一种三维打印复合无机纳米纤维支架及其制备和应用

本发明属于大段骨修复支架及其制备和应用领域，特别涉及一种三维打印复合无机纳米纤维支架及其制备和应用。

背景技术：

无机纳米纤维主要是由金属及氧化物、非金属及氧化物、盐等构成，而生物体当中骨的主要无机成分为羟基磷灰石。人工合成的材料如生物活性玻璃、硼硅酸盐等无机材料，它是由sio2，na2o，cao，b2o3和p2o5等基本无机成分组成的生物材料，与人体骨组织成分高度类似。无机材料如生物活性玻璃及硼硅酸盐最显著的特征是植入人体后，表面状况随时间而动态变化，表面形成生物活性的碳酸羟基磷灰石层，为组织提供了键合面。多数生物活性玻璃等无机材料是既有骨生成性，又有骨引导作用，与骨和软组织都有良好的结合性，因此，无机材料如生物活性玻璃、硼硅酸盐等被认为是可应用在修复领域的良好生物材料。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种三维打印复合无机纳米纤维支架及其制备和应用，克服现有技术个性化定制性能不佳、骨修复材料应用形式不足的缺陷。

本发明的一种复合无机纳米纤维支架，所述支架为负载无机材料气凝胶的镂空柱体支架。

所述镂空柱体支架为三维打印的镂空柱体支架；所述无机材料气凝胶为生物玻璃气凝胶、硼硅酸盐气凝胶等无机成分气凝胶。

所述复合无机纳米材料支架也即大骨修复三维支架的主体力学结构由中间镂空pcl柱体支架提供，镂空pcl柱体支架内部及柱体外侧负载有无机材料气凝胶，如生物活性玻璃气凝胶，其中所述气凝胶为纳米纤维结构。

本发明的一种复合无机纳米纤维支架的制备方法，包括：

(1)将无机材料纳米纤维膜剪碎和天然高分子聚合物溶液混合，匀浆粉碎处理，得到无机纳米短纤维混合液；

(2)通过三维打印制备镂空柱体支架；

(3)将无机纳米纤维混合液与镂空柱体支架在模具中浇筑成型，交联，浸泡谷氨酸溶液，

漂洗，干燥，得到复合无机纳米纤维支架。

上述制备方法的优选方式如下：

所述步骤(1)中无机纳米纤维膜可为不同比例和不同组分的生物玻璃纤维、硼硅酸盐等无机成分，如本专利以生物活性玻璃为例制备的无机纳米纤维膜，以si、ga、sr等成份为主。

所述步骤(1)中无机材料纳米纤维膜由下列方法制备：通过静电纺丝得到高分子聚合物/无机材料纳米纤维，干燥，煅烧，获得无机材料纳米纤维膜；

所述天然高分子聚合物为富含活性氨基、羧基等基团的天然高分子聚合物。进一步所述天然高分子聚合物为明胶等富含活性基团如氨基的化合物；所述匀浆粉碎处理为转速8000-13000rmp，匀浆时间5-10min。

所述天然高分子聚合物溶液为明胶水溶液，具体由下列方法制备：称取明胶，将其溶于热水中，选择热水作为明胶溶解的溶剂是基于明胶常温或低温溶解度较低，较难获得高含固率的明胶水溶液。进一步地，明胶水溶液配置时，如称取明胶0.5-1.0g，溶于100ml65-75℃热水中，制备得含固率(g/ml)为0.5％-1.0％的明胶水溶液；含固率是指溶质占溶剂体积的质量体积比，如1％指1g明胶分散于100ml的水溶液中。

所述干燥为真空干燥，真空度为-35～(-25)kpa,干燥温度为22-26℃，干燥时间为24-48h；

所述煅烧为煅烧温度600-800℃，时间3-5h；所述静电纺丝采用的纺丝液为高分子聚合物溶液、无机材料溶液和溶剂的混合液；所述静电纺为共轭静电纺。

所述高分子聚合物为高温下容易碳化的大分子材料。

所述高分子聚合物为聚乙烯吡咯烷酮pvp、明胶、丝素中的一种或几种；无机材料溶液为生物玻璃盐溶液、硼硅酸盐溶液中的一种；所述溶剂为六氟异丙醇；所述共轭静电纺为工艺参数为:正向电压15-18kv，负向电压15-18kv，纺丝速率0.03-0.05ml/min，共轭纺丝距离35-40cm，共轭纺丝针头20g，与水平呈30-45°角，缠绕辊转速15-25rpm/min，缠绕辊上悬垂的锡箔纸作为接收装置。

所述高分子聚合物溶液的质量百分浓度为10％-20％；无机材料溶液质量百分浓度为5％-15％；所述混合液中高分子聚合物溶液、无机材料溶液和溶剂的体积比范围值为1:1:1～5:5:1。

进一步地，所述高分子聚合物溶液、无机材料溶液和溶剂的体积比为2：2：1。

所述生物玻璃盐溶液：含原硅酸四乙酯、磷酸三乙酯、四水硝酸钙、硝酸锶、hcl、无水乙醇、去离子水，混合，得到生物玻璃盐溶液；

其中原硅酸四乙酯、磷酸三乙酯、四水硝酸钙、硝酸锶的质量比为0.5-1.5：0.1-0.5：0.1-0.5：0.1-0.5。

其中原硅酸四乙酯、磷酸三乙酯、四水硝酸钙、硝酸锶质量比为1.34：0.116：0.148：0.132。

进一步如：所述生物活性玻璃盐溶液配置，原硅酸四乙酯称取1.34g、磷酸三乙酯称取0.116g、四水硝酸钙称取0.148g、硝酸锶称取0.132g、1mol/lhcl量取0.1ml、无水乙醇量取4ml、去离子水3ml，在磁力搅拌器作用下制备生物玻璃盐溶液。

所述步骤(1)中无机纳米短纤维混合液的含固率(固体质量/溶剂体积，g/ml)为1％-3％。

所述步骤(2)中设计三维镂空柱体模型，建模时模型选择柱体，直径和高度可根据实际需求进行设定，三维打印镂空柱体支架，打印机针头移动速度和喷料速度根据所需线条要求进行调整。

所述步骤(2)中镂空柱体支架的材料为高分子聚氨酯，直径6-12mm，高度3-8mm，平面线条交联角度选择4组，角度任意，如每4个平面作为一个周期，第一个平面作为角度基准设为0°，其它三个平面线条可与第一个平面线条角度呈45°、90°、135°等各种不同组合，进而打印时形成镂空柱体结构；三维打印具体工艺为：打印机针头移动速度为1.0-1.2mm/s，喷料速度为0.02-0.03mm/s，打印机管腔温度为78-80℃，打印机针头温度为75-80℃，针头选用23g点胶针头，平面线距3.0-4.0mm。其中所述高分子聚氨酯为聚己内酯(分子量65000)或聚乳酸聚己内酯(分子量300000)。

所述步骤(3)中浇筑成型具体为：将镂空柱体支架与套筒进行组装，然后将无机纳米纤维混合液浇筑在模具中，浇筑好后先置于-20℃条件下2-4h，再置于-80℃条件下12-24h，然后放入冷冻干燥机中24-48h冷冻干燥；所述交联为放置在戊二醛蒸汽中交联24-48h；所述浸泡谷氨酸溶液为浸泡再含谷氨酸的0.5m盐酸溶液中12-24h，其中谷氨酸的浓度为0.3-10％，浸泡在谷氨酸溶液中的目的是中和残留的戊二醛，避免大骨修复三维支架存在细胞毒性。

所述步骤(3)中去离子水漂洗2-3次，目的是去除残留在大骨修复三维支架里的谷氨酸。

所述步骤(3)中模具材料为聚四氟乙烯，模具外壁和底部类似于光滑水杯的内壁结构，浇筑冻干后支架形成实心柱体结构。

所述模具的尺寸取决于细胞实验、动物实验及临床应用的需要，可进行定制调整，如细胞实验需要直径为10mm、厚度3mm的片状结构，模具内径可设为10mm，高度可设为3.2mm；动物实验需要直径6mm，高为5mm的柱体支架，模具内径可设为6mm，高度可设为5.2mm。

本发明提供的一种所述复合无机纳米纤维支架在制备大块骨缺损的修复、骨再生支架中的应用。

本专利利用建模软件建立镂空柱体模型，通过三维打印技术制备镂空pcl(聚己内酯)柱体支架，因pcl具有较长的降解周期和力学强度，进而镂空柱体支架可为支架提供长期的力学支撑。

本发明通过静电纺丝如共轭静电纺丝获得pvp/无机纳米纤维膜，如pvp/生物玻璃纳米纤维膜，再进一步通过高温煅烧去除pvp成分，同时无机单盐成分高温下形成相应金属氧化物和非金属氧化物，进而获得无机纳米纤维膜；将无机纳米纤维膜溶于一定质量体积比的明胶水溶液体系中，通过均质机处理获得无机短纳米纤维混合液；利用定制的套筒模具对镂空柱体支架和无机短纳米纤维混合液进行组装浇筑；对组装浇筑好的支架进一步通过冷冻干燥、交联、氨基酸浸泡等方式获得大骨修复三维支架。

本专利制备的大骨修复支架，主体力学支撑结构为三维打印技术制备的镂空pcl柱体支架；骨细胞生长的微环境由生物活性玻璃等无机材料的气凝胶提供；通过实际需求定制模具组装镂空pcl柱体支架和无机材料气凝胶，对浇筑的未交联的大骨修复支架采用化学交联，交联后的支架进行氨基酸浸泡、去离子水漂洗、干燥等工艺处理，进而获得成熟的大骨修复支架；该大骨修复支架中的pcl可提供具备较强的力学性能，通过三维建模可实现材料的个性化定制性，可为机体大骨的缺损修复提供支架材料，进而为骨组织的治疗和再生提供了潜在的替代方案。

有益效果

(1)大骨修复三维支架中灌注的无机材料如生物活性玻璃气凝胶，因该气凝胶是借助明胶水溶液体系作为交联体系，因此气凝胶具片层多孔结构，可挤压，类似优良吸水性的海绵结构材料。

(2)无机材料如生物活性玻璃气凝胶具有合适的孔结构(孔大小30-150um)，有利于细胞的生长和增殖，能够促进软骨细胞在支架内的增殖成熟和分泌基质(图6)。

(3)镂空柱体支架的参数如线距、线条交联角度、柱体高度及直径等参数可直接通过三维打印进行调控，进而可制备不同要求的镂空柱体支架，该操作简单方便，可行性强。

(4)三维打印复合无机纳米纤维气凝胶制备大骨修复的支架，对支架制备的参数可根据实际的需求进行调整定制，如调整模具的内径和高度，便可制备不同尺寸的大骨修复支架，从而实现对大骨修复支架的个性化定制。

(5)三维打印的pcl镂空柱体支架，因pcl材料具备优良的刚性和作为粗线条形式存在时只具有较弱的降解性能，从而能够为大骨缺损修复提供长期稳定的力学支撑(图8)。

(6)本发明利用静电纺丝技术制备无机生物纳米纤维膜，三维打印制备镂空柱体支架，结合套筒进一步制备具有大骨修复三维支架。大骨修复三维支架中的灌注的气凝胶，有利于细胞的生长和黏附，而中间主体镂空柱体支架结构则提供长期的力学支撑，维持支架形貌结构的稳定(图9)，从而使大骨修复三维支架成为具有潜力的骨缺损修复替代物。制备方法包括:利用静电纺丝、高温煅烧、分散机匀浆等技术，获得无机短纳米纤维混合液；利用三维打印技术，制备镂空柱体支架；根据细胞实验、动物实验及临床应用等实际需求的参数，个性化的定制套筒，利用套筒对无机短纳米纤维混合液和镂空柱体支架进行组装和浇筑，进而获得成型未交联的大骨修复三维支架；再进一步利用戊二醛交联、谷氨酸浸泡处理等方式获得成熟的大骨修复三维支架。本发明技术简单,可重复性好,个性化定制性能优良，可为大段骨的缺损修复提供替代物。

与现有三维生物组织工程支架相比，本专利制备的支架通过三维打印制作镂空柱体，模型设计及操作简单。结合液体浇筑技术，通过模具可以制备不同形貌支架，可实现个性化定制。从材料来看，本专利使用的生物玻璃成分与生物体骨成分类似，且通过纺丝技术将生物玻璃制成纳米纤维，具备更高的比表面积，进而对骨组织的修复有良好的促进作用。

附图说明

图1大骨修复支架的制作流程图；

图2镂空柱体支架；

图3浇筑模具；

图4干态大骨修复支架；

图5湿态大骨修复支架；

图6大骨修复支架微观结构图：(a)为大骨修复支架中pcl镂空柱体与生物玻璃分布的低倍电镜图；(b)为大骨修复支架中pcl镂空柱体与生物玻璃分布的高倍电镜图。

图7大骨修复支架应力-应变图。

图8pcl体外降解。

图9支架体外降解6周图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)pvp乙醇溶液：称取分子量为1300000的pvp(上海泰坦科技股份有限公司)质量1.65g，在磁力搅拌器下溶于10ml乙醇(≥95％,国药集团化学试剂有限公司)中，制得pvp乙醇溶液。

(2)生物玻璃盐溶液：原硅酸四乙酯(98％，罗恩试剂)称取1.34g、磷酸三乙酯(99.5％，罗恩试剂)称取0.116g、四水硝酸钙(500g,北京伊诺凯科技有限公司上海分公司)称取0.148g、硝酸锶(≥99.5％,沪试)称取0.132g、1mol/lhcl量取0.1ml、无水乙醇量取4ml、去离子水量取3ml，在磁力搅拌器作用下制备生物玻璃盐溶液。

(3)制备纺丝液：将(1)和(2)制备得pvp乙醇溶液、生物玻璃盐溶液与六氟异丙醇，按照2：2：1的体积比例混合，在磁力搅拌器作用72h后制成生物玻璃纺丝液。

(4)生物玻璃共轭纺丝：利用共轭纺丝机对生物玻璃纺丝液静电纺丝，正向电压16.75kv,负向电压16.75kv,纺丝速率0.05ml/min,共轭纺丝距离40cm，共轭纺丝针头与水平呈35°角，缠绕辊转速25rpm/min，缠绕辊上悬垂的锡箔纸作为接收装置。接收到的pvp/生物玻璃纳米纤维膜需在真空度为-25kpa，干燥温度为25℃的条件下，真空干燥24h。

(5)生物玻璃纳米纤维膜制备：pvp/生物玻璃纳米纤维膜需经600℃煅烧5h，去除纳米纤维膜中的pvp成分，进而获得生物玻璃纳米纤维膜。

(6)制备明胶水溶液：称取明胶(分子量>8000，mpbiomedicals，llc)1.0g，溶于100ml70℃热水中，制备得含固率为1.0％的明胶水溶液。

(7)制备生物玻璃纳米短纤维混合液:称取生物玻璃纳米纤维膜1g，置于100ml明胶水溶液中，经转速为10000rmp的匀质机匀浆处理10min，获得生物玻璃含固率为1％的生物玻璃纳米短纤维混合液。

(8)建立镂空柱体模型：建模时模型选择柱体，直径设为12mm，高度设为6mm，平面线条交联角度选择4组，角度组合设定为0°、45°、90°、135°。

(9)三维打印镂空柱体：选用分子量为65000的聚己内酯pcl(500g，aldrich)打印机针头移动速度为1.0mm/s，喷料速度为0.02mm/s，打印机管腔温度为80℃，打印机针头温度为77℃，针头选用23g点胶针头，平面线距3.5mm。

(10)生物玻璃纳米短纤维混合液与模具组装：将12mm的镂空柱体支架与定制的内径为12mm、高6mmde套筒进行组装。

(11)生物玻璃纳米短纤维混合液浇注及冷冻干燥成型：将制备的生物玻璃纳米短纤维混合液浇筑在镂空柱体支架与套筒组装好的模具中，随后置于-20℃的冰箱中2h,再置于-80℃的冰箱中12h，然后放入冷冻干燥机中48h至完全冷冻干燥，得到生物玻璃纳米短纤维未交联的大骨修复支架。

(12)大骨修复支架戊二醛交联：在戊二醛交联过程中，将未交联的大骨修复支架从模具中取出，放置戊二醛蒸汽中交联24h，即可得到交联后的大骨修复支架。

(13)大骨修复支架谷氨酸浸泡处理：将大骨修复支架浸泡在含有5％谷氨酸的0.5m盐酸溶液中48h，并用去离子水浸泡和冲洗3次以除去支架中残余的戊二醛，避免大骨修复支架因戊二醛残留存在细胞毒性。

(14)大骨修复支架干燥处理：大骨修复支架经谷氨酸浸泡处理后，随后置于-20℃的冰箱中2h,再置于-80℃的冰箱中12h，然后放入冷冻干燥机中48h至完全冷冻干燥，得到生物活性玻璃含固率为1％的大骨修复支架。

(15)本专利定制的支架简单，制备的支架直径为10mm，高度为12mm，气凝胶孔结构大小30-150um，内部pcl支架体外降解4周时，还有96.99的质量保留；制备的大骨修复支架使用10mm的圆柱状三维支架用万能材料试验机进行压缩测试，在40％形变下，数据表明，支架在16.1％的形变条件下出现最大压力1.16mpa，具有良好的抗压力性能，当形变逐渐减小至消失，支架逐渐恢复且仍然保持最初的形态，具有较好的力学稳定性。