一种多孔磁性诊疗剂、制备方法及用途

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种多孔磁性诊疗剂、制备方法及用途。

背景技术：

前列腺癌是全球范围内最常见的男性恶性肿瘤之一，其起病较为隐匿，很多患者在首次诊断时就已经处于疾病的进展阶段，生存预后较差。去雄激素治疗对尚处于疾病早期阶段的前列腺癌可以取得不错的治疗效果，可是一旦疾病进展为去势抵抗性前列腺癌(castrationresistantprostatecancer，crpc)时，去雄治疗方式难以发挥作用。crpc对常规的放、化疗等方式的治疗反应并不敏感，大量研究证实其与前列腺癌的疾病进展、肿瘤转移、放化疗抵抗等有关。目前临床上尝试针对crpc进行个体化综合治疗，常采用不同的医疗干预手段，如手术切除术、化学药物治疗、放射治疗和放/化疗联合治疗、生物治疗、中医中药治疗等，但这些常用医疗干预手段没有达到预期的治疗效果。因此，开展针对crpc相关基础研究、相关新型诊断技术及治疗措施仍然十分必要。随着目前生物医药相关研究领域的飞速发展，研究者们已经逐渐把相关研究关注的焦点集中于纳米材料，使其能够应用于肿瘤的早期诊断与治疗。

已有研究者设计出可将光敏剂介导的荧光成像与磁共振成像相结合的荧光磁性纳米探针，但是这些纳米探针对于生物体正常器官(肝、肾、脾、肺等)造成的损伤以及肿瘤组织部位积聚等方面未取得预期效果。为了在不降低荧光磁性纳米探针诊疗效果的情况下，增加药物在肿瘤组织中的积聚量并减轻其对于体内正常组织器官的损害，就需要进一步提高纳米探针对药物的荷载效率，使其能够充分发挥诊疗效果。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种多孔磁性诊疗剂、制备方法及用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种多孔磁性诊疗剂、制备方法和用途

本发明第一方面，提供一种制备四氧化三铁纳米颗粒的方法，所述方法至少包括：将ph为9～11的含有无机铁、有机铁和抗坏血酸的混合溶液进行水热反应，透析反应产物获得含有四氧化三铁颗粒的分散悬液。

本发明第二方面，提供一种四氧化三铁纳米颗粒，所述四氧化三铁纳米颗粒由第一方面所述的方法制备所得，所述四氧化三铁纳米颗粒具有多孔和磁性。

本发明第三方面，提供一种纳米探针，包括第二方面所述四氧化三铁纳米颗粒和光敏剂，所述光敏剂与所述四氧化三铁纳米颗粒的质量比为7.8～9.8：100。

本发明第四方面，提供一种诊疗剂，包括第二方面所述四氧化三铁纳米颗粒、光敏剂和抗癌药，所述光敏剂与所述四氧化三铁纳米颗粒的质量比为7.8～9.8：100，所述抗癌药与所述四氧化三铁纳米颗粒的质量比为4～6：100。

本发明第五方面，提供制备第四方面所述诊疗剂的方法，包括：将第二方面所述四氧化三铁纳米颗粒、光敏剂(ir820)和抗癌药混合并搅拌，再离心去上清液，获得诊疗剂。

本发明的第六方面，提供第五方面所述一种诊疗剂用于制备诊断和治疗肿瘤产品用途。

如上所述，本发明的一种诊疗剂，具有以下有益效果：

本发明制备的诊疗剂具有多孔三维空间结构，能够高效地荷载药物，具有磁靶向效果，可将光敏剂和抗癌药定向富集于肿瘤部位，实现肿瘤荧光及核磁的双模态成像，用于肿瘤诊断，抗癌药的释放可杀死癌细胞用于治疗肿瘤。

附图说明

图1为本发明制备的磁性多孔诊疗剂的透射电镜照片。

图2为本发明制备的磁性多孔诊疗剂的高分辨透射电镜图片。

图3为cck-8实验检测本发明制备获得的诊疗剂针与crpc肿瘤细胞株pc3细胞孵育后：未有激光激发下评估安全性与激光激发下评估治疗性。

图4为本发明制备获得的诊疗剂注射入裸鼠体内后荧光成像图片。

图5为本发明应用于crpc裸鼠模型体内后肿瘤体积变化。

图6为本发明应用于crpc裸鼠模型体内后肿瘤的he染色图片

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

请参阅图1和图2。需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。

本发明第一方面，提供一种制备四氧化三铁纳米颗粒的方法，将ph为9～11的含有无机铁、有机铁和抗坏血酸的混合溶液进行水热反应，透析反应产物获得含四氧化三铁颗粒的分散悬液。

本发明中将无机铁、有机铁和抗坏血酸一同加入溶剂内均匀混合，并调节ph为9～11，再放入反应釜内进行水热反应，使用透析膜透析过滤水热反应后产物获得含有四氧化三铁颗粒的分散悬液。

在一实施例中，所述无机铁选自硫酸铁、氯化铁、氯化亚铁或硫酸亚铁中的一种或多种的组合。

优选地，所述无机铁为硫酸亚铁。

在一实施例中，所述有机铁选自右旋糖酐铁、乙酰丙酮铁、葡萄糖酸亚铁或柠檬酸铁中的一种或多种的组合。

优选地，所述有机铁盐为柠檬酸铁。

在一实施例中，所述有机铁盐与所述无机铁在所述混合液中的浓度之和为6～10mmol/ml。

实验人员根据需要选择所述有机铁盐与所述无机铁在所述混合液中的浓度之和，例如可以是6～7mmol/ml、7～8mmol/ml、8～9mmol/ml或9～10mmol/ml。

在一实施例中，所述有机铁盐与所述无机铁的摩尔比为1～3:1～8。

实验人员根据需要选择所述有机铁盐与所述无机铁的摩尔比，例如所述有机铁盐与所述无机铁的摩尔比可以是1～2:1～8或2～3:1～8，还可以是1～3:1～2、1～3:2～3、1～3:3～4、1～3:4～5、1～3:5～6、1～3:6～7或1～3:7～8。

优选地，所述有机铁盐与所述无机铁的摩尔比为1～2:1～8。

在一实施例中，所述混合溶液中fe²⁺：fe³⁺摩尔比为1:1～4。

实验人员根据需要选择fe²⁺：fe³⁺摩尔比，例如可以是1:1～2、1:2～3或1:3～4。

优选地，所述fe²⁺：fe³⁺摩尔比为1:1～2。

在一实施中，所述抗坏血酸在所述混合溶液中的浓度为4～6mmol/ml。

在一实施例中，所述水热反应的温度为150～250℃，反应时间为5～15h。

实验人员根据实际需求，选择水热反应的温度和时间，例如水热反应的温度可以是150～200℃或200～250℃，水热反应时间可以是5～10h或10～15h。

优选地，所述水热反应的温度为150～200℃，所述水热反应时间为5～10h。

本发明第二方面，提供一种四氧化三铁纳米颗粒，所述四氧化三铁纳米颗粒由第一方面所述的方法制备获得，所述四氧化三铁纳米颗粒具有多孔和磁性。

在本发明中的磁性多孔四氧化三铁颗粒具有多孔结构可高负载其他试剂，还具有磁性可用于磁靶向的定向富集和核磁成像。

在一实施例中，所述四氧化三铁纳米颗粒尺寸为39～43nm。

本发明制备的四氧化三铁纳米颗粒尺寸是可控的，实验人员可制备出四氧化三铁纳米颗粒的粒径为39～40nm、41～42nm或42～43nm。

本发明第三方面，提供一种纳米探针，包括第二方面所述四氧化三铁纳米颗粒和光敏剂，所述光敏剂与所述四氧化三铁纳米颗粒的质量比为7.8～9.8：100。

在本发明中，所述四氧化三铁纳米颗粒可用于核磁成像，且具有多孔，负载有的光敏剂可用于荧光成像，利用磁性多孔四氧化三铁颗粒的磁靶向效果，可将光敏剂和抗癌药定向富集于肿瘤部位，提高了光敏剂的使用效率，减少光敏剂对正常组织伤害。

优选地，所述光敏剂为ir820。所述光敏剂为ir820的发射波长在近红外区，生物自身荧光干扰较少。

本发明第四方面，提供一种诊疗剂，包括第二方面所述四氧化三铁纳米颗粒、光敏剂和抗癌药，所述光敏剂与所述四氧化三铁纳米颗粒的质量比为7.8～9.8：100。所述抗癌药与所述四氧化三铁纳米颗粒的质量比为4～6：100。

本发明制备的诊疗剂，所述四氧化三铁纳米颗粒具有核磁成像能力，负载有的光敏剂可用于荧光成像，实现了核磁成像剂荧光成像的双模态成像，利用磁性多孔四氧化三铁颗粒的磁靶向效果，可将光敏剂和抗癌药定向富集于肿瘤部位，减小了光敏剂和抗癌药对正常组织的伤害，实现了化疗效果，磁性多孔四氧化三铁颗粒具有光热效果，在一定功率的红外激光照射下，磁性多孔四氧化三铁颗粒可产生热量，使肿瘤部分的温度升高，利用高温杀死细胞实现光热治疗，磁性多孔四氧化三铁颗粒在含有过氧化氢的肿瘤环境中发生芬顿反应，产生强氧化性的羟基自由基杀死肿瘤细胞实现光动力治疗。

优选地，所述抗癌药为阿霉素、紫杉醇和顺式-二氯二氨合铂等其中的一种或多种组合。

医务人员根据患者的病情选择抗癌药，所述抗癌药可以是阿霉素、紫杉醇或顺式-二氯二氨合铂，还可以是阿霉素和紫杉醇、阿霉素和顺式-二氯二氨合铂，或，紫杉醇和顺式-二氯二氨合铂的混合药，还可以是阿霉素、紫杉醇和顺式-二氯二氨合铂的混合药。

本发明第五方面，提供制备第四方面所述诊疗剂的方法，包括：将第二方面所述四氧化三铁纳米颗粒、光敏剂(ir820)和抗癌药混合并搅拌，再离心去上清液，获得纳米探针。

在本发明中，将第一方面所述四氧化三铁纳米颗粒与光敏剂在溶液内搅拌一定时间，再使用离心机进行离心，去除上清液中未荷载的光敏剂(ir820)和抗癌药，获得纳米探针。

在一实施例中所述搅拌的时间为18～30h，搅拌的转速的为300～400rpm。

实验人员根据需要选择所述搅拌的时间和转速，例如所述搅拌的转速可以是300～350rpm或350～400rpm，所述搅拌的时间可以为18～24h或24～30h。

在一实施例中，所述离心的时间为5～15min，所述离心的离心力为10000～12000g。

实验人员根据需要选择离心时间和离心力，例如离心力可以是10000～11000g或11000～12000g，例如离心时间可以是5～10min或10～15min。

本发明的第六方面，提供第五方面所述一种诊疗剂用于制备诊断和治疗肿瘤产品用途。

本发明中的诊疗剂，诊疗剂的基底材料为多孔的四氧化三铁纳米颗粒，可用于核磁成像，荷载有光敏剂和抗癌药，还可通过磁靶向将光敏剂和抗癌药定向富集于肿瘤部位，实现肿瘤荧光及核磁的双模态成像，用于肿瘤诊断，抗癌药的释放可杀死癌细胞用于治疗肿瘤，多孔的四氧化三铁纳米颗粒具有光动力和光热治疗肿瘤效果，实现了化疗，光热和光动力联合治疗肿瘤。

实施例1

(1)四氧化三铁纳米颗粒制备：分部称取硫酸亚铁300mmol与柠檬酸铁300mmol溶于100ml去离子水中配置溶液，以400rpm转速搅拌使其完全充分溶液混匀；再添加抗坏血酸500mmol，并添加0.3m的氢氧化钠调整溶液ph值至9，再次以400rpm转速混匀搅拌30min后；将溶液转至水热反应釜中，以200℃的温度反应5h，使用透析袋进行透析，置于4℃冰箱保存，得到四氧化三铁纳米颗粒的分散悬液。将四氧化三铁纳米颗粒的分散悬液适应离心机进行高速离心，离心后的产物进行烘干后得到四氧化三铁纳米颗粒。

(2)荷载光敏剂药物：取上述制备的四氧化三铁纳米颗粒的分散悬液取10ml与光敏剂药物ir820悬液10ml进行均匀混合，光敏剂ir820悬液中光敏剂ir820浓度为1mg/ml，或称取100mg的四氧化三铁纳米颗粒与9mg光敏剂药物ir820，一起加入50ml的蒸馏水中以300rpm转速混匀搅拌持续24h；利用超滤管离心透析(4℃、12000rpm，5min)，去除未荷载上的光敏剂药物；定容至原体积，重复三次以完全去除未荷载上的光敏剂药物，从而得到单分散稳定的磁性多孔荧光纳米探针。

(3)制备诊疗剂，取上述制备的四氧化三铁纳米颗粒的分散悬液取10ml与光敏剂药物ir820悬液10ml进行均匀混合，光敏剂ir820悬液中光敏剂ir820浓度为1mg/ml，再加入6mg紫杉醇，或称取100mg的四氧化三铁纳米颗粒与9mg光敏剂药物ir820，一起加入50ml的蒸馏水中，再加入5mg紫杉醇，以300rpm转速混匀搅拌持续24h；利用超滤管离心透析(4℃、12000rpm，5min)，去除未荷载上的光敏剂药物和紫杉醇；定容至原体积，重复三次以完全去除未荷载上的光敏剂药物，从而得到单分散稳定的诊疗剂。

图1为本发明制备获得的四氧化三铁纳米颗粒电镜照片，观察可知四氧化三铁纳米颗粒具有良好的分散性，多孔三维空间结构清晰可见。

图2为本发明制备获得的四氧化三铁纳米颗粒的高分辨透射电镜图片，观察可知四氧化三铁纳米颗粒的晶格条纹与四氧化三铁的晶格特征条纹完全相符。

实施例2

体外肿瘤协同治疗，将生理盐水与诊疗剂混合液(溶剂为生理盐水，诊疗剂浓度为5mg/ml)置于两个24孔细胞培养板内，灭菌2小时。将pc3细胞以5×10⁴个细胞/孔的密度接种到24孔细胞培养板中并培养过夜。然后，分别用808nm(niribiowindow)激光照射第一和第二板中的细胞5分钟。cck-8研究激光照射前后的pc3细胞的代谢活性。使用酶标仪(mk3，thermo，usa)在450nm下读取用细胞培养1小时后cck-8的吸光度。

试验结果图3所示，未有激光激发下，生理盐水与诊疗剂混合液中的细胞活力无显著差异，说明诊疗剂具有良好的生物相容性，具有应用于生物体内的潜力。在激光激发下，生理盐水内的细胞活力几乎不受影响，但是诊疗剂混合液中的细胞会大量死亡，细胞活力低于50％，表明在激光激发下诊疗剂具有优良的光热治疗效果。

实施例图中的荧光磁性探针为本发明的诊疗剂，与以下实施例相同。

实施例3

将大约10⁷个pc3细胞注射到裸鼠背部的皮下，喂养一段时间直至肿瘤体积为200m³。将裸鼠分为两组，一组尾静脉注射生理盐水，一组尾静脉注射诊疗剂(溶剂为生理盐水，诊疗剂浓度为5mg/ml)，每隔5天分别注射生理盐水和诊疗剂，再使用808nm(niribiowindow)激光照射肿瘤部位，使用flir^tme60相机记录激光照射小鼠的热图像和温度。裸鼠分别喂食25天后形成肿瘤结块，然后，切除肿瘤结块，通过测量肿瘤的体积和外观来评估肿瘤治疗效果。

结果图4和图5所示，注射诊疗剂后，将磁极放置在肿瘤部位一段时间，再使用使808nm(niribiowindow)激光照射肿瘤部位，发现肿瘤部位的温度明显高于其他部位。通过测量各个时间短肿瘤体积，实验发现对照组的肿瘤体积显著增大，注射过诊疗剂并用激光照射后的裸鼠，肿瘤生长受到了显著地抑制。说明诊疗剂可有效治疗肿瘤。

实施例4

裸鼠分为两组，分别尾静脉注射诊疗剂与生理盐水。再喂食25天后对小鼠实施安乐死获取肿瘤，再进行标准h&e染色。使用显微镜记录h&e染色图像。

试验结果图6所示，与对照组相比，经近红外激光照射后，注射诊疗剂的裸鼠肿瘤组织坏死组织显著增加。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。