鹅去氧胆酸或其衍生物在制备EGFR和/或STAT3的抑制剂中的用途的制作方法

本发明涉及医药
技术领域：
，具体涉及鹅去氧胆酸或其衍生物在制备egfr和/或stat3的抑制剂中的用途。
背景技术：
：egfr(epidermalgrowthfactorreceptor，简称为egfr、erbb-1或her1)是表皮生长因子受体(her)家族成员之一。该家族包括her1(erbb1，egfr)、her2(erbb2，neu)、her3(erbb3)及her4(erbb4)。egfr是一种糖蛋白，是表皮生长因子(egf)细胞增殖和信号传导的受体，属于酪氨酸激酶型受体，细胞膜贯通，位于细胞膜表面。在配体与表皮生长因子受体(egfr)结合后，受体发生了二聚作用，二聚作用既包括两个同种受体分子的结合(同源性二聚作用)，也包括人类egf相关性受体(her)酪氨酸激酶家族中的不同成员的结合(异源性二聚作用)。egfr二聚后可以激活它位于细胞内的激酶通路，包括y992,y1045,y1068,y1148和y1173等激活位点。这个自磷酸化可以引导下游的磷酸化，包括mapk，akt和jnk通路,诱导细胞增殖。egfr与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。研究表明在许多实体肿瘤中存在egfr的高表达或异常表达。egfr的过表达或突变激活涉及许多人类恶性肿瘤的发展和进展。信号转导与转录激活因子(signaltransducerandactivatoroftranscription，stat)蛋白家族是一组被细胞因子受体激活的相关蛋白，参与增殖、分化、凋亡以及免疫调节等重要的生物学进程。目前已知stats家族有6个成员(stat1-6)，其中stat3在多种恶性肿瘤中异常表达并持续活化，直接或间接调控多种癌基因从而影响肿瘤的发生和发展，并与肿瘤干细胞的维持和自我更新及放化疗抵抗关系密切。stat3信号通路的激活途径主要有三类:经典的jak-stat3信号通路；受体依赖性酪氨酸激酶(rtks)途径；非受体依赖性酪氨酸激酶(no-receptorrtks)途径。当被上游信号激活并磷酸化后，stat3聚合成同源或异源二聚体，进入胞核与靶基因启动子特定位点结合促进其转录。正常的stat3激活是快速而短暂的，仅维持数分钟到几小时，但在多种肿瘤中存在stat3持续性过度活化并诱导与细胞增殖、分化、凋亡密切相关的基因异常表达。研究发现许多致癌信号通路最终都集中在一套核转录因子上，靶向单一的转录因子即可阻断一群上游基因变化引起的持续激活，转录因子是抑癌的理想靶点；stat3是肿瘤多个关键信号通路及基因调控中的“关节点”，因此stat3已成为癌症治疗上最有希望的靶点之一。目前，已经开发了许多小分子以靶向egfr或stat3的抑制剂。这些抑制剂中部分已被批准用于临床应用。然而，还未有相关研究报道过鹅去氧胆酸或其衍生物在制备egfr和/或stat3的抑制剂中的用途。技术实现要素：因此，本发明要解决的技术问题在于鹅去氧胆酸或其衍生物在制备egfr和/或stat3的抑制剂中的用途。为此，本发明提供了如下的技术方案：鹅去氧胆酸或其衍生物在制备egfr和/或stat3的抑制剂中的用途。在所述的用途中，所述抑制剂为拮抗剂。可选的，鹅去氧胆酸或其衍生物调控egfr蛋白和/或stat3蛋白的表达水平降低。可选的，鹅去氧胆酸或其衍生物与egfr蛋白和/或stat3蛋白结合，阻断egfr蛋白和/或stat3蛋白激活，下调egfr蛋白和/或stat3蛋白磷酸化水平。可选的，鹅去氧胆酸或其衍生物调控egfr蛋白和stat3蛋白的总蛋白表达水平降低。本发明提供了鹅去氧胆酸或其衍生物在制备预防或治疗与egfr和/或stat3相关的疾病的药物中的用途。可选的，所述疾病包括肿瘤或免疫炎性疾病；可选的，所述肿瘤包括但不限于肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、脑胶质瘤、骨癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈部肿瘤、淋巴瘤、结直肠癌、前列腺癌或白血病等癌症；所述的免疫性疾病包括但不限于银屑病、神经性皮炎、特应性皮炎、硬皮病、多发性神经炎、红斑狼疮、肌萎缩侧索硬化症、多发性硬化、阿尔兹海默症、血管性痴呆、系统性血管炎、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、脓毒症、类风湿关节炎等免疫炎症相关疾病。本发明提供了鹅去氧胆酸或其衍生物与索拉菲尼联合在制备预防或治疗癌症的药物中的用途。本发明提供了一种药物组合物，包括鹅去氧胆酸或其衍生物和索拉菲尼；可选的，所述药物组合物中，鹅去氧胆酸浓度为1μg/ml，索拉菲尼浓度为5μm。本发明提供了一种egfr和/或stat3抑制剂，以鹅去氧胆酸或其衍生物为活性成分；可选的，还包括药学上可接受的载体。本发明技术方案，具有如下优点：1.本发明提供的鹅去氧胆酸或其衍生物在制备egfr和/或stat3的抑制剂中的用途，经过实验证明鹅去氧胆酸是egfr与stat3两个肿瘤靶点的双重拮抗剂，可用于开发这两个明确靶点相关疾病的治疗或协同治疗，如肿瘤和免疫炎性疾病，肿瘤如肝癌、肺癌、乳腺癌，免疫炎性疾病如银屑病。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本发明实施例1中的质谱分析参数设置；图2是本发明实施例2中的试验结果；图中1为hepg2蛋白、2为hepg2磁珠分离上清、3为hepg2磁珠分离后蛋白、4为hepg2对照磁珠分离后蛋白；图3是本发明实施例3中的spr原理图；图4是本发明实施例3中cm5芯片固定egfr蛋白结果；图5是本发明实施例3中鹅脱氧胆酸与egfr蛋白亲和力测定曲线；图6是本发明实施例3中鹅脱氧胆酸与egfr蛋白亲和力拟合曲线结果；图7是本发明实施例4中鹅去氧胆酸对egfr、stat3蛋白表达的影响结果；图中1-4为正常培养，5-8为加鹅去氧胆酸；图8是本发明实施例5中咪喹莫特诱导小鼠1-7天的pasi评分趋势；图9是本发明实施例5中各组小鼠的小鼠皮损的变化情况；图10是本发明实施例5中各组小鼠的he检测结果；图11是本发明实施例5中小鼠组织wb检测结果；图12是本发明实施例6中wb检测结果；图13是本发明实施例7中实验结果；图中1为a549、2为a549+cdca、3为hepg2、4为hepg2+cdca、5为huvec、6为huvec+cdca、7为mda231、8mda231+cdca，9为mcf-7、10为mcf-7+cdca。具体实施方式提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。实施例1鹅去氧胆酸结合蛋白分离包括如下步骤：1.将鹅去氧胆酸偶联到磁珠上获得磁珠-鹅去氧胆酸1.1取适量nhs-磁珠，置于磁性分离架上，待上清与沉淀完全分离后吸取并丢弃上清液。1.2向磁珠中加入两倍体积的washingbuffera，重悬15s，置于磁性分离架上，待上清与沉淀完全分离后吸取并丢弃上清液。1.3向磁珠中加入与磁珠等体积的待偶联蛋白/药物(在本实施例中为鹅去氧胆酸)，重悬30s，室温放置1h。若观察到磁珠沉淀，则再次重悬(手摇即可)。室温放置结束后放入4℃冰箱放置1h。1.4、4℃放置结束后，置于磁性分离架上，待上清与沉淀完全分离后，收集上清液做好标记，上清液4℃保存。1.5向磁珠中加入两倍体积的blockingbuffer，重悬30s，置于磁性分离架上，待上清与沉淀完全分离后吸取并丢弃上清液。此步骤重复4次。1.6、向磁珠中加入两倍体积的blockingbuffer，重悬30s，室温放置2h。若观察到磁珠沉淀，则再次重悬(手摇即可)。1.7、室温放置结束后，置于磁性分离架上，待上清与沉淀完全分离后吸取并丢弃上清液。1.8、向磁珠中加入两倍体积的水，充分混合，置于磁性分离架上，待上清与沉淀完全分离后吸取并丢弃上清液。1.9、向磁珠中加入两倍体积的1xpbs，充分混合，置于磁性分离架上，待上清与沉淀完全分离后吸取并丢弃上清液。1.10、向磁珠中加入与磁珠等体积的1xpbs，充分混合，放入4℃冰箱保存。4℃保存过夜后的磁珠可在后续试验中使用。2.细胞培养总蛋白提取2.1肝癌细胞株hepg2细胞复苏：42℃水浴在1min内快速溶解冻存细胞，放置于t-25培养瓶培养，其中大鼠脑微血管内皮细胞(rbmec)需先用预铺多聚赖氨酸的t-25培养皿进行培养；2.2细胞日常维护：细胞复苏后24h更换新鲜生长培养基，待细胞密度增加至80％以上时，0.25％胰酶室温消化2min后加入生长培养基终止反应，1000rpm离心，细胞沉淀用冻存液重悬冻存细胞或用生长培养基重悬继续培养；2.3细胞收集：按常规消化终止后，用无菌pbs洗涤2次，弃上清直接保存细胞沉淀。2.4蛋白提取：按1mlpbs/107个细胞比例加入pbs，同时加入蛋白酶抑制剂。重悬细胞与缓冲液重复接触；冰上孵育30分钟后2000转/分离心20分钟收集上清置于-20℃或-70℃保存或直接进行后续实验。3.bca法蛋白定量3.1准备bca工作液a液：b液＝50:1；3.2每孔加入50ulbsa标准品，浓度分别为2000、1000、500、250、125、62.5、31.3、0ug/ml；3.3加样：样品用pbs进行稀释5-10倍，每孔50ul；3.4所有检测孔加入150ulbca工作液，混匀后37℃孵育50min；3.5酶标仪570nm波长下读取od值；3.6通过标准品浓度和od值软件自动计算样品中总蛋白浓度。4.蛋白分离4.1将100ul总蛋白提取液与化合物-磁珠按等体积充分混匀，4℃孵育30分钟，其中总蛋白浓度需4mg/ml以上。4.2通过磁力架分离磁珠1分钟，收集上清。4.3用pbs洗涤2次，每次磁力架分离磁珠1分钟。4.4弃pbs洗涤液，加入50ul体积的pbs备用。5蛋白电泳5.1上样缓冲液制备：根据样品体积加入4×lds和10×reducingagent(简称ra)缓冲液使lds和ra终浓度为1×，沸水浴变性5min。5.2待检测蛋白样品上样量：上10μl/孔，上样顺序为：marker、总蛋白、鹅去氧胆酸磁珠分离后蛋白、bsa磁珠分离后蛋白；5.3电泳条件：根据所检测蛋白大小选择电泳缓冲液，当蛋白大小>25kd时，选择mops缓冲体系，当蛋白大小<25kd时，选择mes缓冲体系。5.4恒压90v，约20min后恒压120v，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间。6.考马斯亮蓝染色6.1取出电泳凝胶，经超纯水漂洗(以下每步操作均需在摇床上进行)。6.2加入适量考马斯亮蓝染色液，充分覆盖凝胶即可，染色1-4个小时。6.3染色结束后移除染色液，加入等体积的脱色液，脱色1-8个小时，可根据条带调整时间。6.4脱色结束后用纯水浸泡凝胶，拍照或扫描保存图片，通过对比总蛋白与磁珠分离后的蛋白条带差异确认化合物是否分离获得与其结合的蛋白。6.5对电泳胶进行质谱鉴定，获得可能的结合蛋白，并通过免疫学法(免疫印迹或流式细胞技术)等技术可进一步验证化合物结合蛋白。7.质谱鉴定7.1样品制备：状态为分离蛋白胶条。7.2胶内酶解：样品脱色完全后冻干，加入40μltrypsinbuffer，37℃16-18h。7.3毛细管高效液相色谱每份样品采用纳升流速hplc液相系统easynlc1200进行分离。缓冲液：a液为0.1％(体积百分比)甲酸水溶液，b液为含0.1％(体积百分比)甲酸的乙腈溶液。色谱柱以95％(体积百分比)的a液平衡。样品由自动进样器上样到质谱预柱c18trapcolumn(c183μm0.10×20mm)，再经分析柱c18column(c181.9μm0.15×120mm)分离，流速为600nl/min。相关液相梯度如下表1：表1、液相梯度7.4质谱鉴定每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用qexactive质谱仪(thermosceientific)进行质谱分析。参数设置见附图1。7.5数据分析原始质谱数据质谱分析原始数据为raw文件，用软件sequest和proteomediscoverer(thermoscientific)进行搜库鉴定。搜库参数设置搜库时将raw文件通过proteomediscoverer提交至sequest服务器，选择已经建立好的数据库，然后进行数据库搜索。相关参数如下表2。表2、搜库参数结果过滤参数为：peptidefdr≤0.01。鉴定结果实验结果文件夹《质谱鉴定结果》内含“protein.xlsx”、“peptide.xlsx”，显示的是可视化报告。结论：经数据分析，挑选鉴定结果评分前20％的蛋白进行文献检索及相关性分析，最终挑以下蛋白为相关性最高的十种蛋白，见下表3。表3、鉴定结果实验结果注释表4-1protein(蛋白鉴定表格)表头及注释表4-2peptide(肽段鉴定表格)表头及注释实施例2鹅去氧胆酸结合蛋白的磁珠ip验证一、试验试剂：(见下表5)表5注：其他试剂为分析纯试剂配制二、试验仪器：(见下表6)表6三、试验方法1.细胞蛋白提取：细胞培养方法同实施例1中“2.细胞培养总蛋白提取”，按1mlpbs/107个细胞比例加入pbs，同时加入蛋白酶抑制剂。重悬细胞与缓冲液重复接触；冰上孵育30分钟后2000转/分离心20分钟收集上清置于-20度或-70度保存或直接进行后续实验。2.bca法蛋白定量2.1准备bca工作液a液：b液＝50:12.2每孔加入50ulbsa标准品，浓度分别为2000、1000、500、250、125、62.5、31.3、0ug/ml；2.3加样：样品用pbs进行稀释5-10倍，每孔50ul；2.4所有检测孔加入150ulbca工作液，混匀后37度孵育50min；2.5酶标仪570nm波长下读取od值；2.6通过标准品浓度和od值软件自动计算样品中总蛋白浓度。3.药物磁珠分离蛋白及wb检测3.1将200ug总蛋白提取液与等体积的药物-磁珠(磁珠-鹅去氧胆酸)充分混匀，4℃孵育60分钟，蛋白分离缓冲体系为pbs缓冲液。3.2通过磁力架分离磁珠1分钟，收集上清，作为ip上清。3.3用pbs洗涤2次，每次磁力架分离磁珠1分钟。3.4弃pbs洗涤液，通过磁力架将蛋白-鹅去氧胆酸-磁珠分离，蛋白-鹅去氧胆酸-磁珠沉淀用sds电泳上样缓冲液复溶，复溶体积为1/4总蛋白体积。4.wb检测4.1待检测蛋白样品上样量：每孔10ul；4.2上样顺序：总蛋白、磁珠上清、磁珠沉淀、对照磁珠沉淀4.3抗体稀释度总汇表(见下表7)表7名称厂家货号目的蛋白大小稀释比例种属egfrcst，2232，175kd1:1000兔stat3cst，1264079,86kd1:1000兔4.4蛋白抽提预冷ripa蛋白抽提试剂，加入蛋白酶抑制剂，在蛋白抽提开始前加入0.1mpmsf母液，pmsf终浓度1mm，同时加入蛋白酶抑制剂；细胞沉淀以1×107个细胞加入1ml裂解液，用枪头吹打充分悬起细胞，完成后在冰上孵育20min，4℃离心，13000rpm，20min。离心完成后取上清，分装保存，待测。4.5bca法蛋白定量准备bca工作液a液：b液＝50:1，稀释好各个提取bsa标准品；样品用pbs进行稀释5-10倍，加入150ulbca工作液，混匀后37℃孵育30min或者室温孵育60min，酶标仪570nm波长滤光片读取od值；4.6蛋白浓度调整：ripa调整蛋白浓度，加入4×还原样品缓冲液后样品终浓度为2mg/ml，煮沸变性5min。4.7目的蛋白wb检测实验待检测蛋白样品上样量：上10ug/孔；电泳条件：根据所检测蛋白大小选择电泳缓冲液，当蛋白大小>25kd时，选择mops缓冲体系，当蛋白大小<25kd时，选择mes缓冲体系；恒压90v，约20min后恒压120v，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间；快速转膜仪：自动程序，0.45um孔径pvdf膜，转膜时间12分钟；封闭：将膜完全浸没5％脱脂奶粉-tbs中室温轻摇30min；一抗孵育：用5％脱脂奶粉-tbs稀释一抗，室温孵育10min，放4℃过夜；第二天从4度拿出膜，在室温孵育30min；洗膜：tbst洗膜5次，每次3min；二抗孵育：用5％脱脂奶粉-tbs稀释二抗，山羊抗兔igg(h+l)hrp，1:20000，室温轻摇40min，洗膜：tbst洗膜6次，每次3min；用ecl浸润pvdf膜并反应3-5min，曝光仪分别曝光1s和60s。5.试验结果试验结果如图2所示，总蛋白和磁珠沉淀样本中目的条带呈阳性，则药物与靶点蛋白相互结合，磁珠沉淀样本中目的条带呈阴性，则药物不与靶点蛋白相互结合，磁珠上清中目的蛋白可能由于蛋白过量呈阳性，也可能呈阴性。对照磁珠沉淀中目的条带应呈阴性，弱阳性或比磁珠沉淀样本阳性弱。结论：药物鹅去胆酸是egfr和stat3蛋白的拮抗剂，可直接结合egfr与stat3蛋白。实施例3鹅去氧胆酸与egfr蛋白的spr实验1.表面等离子共振原理表面等离子共振(surfaceplasmonresonance,spr)原理是当入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质界面(比如玻璃表面的金或银镀层)时，可引起金属自由电子的共振，由于共振致使电子吸收了光能量，从而使反射光在一定角度内大大减弱。其中，使反射光在一定角度内完全消失的入射角称为spr角。spr随表面折射率的变化而变化，而折射率的变化又和结合在金属表面的生物分子质量成正比。因此可以通过获取生物反应过程中spr角的动态变化，得到生物分子之间相互作用的特异性信号(如图3所示)。2.目的本研究的目的是利用spr技术测定鹅脱氧胆酸与人egfr蛋白亲和力检测。3.材料3.1供试品信息：表8供试品及蛋白信息表8续表货号批号来样日期na15101020200727egr-h5222a1541-191015f1-bulk202007273.2设备耗材信息:biacoret200(gehealthcarelifesciences，ge)芯片seriesssensorchipcm5(货号：br-1008-30，ge)；3.3试剂信息:表9试剂信息表4.方法：4.1试剂配制运行试剂：含2mm磷酸二氢钾(kh2po4)，137mm氯化钠(nacl)，10mm十二水合磷酸氢二钠(na2hpo4.12h2o)，2.7mm氯化钾(kcl)，0.05％(体积)吐温-20(tween-20)，5％dmso；氨基偶联试剂盒(货号：br100050，ge)，其中包括：115mgn-羟基丁二酰亚胺(nhs)，750mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)和10.5ml1m乙醇胺(ph8.5)。将每管edc和nhs分别加入10ml的去离子水，分装保存到-18℃至更低温度，保质期两个月。(参考ge氨基偶联指导手册《22-0510-62ag》)。4.2芯片制备将egfr蛋白用固定试剂(10mm醋酸钠，ph4.5)稀释到30μg/ml。首先，cm5芯片的表面用400mmedc和100mmnhs以10μl/min的流速进行420s的活化。其次，将30μg/ml的egfr蛋白以10μl/min的流速注入到实验通道(fc4)固定量约为10000ru(共振信号)。最后，芯片用1m乙醇胺以10μl/min进行420s封闭。参比通道(fc3)与试验通道(fc4)进行相同的操作。4.3溶剂矫正配置4.5％和5.8％dmso(表10)及校正曲线(表11)进行溶剂矫正。表10、4.5％和5.8％dmso配置方法表11校正曲线配置方法4.4分析物多循环分析将鹅脱氧胆酸先用稀释缓冲液(1×pbs,0.05％tween20)稀释20倍使其dmso含量变为5％，再用运行试剂(1×pbs,0.05％tween20,5％dmso)进行稀释，浓度分别为500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、0μm。将稀释后的鹅脱氧胆酸依次以30μl/min的流速注入到实验通道与参比通道，结合时间为60s，解离时间为90s。4.5其他：所有的操作步骤均在运行试剂中进行，spr的分析试剂均需过滤脱气使用。5.结果数据分析:使用biacoret200分析软件计算每个抗体的kd值，见下表12。参比通道(fc3)用于背景的扣减。cm5芯片固定egfr蛋白结果见图4，鹅脱氧胆酸与egfr蛋白亲和力测定曲线以及拟合曲线结果见图5和图6。表12鹅脱氧胆酸与egfr蛋白亲和力测试结果6.结论egfr作为肿瘤最热门靶点，选用spr实验再验证。所选egfr为商业化蛋白，此蛋白为重组蛋白，所表达区域为胞外配体结合域。实验结果证明：使用biacoret200检测鹅脱氧胆酸与人egfr蛋白胞外配体结合域可直接结合，其发挥药物活性的机制进一步明确为结合egfr蛋白胞外配体结合域从而阻断egfr激活而发挥药物活性。实施例4鹅去氧胆酸对egfr、stat3蛋白表达的影响细胞培养方法同实施例1中“2.细胞培养总蛋白提取”1.1细胞分组1.1.1细胞系：hepg2(人肝癌细胞系)经常规消化终止后调整细胞密度为1×106个/ml，铺于100mm直径的细胞培养皿内，10ml/皿，继续常规培养24h。1.1.2细胞汇合度达到60-70％时，弃原培养基，更换含5μg/ml鹅去氧胆酸的培养基，同时设置正常培养组，继续培养1h；1.1.3细胞收集：按常规消化终止后，用无菌pbs洗涤2次，弃上清直接保存细胞沉淀。1.2蛋白提取1.2.1预冷ripa蛋白抽提试剂，在蛋白抽提开始前加入0.1mpmsf母液，pmsf终浓度1mm，同时加入蛋白酶和磷酸化蛋白酶抑制剂；1.2.2细胞沉淀以适量裂解液重悬，冰浴30min；1.2.34℃10000rpm离心10min，收集上清，即为总蛋白，分装保存，待测。1.3bca法蛋白定量1.3.1准备bca工作液a液：b液＝50:11.3.2每孔加入25ulbsa标准品，浓度分别为2000、1000、500、250、125、62.5、31.3、0ug/ml；1.3.3加样：样品用pbs进行稀释5-10倍，每孔25ul；1.3.4所有检测孔加入150ulbca工作液，混匀后37度孵育30min；1.3.5酶标仪570nm波长下读取od值；1.3.6通过标准品浓度和od值软件自动计算样品中总蛋白浓度。1.4wb检测1.4.1蛋白浓度调整：计算调整蛋白浓度，加入4×lds和10×ra缓冲液使各样品浓度值相同，沸水浴变性5min。1.4.2待检测蛋白样品上样量：每孔10ul，含13ug蛋白；1.4.3电泳条件：根据所检测蛋白大小选择电泳缓冲液，当蛋白大小＞25kd时，选择mops缓冲体系，当蛋白大小存在＜25kd时，选择mes缓冲体系；恒压90v，约20min后恒压120v，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间；1.4.4湿转法，转膜条件：0.45um孔径pvdf膜，使用前于甲醇和平衡液中充分浸泡；蛋白分子量＞90kd时，转膜仪设置为long模式，30kd＜蛋白分子量＜90kd时，转膜仪设置为stand模式，蛋白分子量＜30kd时，转膜仪设置为short模式；1.4.5封闭：将膜完全浸没于5％脱脂奶粉-tbs中室温轻摇30min；1.4.6一抗孵育：膜浸于5％脱脂奶粉-tbs稀释的一抗中，做好对应记录，室温孵育30min，放4℃过夜；表13、抗体稀释度总汇表名称厂家货号目的蛋白大小稀释比例种属egfrcst，2232，175kd1:1000兔p-egfrcst,3777175kd1:1000兔stat3cst,1264079,86kd1:1000兔p-stat3cst,914579,86kd1:1000兔1.4.7第二天从4℃拿出膜，在室温孵育30min，洗膜：tbst洗膜3次，每次5min；1.4.8二抗孵育：膜浸于5％脱脂奶粉-tbs稀释的二抗中，稀释比例1:5000，室温轻摇1-4h，洗膜：tbst洗膜3次，每次5min；1.4.9ecl加到pvdf膜上后避光反应3-5min，eblot曝光仪进行曝光，曝光时间分别为1s和60s；1.4.10选择合适曝光时间的图片，通过imagej软件进行灰度值分析。1.5内参蛋白wb正式实验1.5.1strippingbuffer洗膜，37℃洗膜30min(如果目的蛋白与内参蛋白分子量相差在10k以上，可以不用strippingbuffer洗膜这一步)；1.5.2洗膜：去离子水洗膜3次；1.5.3洗膜：tbst洗膜3次，每次3min；1.5.4将膜完全浸没5％脱脂奶粉-tbs中室温轻摇30min；1.5.5孵育内参：根据样本类型选择合适的内参抗体，用5％脱脂奶粉-tbs稀释抗体，1：5000-10000，室温孵育30min后放4℃过夜或37℃孵育2h；1.5.6洗膜：tbst洗膜3次，每次5min；1.5.7二抗孵育：用5％脱脂奶粉-tbs稀释二抗，山羊抗小鼠igg(h+l)hrp，1:5000，室温轻摇1h；1.5.8洗膜：tbst洗膜3次，每次5min；1.5.9ecl加到pvdf膜上后避光反应3-5min，eblot曝光仪进行曝光，曝光时间分别为1s和60s；1.5.10选择合适曝光时间的图片，通过imagej软件进行灰度值分析。2.实验结果实验结果如图7所示，加鹅去氧胆酸后egfr与stat3的蛋白表达下调。结论：wb结果验证了药物鹅去氧胆酸作为stat3与egfr蛋白的双重拮抗剂，其发挥药物活性的机理，如下：(1)、鹅去氧胆酸通过与egfr与stat3蛋白结合，阻断了egfr与stat3激活，egfr与stat3蛋白磷酸化水平下调；(2)、egfr与stat3蛋白的总蛋白的表达水平，也因为鹅去氧胆酸的药物活性影响，表达量有所下调。实施例5鹅去氧胆酸治疗银屑病证明cdca作为stat3拮抗剂对免疫炎性疾病的治疗作用银屑病作为经典的免疫炎性疾病其发病机制尚不明确和遗传免疫和炎症通路均相关，多篇文献证明stat3作为银屑病的潜在靶点，stat3作为经典炎症通路-il6通路的最下游指标，因此，用银屑病作为实施例证明鹅去氧胆酸治疗免疫炎症疾病的价值。一、实验方法1.动物实验：1.1、24只雄性balb/c小鼠，体质量18～20g，6～8周龄，甲氨蝶呤片(上海信谊药厂有限公司)、5％咪喹莫特乳膏(四川明欣药业有限责任公司)、动物造模、分组、给药。1.2、实验前戊巴比妥钠(80mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，背部去毛，面积约2cm×3cm，去毛后单笼饲养。1.3、依据随机数字表法，将小鼠随机分为空白对照组(c组)、模型组(m组)、鹅去氧胆酸药物组(鹅去氧胆酸组简称e组)、甲氨蝶呤组(mtx组)，每组6只：c组小鼠背部每日涂抹凡士林，其他三组小鼠背部每日涂抹5％咪喹莫特乳膏62.5mg；抹药前灌胃，每天1次，每次0.2ml，连续6d，c组与m组给予0.2ml0.9％(质量分数)氯化钠注射液，mtx组给予1mg·kg-1·d-1甲氨蝶呤片溶液0.2ml；e组分别给予1mg·kg-1·d-1药物溶液0.2ml。2、病变区域拍照及评分每天拍照并同时进行pasi评分，绘制各组小鼠pasi评分变化趋势图，动态观察小鼠皮损的变化情况。3.he检测3.1测量小鼠皮损表皮厚度,造模第7天，取小鼠背部皮肤固定于福尔马林中，脱水、包埋；3.2用切片机切片，石蜡切片厚度4微米；3.3经60℃烘片1小时；3.4二甲苯ⅰ脱蜡10分钟；3.5二甲苯ⅱ脱蜡10分钟；3.6梯度酒精至水：100％酒精5分钟，100％酒精5分钟，95％酒精5分钟，80％酒精5分钟，自来水冲洗5分钟；3.7苏木素染核5min(新配置的苏木素视情况而定)；3.8流水冲洗多余的苏木素，分化液中分化1-2秒；3.9流水冲洗5分钟；3.10伊红染色10分钟；3.11梯度酒精复水：80％酒精1-2秒，95％酒精10-20秒，100％酒精3分钟，100％酒精5分钟，二甲苯ⅱ透明5min，二甲苯ⅰ透明5min(如未完全透明，可适当延长时间)；3.12用中性树胶封片；3.13显微镜下观察拍照。4、小鼠组织wb检测：方法同实施例4中的wb检测方法。二、实验结果结果分析：结果如图11(图中“+”表示加入鹅去氧胆酸药物组，“-”表示未加入鹅去氧胆酸的m组)，证明银屑病热门靶点stat3蛋白激活被阻断，磷酸化stat3表达下调。如图8-10所示，药效学指标(病理、pasi评分、用药后表型)证明，药物鹅去氧胆酸对银屑病模型鼠有治疗作用，并且优于阳性药。实施例6选用肝癌细胞系hepg2进行鹅去氧胆酸与索拉菲尼协同治疗证明其作为egfr拮抗剂在肿瘤方面的治疗试验试剂见下表14：表14试验仪器见表15：表15仪器名称仪器型号厂家二氧化碳培养箱mco-15ac型sanyo倒置显微镜xds-2b型重庆光电超净台sw-cj-1d型江苏通净涡旋振荡仪ql-902海门市其林贝尔仪器制造有限公司酶标仪multiskan3thernoscientific电泳仪minigetankthernoscientific转膜仪miniblotmodulethernoscientific离心机tg-16湘仪试验方法1.细胞培养及日常维护1.1细胞复苏42℃水浴在1min内快速溶解冻存细胞，放置于t-25培养瓶培养；1.2细胞日常维护复苏后24h更换新鲜生长培养基，待细胞密度增加至80％以上时，0.25％胰酶室温消化2min后加入生长培养基终止反应，1000rpm离心，细胞沉淀用冻存液重悬冻存细胞或用生长培养基重悬继续培养；注：hepg2细胞生长培养基：90％高糖1640培养基+10％胎牛血清(fbs)细胞冻存液：50％生长培养基+40％fbs+10％dmso2.细胞模型2.1细胞培养至足够量后，用0.25％胰酶室温消化2分钟后，生长培养基终止细胞，1000rpm离心5min；2.2用生长培养基调整1640细胞密度为1×105个/ml，细胞侵袭检测细胞铺于24孔细胞培养板内，每孔500μl；用于细胞划痕实验细胞铺于6孔细胞培养板内，每孔1.5ml；用于wb检测细胞铺于100mm直径的细胞培养皿内，8ml/皿。2.3分为如下4组：a正常培养组b用1μg/ml鹅去氧胆酸作用细胞24hc用5μm索拉菲尼作用细胞24hd用1μg/ml鹅去氧胆酸+5μm索拉菲尼作用细胞24h3.wb检测方法同实施例4中的wb检测方法。4.mtt增值检测4.1细胞培养结果后，弃上清，分别加入10μlmtt和100ul无血清培养基；37℃放置4h；4.2弃反应液，加入10％sds溶解细胞沉淀，570nm下读取吸光值；4.3通过od值计算细胞增殖抑制率细胞增殖抑制率＝100％×(对照组od-实验组od值)/对照组od值5.细胞瞬时转及序列筛选5.1、细胞经常规消化终止后调整细胞密度为1×106个/ml，铺于6孔细胞培养板内，1500μl/皿，继续常规培养24h。5.2、2ug的shegfr质粒(origene,tr320326)加入100μl无血清培养基混匀，作为a液；5.3、4μllipo2000加入100μl无血清培养基混匀，作为b液；5.4、将a液和b液混合后，室温放置15分钟；5.5、加入800μl无血清培养基，弃细胞原培养基，将a液和b液的混合液缓慢加入至细胞中；5.6、4-8h后更换生长培养基；48h后收集细胞采用wb法(方法同前)检测stat3的表达确认敲降序列。6细胞稳定细胞系构建6.1、重复步骤2.1-2.6；6.2、转染后24h将细胞消化终止重悬后铺于96孔细胞培养板内，3个细胞/孔，100μl/孔；6.3、转染后48h加入含2μg/mlpuromycin的生长培养基，持续培养，每个3-5天啊更换一次培养基，持续培养8周以上。7.细胞分组ahepg2-shnc-conbhepg2-shnc+1μg/ml鹅去氧胆酸chepg2-shnc5μm索拉菲尼dhepg2-shnc+1μg/ml鹅去氧胆酸+5μm索拉菲尼ehepg2-shegfr-confhepg2-shegfr+1μg/ml鹅去氧胆酸ghepg2-shegfr+5μm索拉菲尼hhepg2-shegfr+1μg/ml鹅去氧胆酸和5μm索拉菲尼8.稳转细胞系mtt检测细胞增殖方法同上9.实验结果9.1、wb检测结果见图129.2、细胞增殖检测结果表16、鹅去氧胆酸联合索拉菲尼增值检测结果表17、转染shegfr后的对比检测结果结果分析：(1)wb结果显示加入鹅去氧胆酸egfr激活被阻断，egfr磷酸化水平降低；(2)鹅去氧胆酸联合索拉菲尼细胞增殖结果显示鹅去氧胆酸可提高索拉菲尼对肿瘤细胞的抑制作用；(3)转染敲降egfr，稳转细胞系细胞增殖结果显示，敲降egfr同样可以提高索拉菲尼对肿瘤细胞抑制作用；(4)转染敲降egfr，稳转细胞系细胞增殖结果显示，敲降egfr后鹅去氧胆酸与索拉菲尼联用没有提高索拉菲尼对细胞抑制作用，证明鹅去氧胆酸通过拮抗egfr发挥药物活性。结论，鹅去氧胆酸作为egfr拮抗剂具有肿瘤协同治疗作用，可提高一线治疗用药如索拉菲尼的药效，并且提高索拉菲尼的敏感性，发挥药物作用机制是通过拮抗egfr蛋白抑制egfr激活实现的。实施例7鹅去氧胆酸cdca作为egfr拮抗剂阻断egfr激活的普遍性1.实验试剂见表18：表182.实验仪器见下表19：表193.实验方法3.1、a549、hepg2、huvec、mda231、mcf-7细胞复苏：42℃水浴在1min内快速溶解冻存细胞，放置于t-25培养瓶培养3.2、细胞日常维护：细胞复苏后24h更换新鲜生长培养基，待细胞密度增加至80％以上时，0.25％胰酶室温消化2min后加入生长培养基终止反应，1000rpm离心，细胞沉淀用冻存液重悬冻存细胞或用生长培养基重悬继续培养；注：a549、hepg2、mda231、mcf-7的细胞培养基：90％(体积百分比)1640培养基+10％(体积百分比)胎牛血清(fbs)；huvec细胞培养基：90％(体积百分比)dmem/f12培养基+10％(体积百分比)胎牛血清(fbs)；细胞冻存液：50％(体积百分比)生长培养基+40％(体积百分比)fbs+10％(体积百分比)dmso；3.3细胞分组3.3.1细胞系：a549(人肺癌细胞系)、hepg2(人肝癌细胞系)、mda231(人乳腺癌细胞系)、huvec(人脐静脉内皮细胞)、mcf-7(人乳腺癌细胞系)经常规消化终止后调整细胞密度为1×106个/ml，铺于100mm直径的细胞培养皿内，10ml/皿，继续常规培养24h。3.3.2细胞汇合度达到60-70％时，弃原培养基，更换含5μg/ml鹅去氧胆酸的培养基，同时设置正常培养组，继续培养1h；3.3.3细胞收集：按常规消化终止后，用无菌pbs洗涤2次，弃上清直接保存细胞沉淀。3.4蛋白提取3.4.1预冷ripa蛋白抽提试剂，在蛋白抽提开始前加入0.1mpmsf母液，pmsf终浓度1mm，同时加入蛋白酶和磷酸化蛋白酶抑制剂；3.4.2细胞沉淀以适量裂解液重悬，冰浴30min；3.4.34℃10000rpm离心10min，收集上清，即为总蛋白，分装保存，待测。3.5bca法蛋白定量3.5.1准备bca工作液a液：b液＝50:13.5.2每孔加入25ulbsa标准品，浓度分别为2000、1000、500、250、125、62.5、31.3、0ug/ml；3.5.3加样：样品用pbs进行稀释5-10倍，每孔25ul；3.5.4所有检测孔加入150ulbca工作液，混匀后37度孵育30min；3.5.5酶标仪570nm波长下读取od值；3.5.6通过标准品浓度和od值软件自动计算样品中总蛋白浓度。3.6wb检测3.6.1蛋白浓度调整：计算调整蛋白浓度，加入4×lds和10×ra(reducingagent)缓冲液使各样品浓度值相同，沸水浴变性5min。3.6.2待检测蛋白样品上样量：每孔10ul，含13ug蛋白；3.6.3电泳条件：根据所检测蛋白大小选择电泳缓冲液，当蛋白大小＞25kd时，选择mops缓冲体系，当蛋白大小存在＜25kd时，选择mes缓冲体系；恒压90v，约20min后恒压120v，通过预染蛋白marker来确定电泳停止时间；3.6.4湿转法，转膜条件：0.45um孔径pvdf膜，使用前于甲醇和平衡液中充分浸泡；蛋白分子量＞90kd时，转膜仪设置为long模式，30kd＜蛋白分子量＜90kd时，转膜仪设置为stand模式，蛋白分子量＜30kd时，转膜仪设置为short模式；3.6.5封闭：将膜完全浸没于5％脱脂奶粉-tbs中室温轻摇30min；3.6.6一抗孵育：膜浸于5％脱脂奶粉-tbs稀释的一抗中，做好对应记录，室温孵育30min，放4℃过夜；见下表20；表20、抗体稀释度总汇表名称厂家货号目的蛋白大小稀释比例种属p-egfrcst，3777，175kd1:1000兔3.6.7第二天从4度拿出膜，在室温孵育30min，洗膜：tbst洗膜3次，每次5min；3.6.8二抗孵育：膜浸于5％脱脂奶粉-tbs稀释的二抗中，稀释比例1:5000，室温轻摇1-4h，洗膜：tbst洗膜3次，每次5min；3.6.9ecl加到pvdf膜上后避光反应3-5min，eblot曝光仪进行曝光，曝光时间分别为1s和60s；3.6.10选择合适曝光时间的图片，通过imagej软件进行灰度值分析。3.7内参蛋白wb正式实验3.7.1strippingbuffer洗膜，37℃洗膜30min(如果目的蛋白与内参蛋白分子量相差在10k以上，可以不用strippingbuffer洗膜这一步)；3.7.2洗膜：去离子水洗膜3次；3.7.3洗膜：tbst洗膜3次，每次3min；3.7.4将膜完全浸没5％脱脂奶粉-tbs中室温轻摇30min；3.7.5孵育内参：根据样本类型选择合适的内参抗体，用5％脱脂奶粉-tbs稀释抗体，1：5000-10000，室温孵育30min后放4℃过夜或37℃孵育2h；3.7.6洗膜：tbst洗膜3次，每次5min；3.7.7二抗孵育：用5％脱脂奶粉-tbs稀释二抗，山羊抗小鼠igg(h+l)hrp，1:5000，室温轻摇1h；3.7.8洗膜：tbst洗膜3次，每次5min；3.7.9ecl加到pvdf膜上后避光反应3-5min，eblot曝光仪进行曝光，曝光时间分别为1s和60s；3.7.10选择合适曝光时间的图片，通过imagej软件进行灰度值分析。4.实验结果实验结果如图13所示，除人乳腺癌细胞mcf7外，不同类型细胞系在加入鹅去氧胆酸后，egfr激活被阻断，egfr蛋白的磷酸化水平均降低。mcf7细胞系作为her2阳性细胞系，egfr(也称作her1)与her2均作为表皮生长因子受体家族成员，her2自身可以与egfr(her1)形成二聚体并激活egfr(her1),基于mcf7作为her2阳性细胞系对egfr的影响，鹅去氧胆酸没有抑制mcf7细胞系egfr的激活。结论总结：药物鹅去氧胆酸作为egfr的拮抗型抑制剂是普遍的，可用于与egfr相关疾病的治疗或协同治疗。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。当前第1页12