda5）抗病毒天然免疫应答通路进而触发相应的获得性免疫应答；

4、本发明所述的水痘-带状疱疹疫苗组合物中，cpgodn可被分布于内吞体内的tlr9摄取，导致干扰素的大量分泌，并通过促进抗原的交叉提呈有效活化抗原特异性cd8+t细胞。其中cpgodn的a类可刺激树突状细胞产生i型干扰素、活化自然杀伤细胞，b类可快速从早期内体转移至晚期内体、刺激b细胞增殖、刺激浆细胞样树突状细胞成熟和tnf-α、il-6及il-12的产生，c类兼具a类和b类的作用特点、平衡促进体液免疫和细胞免疫应答。逃逸至细胞质中的可形成局部茎环结构的c型cpgodn则可能通过激活cyclicgmp-ampsynthase（cgas）继而通过stimulatorofifngenes（sting）天然免疫通路，诱导相关获得性免疫应答；

5、本发明所述的水痘-带状疱疹疫苗组合物中，同时利用polyi:c与cpgodn，两者在诱导抗原特异的细胞免疫应答方面具有很好的协同作用；

6、本发明所述的水痘-带状疱疹疫苗组合物中的cpgodn，既可使用硫代氧化形式，也可利用天然结构形式；其中非硫代氧化形式cpgodn相较于硫代氧化形式cpgodn成本极其低廉，包裹入plga避免核酸酶水解后可获得通过化学修饰引入硫代氧化基团来抵抗酸酶水解的昂贵的硫代氧化形式cpgodn相近的免疫刺激效果；

7、本发明所述的水痘-带状疱疹疫苗组合物，经动物实验证实能特异性增强针对水痘-带状疱疹糖蛋白e的体液免疫应答并中和病毒，可用作水痘疫苗；因诱导针对水痘-带状疱疹糖蛋白e的细胞免疫应答，可用作带状疱疹疫苗；本发明通过使用lnp包裹polyi:c和cpgodn避免核酸酶降解进一步降低核酸佐剂的用量和成本，并且所述疹疫苗组合物中包括抗原、载体和核酸佐剂可一起冻干，进一步降低了疫苗生产和包装成本。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：

图1、图2分别为实施例1~4及对比例2~4制备的脂质纳米颗粒疫苗ge浓度和ge包封率的结果图；

图3、图4分别为实施例1~4及对比例2~4制备的脂质纳米颗粒疫苗核酸浓度和核酸包封率的结果图；

图5为实施例1~4及对比例2~4制备的脂质纳米颗粒疫苗的粒径检测结果图；

图6为实施例1~4及对比例2~4制备的脂质纳米颗粒疫苗的多分散性指数结果图；

图7-图11为实施例1~4及对比例1~4制备疫苗经检测所得特异性针对ge抗原的igg抗体生成情况和病毒中和能力等体液免疫应答情况结果图；

图12-图15为实施例1~4及对比例1~4制备疫苗经检测所得特异性针对ge抗原分泌ifn-γ和il-2的细胞数量结果图。

具体实施方式

按照下表1中单针剂疫苗组成，直接混合制备非纳米颗粒非核酸佐剂疫苗（对比例1）投料100%；lnp脂质纳米颗粒疫苗（实施例1~4及对比例2~4）ge投料150%，核酸佐剂投料160%计算20针剂疫苗投料。

实施例1

本实施例提供了一种水痘-带状疱疹疫苗组合物，制备方法为：

按照mc3:dspc:cholesterol:dmg-peg2000摩尔比为50:10:37.5:2.5称取脂质后溶解于无水乙醇，形成溶液a；将0.3毫克ge、0.125毫克cpgbw006、0.125毫克cpg2395和0.125毫克lmwpolyi:c溶于100mm，ph4.0的柠檬酸缓冲液，形成溶液b；使用微流体纳米药物制造系统（加拿大precisionnanosystems公司nanoassemblrignite）按照溶液a：溶液b体积比1：3混合，即得水痘-带状疱疹疫苗组合物lnp-bw006+2395+polyi:c-ge。

实施例2

本实施例提供了一种水痘-带状疱疹疫苗组合物，制备方法为：

按照mc3:dspc:cholesterol:dmg-peg2000摩尔比为50:10:37.5:2.5称取脂质后溶解于无水乙醇，使用微流体纳米药物制造系统按照体积比1：3的比例混合溶解有0.3毫克ge和0.4毫克cpgbw006（合成自上海生工生物工程有限公司）的100mm，ph4.0的柠檬酸缓冲液，即得lnp-bw006-ge。

实施例3

本实施例提供了一种水痘-带状疱疹疫苗组合物，制备方法为：

按照mc3:dspc:cholesterol:dmg-peg2000摩尔比为50:10:37.5:2.5称取脂质后溶解于无水乙醇，使用微流体纳米药物制造系统按照体积比1：3的比例混合溶解有0.3毫克ge和0.4毫克cpg2395（合成自上海生工生物工程有限公司）的100mm，ph4.0的柠檬酸缓冲液，即得lnp-2395-ge。

实施例4

本实施例提供了一种水痘-带状疱疹疫苗组合物，制备方法为：

按照mc3:dspc:cholesterol:dmg-peg2000摩尔比为50:10:37.5:2.5称取脂质后溶解于无水乙醇，使用微流体纳米药物制造系统按照体积比1：3的比例混合溶解有0.3毫克ge、0.2毫克cpgbw006和0.2毫克cpg2395的100mm，ph4.0的柠檬酸缓冲液，即得lnp-bw006+2395-ge。

对比例1

本对比例提供了一种非纳米颗粒非核酸佐剂疫苗，制备方法为：

称取cho表达的ge胞外区糖蛋白（购自普健生物科技有限公司）0.2毫克，溶解于0.5毫升pbs，与等体积铝佐剂（购自thermofisher）混匀，即得混合制备组alum+ge。

对比例2

本对比例提供了一种lnp脂质纳米颗粒疫苗，制备方法为：

按照mc3:dspc:cholesterol:dmg-peg2000（购自上海艾韦特医药科技有限公司）摩尔比为50:10:37.5:2.5称取脂质后溶解于无水乙醇，使用微流体纳米药物制造系统按照体积比1：3的比例混合100mm，ph4.0的柠檬酸缓冲液，即得lnp对照。

对比例3

本对比例提供了一种lnp脂质纳米颗粒疫苗，制备方法为：

按照mc3:dspc:cholesterol:dmg-peg2000摩尔比为50:10:37.5:2.5称取脂质后溶解于无水乙醇，使用微流体纳米药物制造系统按照体积比1：3的比例混合溶解有0.3毫克ge的100mm，ph4.0的柠檬酸缓冲液，即得lnp-ge。

对比例4

本对比例提供了一种lnp脂质纳米颗粒疫苗，制备方法为：

按照mc3:dspc:cholesterol:dmg-peg2000摩尔比为50:10:37.5:2.5称取脂质后溶解于无水乙醇，使用微流体纳米药物制造系统按照体积比1：3的比例混合溶解有0.3毫克ge和0.4毫克lmwpolyi:c（购自invivogen）的100mm，ph4.0的柠檬酸缓冲液，即得lnp-polyi:c-ge。

针对以上实施例1~4以及对比例1~4制备得到的各疫苗，进行如下测定：

一、ge浓度

粒径和多分散性指数lnp纳米颗粒疫苗于0.1m氢氧化钠和0.1%（w/v）的十二烷基硫酸钠缓冲液室温裂解过夜。使用二喹啉甲酸蛋白检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）检测ge浓度并计算蛋白荷载效率。

二、核酸浓度

粒径和多分散性指数lnp纳米颗粒疫苗于0.1m氢氧化钠和0.1%（w/v）的十二烷基硫酸钠缓冲液室温裂解过夜。使用核酸检测试剂盒quant-itoligreenssdnaregentkit(购自thermofisher)检测核酸浓度并计算核酸荷载效率。

三、粒径和多分散性指数

使用纳米粒径检测仪zetasizernaozspariclesizeanalyzer（英国马尔文）检测lnp的粒径和多分散性指数。

结果参见下表2，同时如图1~6所示，实施例1使用微流体纳米药物制造系统制备的lnp脂质纳米疫苗ge的浓度在171-200微克/毫升之间（图1），荷载效率在85%-98%之间（图2）；核酸浓度在90-200微克之间（图3），荷载效率在35%-75%之间（图4）；纳米颗粒粒径在135-378纳米之间（图5），多分散性指数在0.245-0.345之间（图6）。

四、动物免疫

间隔两周，肌肉注射实施例1~4、对比例1~4制备的疫苗50µl免疫c57bl/6小鼠3次（8只/组，雌性，初免年龄6周，体重15-18g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司），终免2周后摘取脾脏，心脏取血4℃放置过夜后3500rpm离心20分钟取血清，准备进行后续免疫学分析。

五、抗体滴度检测

溶解于pbs的捕获抗原ge胞外区糖蛋白2µg/ml每孔100µl加入96孔酶标板（购自康宁），4℃过夜包被后tbst（0.05%tween20（sigma）inpbs）洗板1次，每孔200µl加入5%（w/v）溶于pbs的脱脂奶粉37℃封闭1h，弃掉牛奶后tbst洗4次，每孔100µl加入1%牛奶梯度稀释的上述二、核酸浓度计算时制备的抗血清37℃孵育1h，tbst洗5次后加入1%牛奶稀释的二抗（1:5000，goatanti-mouseigg:hrp购自biorad）37℃孵育1h，tbst洗5次后每孔加入100µl按照1:1比例配好的显色液（购自bd），室温下避光放置10分钟后，加入100µl1m磷酸终止反应，并于450nm处检测光吸收值。取od450＞0.1临界的血清稀释浓度作为抗体滴度，最大稀释倍数od450≤0.1定义为100。

六、荧光嗜斑减少的病毒中和检测

水痘-带状疱疹减毒株（购自长春百克生物科技股份公司）与稀释后的免疫血清37℃孵育1小时后加入含有mrc-5单层细胞（购自中国科学院昆明动物研究所细胞库）的96孔板（康宁）37℃孵育1小时后弃上清，dmem培养基清洗一次后继续加入无血清dmem培养基在维持5%co2的细胞培养箱37℃孵育16小时。弃上清并用pbs清洗后，加入预冷的80%（v/v）丙酮连同96孔板一起置-20℃10分钟，取出后加入2%（w/v）的脱脂奶粉37℃封闭1小时。弃上清并用pbs清洗3次后，加入1：250稀释的自制兔抗水痘-带状疱疹病毒血清37℃孵育1小时，加入1：100稀释的fitc标记的羊抗兔二抗（caymanchemicalcompany,usa)37℃孵育1小时，使用成像系统拍照（美国biotekcytation1imagingreader）。

如图7所示，脂质纳米颗粒包裹抗原即可产生24000的ge特异igg抗体，滴度为铝佐剂（4000）的6倍，脂质纳米颗粒加入核酸佐剂后诱导的最低ge特异igg抗体为64000(脂质纳米颗粒包裹抗原+cpg2395组)。如图11所示，ge特异igg抗体为128000的免疫血清（脂质纳米颗粒包裹抗原+cpgbw006+cpg2395组）按1：80稀释后，仍能完全阻断病毒对细胞的感染。如图8所示，所有含有抗原的疫苗组均产生了明显的ge特异igg1型抗体，但如图9所示，仅有含有核酸佐剂的脂质纳米疫苗产生了明显的ge特异igg2a型抗体。虽然核酸佐剂polyi:c（脂质纳米颗粒包裹抗原+polyi:c组）也诱导出了明显的ge特异igg2a型抗体(1000)，但其诱导产生的ge特异igg1型抗体滴度更高(16000)，类似铝佐剂和单独脂质纳米颗粒体现出th2型应答（图10）。

七、脾脏淋巴细胞分离

上述四、动物免疫部分制备的脾脏置细胞过滤网（韩国，nest），加入ack红细胞裂解液室温放置5分钟，1800转/分钟离心后细胞计数，并使用含有10%胎牛血清（购自bi）和双抗的1640培养基（购自thermofisher）重悬为3×10⁶细胞/毫升。使用时100μl/孔细胞加入96细胞培养板孔板（购自康宁）至最终细胞量3×10⁵细胞/孔。

八、酶联免疫斑点实验(enzymelinkedimmunospotassay，elispot)

il-2及ifn-γ检测试剂盒均购自bd，并按照说明书进行操作，具体步骤如下：包被液稀释捕获抗体后100μl/孔加入elispot平板，4℃包被过夜后弃包被液，200μl/孔封闭液洗板1次，每孔200μl加入封闭液室温封闭2h，弃封闭液后加入含有10μg/ml终浓度ge或肽库(见表3)的1640完全培养基100μl并加入上述脾脏淋巴细胞分离中得到的等体积稀释好的脾脏细胞(3×10⁶细胞/毫升)37℃细胞培养箱过夜。800g离心5分钟后弃上清，200μl/孔去离子水清洗2次(每次浸泡5分钟)，200μl/孔清洗液1清洗3次，100μl/孔加入经稀释液稀释的检测抗体室温孵育2小时后，200μl/孔清洗液1清洗3次(每次浸泡2分钟)，100μl/孔加入经稀释液稀释的酶偶合物streptavidin-hrp室温孵育1小时，200μl/孔清洗液1清洗4次(每次浸泡2分钟)，200μl/孔清洗液2清洗2次后加入100μl底物溶液反应至合适时间，去离子水清洗终止反应。晾干后使用elispot读板仪器(德国aiddiagnostikagmbh)斑点计数。

表3肽库组分

如图12~15所示，相对于多肽的刺激，ge本身刺激脾脏细胞产生干扰素γ的能力更强，类似的趋势也可见于il-2。相对于其出色的体液免疫应答促进能力，核酸佐剂cpgbw006刺激细胞免疫应答的能力较弱，而核酸佐剂cpg2395刺激细胞免疫应答的能力相较于其促进体液免疫应答的能力来说更强。polyi:c刺激产生体液免疫应答和细胞免疫应答的能力均较强，但其产生的免疫应答更偏th2型，且在脂质纳米颗粒中的荷载能力较差。

本发明具体实施例部分统计分析，使用graphpadprism7.0软件，采用unpairedttest和one-wayanova方法对以上实施例及对比例所得数据进行统计学分析，其中p≥0.05为无显著差异，标注为ns；显著差异中p＜0.05标示为*，p＜0.01标示为**；p＜0.001标示为***，p＜0.0001标示为****。

最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。