一种鱼腥草素类似物在制备变异链球菌生长及生物膜抑制剂的应用

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种鱼腥草素类似物在制备变异链球菌生长及生物膜抑制剂的应用。

背景技术：

龋病是人类最常见的牙齿疾病，引起牙齿颜色、形态、质地的进行性破坏，严重影响口腔的发音、咀嚼、语言等功能，是导致牙痛和失牙的主要原因(usdepartmentofhealthandhumanservices.oralhealthinamerica:areportofthesurgeongeneral.rockville:nationalinstituteofdentalandcraniofacialresearch,nationalinstitutesofhealth,2000:308.)。60％-90％的儿童和大部分的成年人均饱受其困扰(petersenpe,bourgeoisd,ogawah,etal.theglobalburdenoforaldiseasesandriskstooralhealth[j].bulletinoftheworldhealthorganization,2005,83:661-669.)。鉴于其发病率高，分布广，对口腔健康及全身健康的危害大，世界卫生组织(who)将其与心血管疾病和肿瘤并称为“人类三大重点防治疾病”(johanssoni,witkowskae,kavehb,etal.themicrobiomeinpopulationswithalowandhighprevalenceofcaries[j].journalofdentalresearch,2016,95(1):80-86.)。牙菌斑为导致龋病的细菌性因素，其本质为粘附于牙体硬组织表面上的多菌种生物膜(marshpd.dentalplaqueasamicrobialbiofilm[j].cariesresearch,2004,38(3):204-211.)。其中，变异链球菌是重要致龋微生物，具有极强的产酸、耐酸和生物膜形成能力，是龋病防治中需重点关注的病原微生物。

控制龋病最有效的方法就是菌斑控制。然而，目前龋病的临床防治策略并不是采取药物干预龋病进展，而是单纯被动地针对龋病的结局—龋洞进行治疗。最常见的抗变异链球菌生长的药物为氯己定、氟化物和抗生素。然而，氯己定能促进牙结石的形成并能导致牙和修复体变色(araújon.c.,fontana,c.r.,gerbi,m.e.m.,&bagnato,v.s..overall-mouthdisinfectionbyphotodynamictherapyusingcurcumin.photomedicineandlasersurgery,2012,30(2),96–101.)氟化物因具有逆转牙体脱矿、促进再矿化的作用而一直被用于龋病的防治。但是，氟化物防龋效果存在争议：首先，摄入过多氟化物可能造成氟中毒；其次，氟化物对于牙齿的作用部位具有选择性，对咬合面的点隙裂沟龋效果较差。抗生素的滥用导致的细菌耐药已经成为目前临床上控制口腔感染性疾病的重要难点之一。同时，细菌在生物膜状态下还能通过自身产生的细胞外基质及耐药基因的水平转移等机制实现耐药(a.p.roberts,p.mullany,oralbiofilms:areservoiroftransferable,bacterial,antimicrobialresistance,2010,8(12)1441-1450.)。因此，寻找新型的替代抗龋药物对临床龋病管理的发展至关重要。

因此，为应对临床缺乏有效抗龋药物这一现象，寻找新的防龋策略并研发新的防龋药物是目前亟待解决的问题。同时，我们需要克服现有龋病防治策略的不足，寻找能够有效抑制牙菌斑生物膜的新型替代抗龋药物。新鱼腥草素钠已证实了对多种需氧型微生物如白色念珠菌(wu,j.,wu,d.,zhao,y.,si,y.,mei,l.,shao,j.,etal..sodiumnewhouttuyfonateinhibitscandidaalbicansbiofilmformationbyinhibitingtheras1-camp-efg1pathwayrevealedbyrna-seq.front.microbiol.2020,11,2075.)，铜绿假单胞菌(zhaoy,meil,siy,wuj,shaoj,wangt,etal.sodiumnewhouttuyfonateaffectstranscriptomeandvirulencefactorsofpseudomonasaeruginosacontrolledbyquorumsensing.2020；11:1581.)和金黄色葡萄球菌(lux,yangx,lix,luy,renz,zhaol,etal.invitroactivityofsodiumnewhouttuyfonatealoneandincombinationwithoxacillinornetilmicinagainstmethicillin-resistantstaphylococcusaureus.plosone.2013；8:e68053.)有抗菌作用。然而需氧型微生物与兼性厌氧型或厌氧型微生物对特定抗菌药物的敏感性有着较大的差异(dionen,khelaifias,lagierj-c,raoultd.theaerobicactivityofmetronidazoleagainstanaerobicbacteria.2015；45:537-40.)。而新鱼腥草素钠对变异链球菌这类兼性厌氧或厌氧菌的抗菌效力目前并没有对此进行研究。

技术实现要素：

本发明针对现有技术存在的问题提供一种鱼腥草素类似物在制备变异链球菌生长及生物膜抑制剂的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种鱼腥草素类似物在制备变异链球菌生长及生物膜抑制剂的应用，所述鱼腥草素类似物为新鱼腥草素钠，结构如下：

进一步的，所述抑制剂的制备方法如下：

步骤1：将新鱼腥草素钠溶解到5％的二甲基亚砜溶剂中，得到新鱼腥草素钠浓度为10mg/ml的抑制剂母液；

步骤2：将步骤1得到的母液用5％的二甲基亚砜进行梯度稀释；加入液体培养基中，抑制剂的浓度为50μg/ml～100μg/ml；二甲基亚砜的最终浓度为0.5％(v/v)。

进一步的，所述抑制剂可抑制变异链球菌浮游菌的生长及生物膜的形成，可抑制变异链球菌生物膜中的活菌数。

进一步的，所述抑制剂能够作为口腔变异链球菌生物膜抑制剂。

进一步的，所述抑制剂作为抗龋药物。

进一步的，所述抗龋药物以新鱼腥草素钠作为活性物质与药物上可接受的辅料制备得到。

进一步的，所述药物为粉剂、片剂和喷雾制剂中的一种。

本发明的有益效果是：

(1)本发明新鱼腥草素钠来源于天然植物提取液，来源丰富，取材方便；

(2)本发明克服了现有龋病防治策略的不足，得到有效抑制牙菌斑生物膜的新型替代抗龋药物；

(3)本发明中抑制剂显著抑制变异链球菌浮游菌生长及生物膜的形成；

(4)本发明中抑制剂对口腔上皮细胞毒性低；

(5)本发明抑制剂溶质分子量小，结构相对简单，较易溶于多种溶剂。

附图说明

图1为本发明实施例1中抑制剂对变异链球菌浮游菌生长的抑制结果。

图2为本发明实施例2中抑制剂对变异链球菌生物膜生成总量的抑制结果。

图3为本发明实施例3中抑制剂对变异链球菌生物膜中活菌数的抑制结果。

图4为本发明实施例4中抑制剂对人牙龈上皮细胞的细胞毒性结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

一种鱼腥草素类似物在制备变异链球菌生长及生物膜抑制剂的应用，所述鱼腥草素类似物为新鱼腥草素钠，结构如下：

该鱼腥草素类似物化合物是一种已知化合物，其中文名称为新鱼腥草素钠；其英文名称为sodiumnewhouttuyfonate。其；分子式为c12h24o5s.na；分子量为330.42；国际化合物标识是：

inchi＝1s/c14h28o5s.na/c1-2-3-4-5-6-7-8-9-10-11-13(15)12-14(16)20(17,18)19；/h14,16h,2-12h2,1h3,(h,17,18,19)；/q；+1/p-1。该化合物可以从商业途径购买得到，本发明所使用的该化合物是从成都埃法生物技术有限公司(网址：https://alfabiotech.company.lookchem.cn/)购买得到。

为了说明本发明抑制剂的效果将新鱼腥草素钠制备为抑制剂验证了其对变异链球菌浮游菌生长的抑制、对变异链球菌生物膜生成总量的抑制、对变异链球菌生物膜中活菌数的抑制和对人牙龈上皮细胞的细胞毒性。

抑制剂的制备方法如下：

步骤1：将新鱼腥草素钠2mg溶解到2ml的5％的二甲基亚砜溶剂中，得到新鱼腥草素钠浓度为10mg/ml的抑制剂母液；

步骤2：将步骤1得到的母液用5％的二甲基亚砜进行梯度稀释；加入液体培养基(牛心脑浸液bhi)中，抑制剂的浓度为50μg/ml、100μg/ml；二甲基亚砜的最终浓度为0.5％(v/v)。

抑制剂可抑制变异链球菌浮游菌的生长及生物膜的形成，可抑制变异链球菌生物膜中的活菌数。抑制剂能够作为口腔变异链球菌生物膜抑制剂；可作为抗龋药物；药物以新鱼腥草素钠作为活性物质与药物上可接受的辅料制备得到。药物为粉剂、片剂和喷雾制剂中的一种。

本发明中所用的变异链球菌菌株公共获得来源为：中国医学细菌保藏管理中心，菌种编号为：32401(网址：http://www.cmccb.org.cn/)。

牛心脑浸液(为了叙述方便，以下简称为bhi)液体培养基的组分及其配制方法：将14.8g商购的bhi粉末(该bhi粉末购自英国oxoid公司，货号：cm1135b)加入400ml蒸馏水中，高温高压(121.3℃，103.4kpa)灭菌15min，冷却后待用。该液体培养基是针对变异链球菌浮游培养的典型液体培养基。

bhi蔗糖液体培养基的组分及其配制方法：分别将14.8g商购bhi粉末(该bhi粉末购自英国oxoid公司，货号：cm1135b)和4g蔗糖(thermofisherscientific，usa，货号：s3-500)加入400ml蒸馏水中，高温高压(121.3℃，103.4kpa)灭菌15分钟，冷却后待用。该液体培养基是针对变异链球菌生物膜培养的典型液体培养基。

bhi固体培养基的组分及其配制方法：将14.8g商购bhi粉末(该bhi粉末购自英国oxoid公司，货号：cm1135b)和7.8g琼脂粉末(该琼脂粉末购自biofroxx公司，货号：8211gr500)加入400ml蒸馏水中，高温高压(121.3℃，103.4kpa)灭菌15分钟，冷却后待用。该固体培养基是针对变异链球菌菌落分离培养的典型固体培养基。

本发明实施例中新鱼腥草素钠以溶液状态使用。采用5％二甲基亚砜(即dmso，该dmso购自mpbio公司，货号：0219605580)溶解抑制剂粉剂以便于后续实验使用。具体配制方法：首先将向2ml的5％dmso中加入2mg抑制剂粉剂，使之成为原始浓度为1mg/ml的抑制剂母液贮存备用。后续实验中，将上述配好的抑制剂母液进行梯度稀释。向20μl母液中加入20μl5％dmso，使之成为浓度为500μg/ml的溶液，配置上述2种浓度的贮存液各20μl，分别加入到180μl的含bhi(用于培养浮游状态的变异链球菌)或bhi蔗糖培养基(用于培养变异链球菌生物膜)中，使抑制剂的最终浓度为：100μg/ml和50μg/ml，溶剂dmso的最终浓度均为0.5％(v/v)。

下述实施例中接种操作如下：将变异链球菌(菌种编号为：32401)菌液接种于bhi固体培养基上，37℃、兼性厌氧(5％co2)培养24小时。用接种环挑取一个单菌落接种于3mlbhi液体培养基，37℃、兼性厌氧(5％co2)培养。用紫外可见光分光光度计测定其在600nm波长的吸收值(od600)，将培养至对数生长期(od600≈0.5)的菌悬液按照1：100比例稀释于bhi液体培养基(用于培养浮游状态的变异链球菌)或bhi蔗糖液体培养基(用于培养变异链球菌生物膜)并分装到96孔板中继续培养。整个操作在生物安全柜的无菌条件下进行。

实施例1

按照上述无菌操作程序，将变异链球菌悬液(菌种编号为：32401)分别接种于含不同浓度抑制剂(100μg/ml和50μg/ml)的bhi液体培养基中，以确定抑制剂对变异链球菌生物膜形成的抑制活性。

按照1：100比例将上述变异链球菌菌悬液分别接种到含有终浓度为100μg/ml和50μg/ml抑制剂的bhi液体培养基中，于37℃、兼性厌氧(5％co2)培养24小时，期间，每30min读一次每孔的od600值。并与对照组即不含抑制剂仅含0.5％dmso的细菌悬液进行比较来判断变异链球菌的浮游生长是否受到影响。

图1为本实施例结果，从图中可以看出相比于对照组，抑制剂在100μg/ml浓度时能显著抑制变异链球菌的生长，而在50μg/ml浓度下仅有轻微抑制作用。实验结果表明该抑制剂对变异链球菌浮游菌的生长有显著抑制作用，并且呈现剂量-依赖效应。

实施例2

按照上述无菌操作程序，将变异链球菌菌悬液(菌种编号为：32401)分别接种于含不同浓度抑制剂(100μg/ml和50μg/ml)的bhi液体培养基中，以确定抑制剂对变异链球菌生物膜形成的抑制活性。

按照1：100比例将上述变异链球菌菌悬液分别接种到含有终浓度为100μg/ml和50μg/ml抑制剂的bhi蔗糖液体培养基中，于37℃、兼性厌氧(5％co2)培养24小时于37℃、兼性厌氧(5％co2)培养24小时，形成生物膜。

然后，小心吸出96孔板中的浮游细菌及上清液，用ph＝7.4，0.01m的磷酸盐缓冲液(该缓冲液购自gibco公司，货号：c10010500bt)清洗底部的生物膜细胞，用100μl4％的多聚甲醛(多聚甲醛购自biosharp公司，货号：bl539a)固定孔板底部的生物膜15min后，吸出多聚甲醛溶液，并用ph＝7.4，0.01m的磷酸盐缓冲液(该缓冲液购自gibco公司，货号：c10010500bt)润洗2-3次。将生物膜风干然后，用100μl0.01％的结晶紫溶液(该溶液购自中国索莱宝公司，货号：g1063/100ml)对生物膜染色8min，并用ph＝7.4，0.01m的磷酸盐缓冲液(该缓冲液购自gibco公司，货号：c10010500bt)润洗2-3次。每孔加入200μl33％的乙酸溶液溶解结晶紫，经摇床摇匀后每孔吸取100μl至一新的96孔板中，读取每组od575的数值。实验过程中的数据是与对照进行比较来评价抑制剂对变异链球菌生物膜形成的抑制效果。对照组即不含抑制剂仅含0.5％dmso的细菌悬液。

结果如图2所示，从图中可以看出加入终浓度为100μg/ml的抑制剂，对变异链球菌生物膜形成量的抑制效果最明显。加入终浓度为50μg/ml的抑制剂，抑制效果次之。实验结果表明抑制剂能够有效抑制变异链球菌生物膜的形成量，具有剂量-反应关系。

实施例3

按照上述无菌操作程序，将上述变异链球菌菌悬液(菌种编号为：32401)分别接种于含不同浓度抑制剂的bhi液体培养基中，以确定抑制剂对变异链球菌生物膜形成的抑制活性。

按照1：100比例将上述变异链球菌菌悬液分别接种到含有终浓度为100μg/ml和50μg/ml抑制剂的bhi蔗糖液体培养基中，于37℃、兼性厌氧(5％co2)培养24小时于37℃、兼性厌氧(5％co2)培养24小时，形成生物膜。

然后，小心吸出96孔板中的浮游细菌及上清液，用ph＝7.4，0.01m的磷酸盐缓冲液(该缓冲液购自gibco公司，货号：c10010500bt)清洗并洗脱底部的生物膜细胞，经10⁴-10⁶稀释后，涂布于bhi固体培养基。经37℃、兼性厌氧(5％co2)培养48小时后，读取bhi固体培养基上的菌落形成单位(cfu)数目，每组细菌浓度以lg^cfu/ml表示。

对照1为不添加抑制剂，终浓度为0.5％(v/v)的二甲基亚砜(即dmso，该dmso购自mpbio公司，货号：0219605580)。实验过程中的数据是与对照进行比较来评价抑制剂对变异链球菌生物膜形成的抑制效果。

结果如图3所示，从图中可看出加入终浓度为100μg/ml的抑制剂，对变异链球菌生物膜中活细菌数的抑制效果最明显。加入终浓度为50μg/ml的抑制剂，抑制效果次之。实验结果表明抑制剂能够有效抑制变异链球菌生物膜中的活细菌数，具有剂量-反应关系。

实施例4

本实施例的供试细胞涉及人牙龈上皮细胞(由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供)。

培养基为含10％胎牛血清(fbs)及1％双抗(青霉素+链霉素)的dmem培养基(胎牛血清购自gibco公司，货号：10270106；dmem培养基购自gibco公司，货号：c11995500bt)。细胞培养条件为5％co2，37℃。

细胞经复苏和传代后接种于96孔板中，每孔100μl含细胞的dmem培养基，细胞浓度为1×10⁵个/孔，于细胞培养箱培养24h后，移除孔板内的培养基，pbs(该缓冲液购自gibco公司，货号：c10010500bt)润洗细胞后更换新的含有200μg/ml,100μg/ml和50μg/ml抑制剂的培养基，仅含有0.5％dmso的培养基作为对照组。

在细胞培养箱中培养5min后，移除孔板中的培养基后pbs(该缓冲液购自gibco公司，货号：c10010500bt)润洗细胞并更换新的不含抑制剂的培养基。在避光条件下每孔加入10μlcck-8(cck-8细胞增殖活性试剂盒购自日本东仁公司，ck04/500t)。避光孵育3h后，读取每组od450的数值。实验过程中的数据是与对照进行比较来评价抑制剂对人牙龈上皮细胞的细胞毒性。

结果如图4所示，从图中可以看出加入了含200μg/ml,100μg/ml和50μg/ml的抑制剂对人牙龈上皮细胞的增殖活性均无明显抑制作用。

本发明中将不同浓度(50μg/ml和100μg/ml)的抑制剂添加到用于培养变异链球菌浮游菌的液体培养基中，保证各组中二甲基亚砜(dmso)终浓度均为0.5％(v/v)，再分别接种经过夜活化培养的变异链球菌于37℃兼性厌氧培养24小时，每30min读取各组600nm波长下的od值，通过将各抑制剂浓度组与对照组比较来判断浮游状态变异链球菌的生长是否受到影响。最后，将不同浓度(50μg/ml和100μg/ml)的抑制剂添加到用于培养变异链球菌生物膜的液体培养基中，保证各组中二甲基亚砜(dmso)终浓度均为0.5％(v/v)，再分别接种经过夜活化培养的变异链球菌于37℃兼性厌氧培养24小时，后弃上清液，pbs漂洗生物膜，重悬并稀释细菌，于bhi固体培养基进行培养，通过读取细菌菌落形成单位(cfu)来判断抑制剂对变异链球菌生物膜形成的抑制效果。对照为添加终浓度为0.5％(v/v)的二甲基亚砜(dmso)，实验过程中的数据是与对照组比较来评价应用抑制剂达到的抑制效果。实验结果表明：所述抑制剂对于变异链球菌生长及生物膜形成有明显的抑制作用。