海洋寡糖在制备用于预防和治疗老年性黄斑变性疾病的药物中的应用

文档序号:25992678发布日期:2021-07-23 21:05阅读:135来源:国知局
海洋寡糖在制备用于预防和治疗老年性黄斑变性疾病的药物中的应用

本发明属于药物领域,涉及到寡糖类化合物在制药中的新用途,具体涉及海洋寡糖在制备用于预防和治疗老年性黄斑变性疾病的药物中的应用。



背景技术:

老年性黄斑变性疾病(age-relatedmaculardegeneration,amd)是一类极为常见的眼科疾病,是致使老年人失明的第三大“杀手”。患者的症状表现为视力进行性、不可逆的下降,最终导致失明。随着我国人口老龄化程度的加剧,患老年性黄斑变性疾病的人群逐渐地增多。这不仅给患者自身带来巨大的病痛,也给患者家庭和社会造成了严重的经济和精神负担。

目前amd的治疗手段主要包括手术治疗和药物治疗,但治疗效果并不能让人满意,且存在较大的风险和毒副作用。因此,急需开发一种疗效好、毒副作用低的预防或治疗amd的新型药物。

大量研究表明amd发病机制与慢性氧化应激和炎症密切相关,能够引起视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelium,rpe)的退化,因此抑制rpe细胞的氧化损伤成为了预防和治疗amd新的方向。壳寡糖和几丁质寡糖在抗氧化方面应用较多,有望开发成一种局部给药的抗氧化剂,用于预防和治疗老年性黄斑变性等退行性疾病。



技术实现要素:

本发明提供了海洋寡糖在制备用于预防和治疗老年性黄斑变性疾病的药物中的应用。所述的海洋寡糖具有良好的视网膜色素上皮细胞保护作用,能够提高细胞的抗氧化能力和抗损伤能力,并用于制备预防和治疗老年性黄斑变性疾病的药物。

为实现上述发明目的,本发明采用下述技术方案予以实现:

本发明提供了海洋寡糖在制备用于预防和治疗老年性黄斑变性疾病的药物中的应用。

进一步的:所述海洋寡糖包括壳寡糖及其药学上可接受的盐、几丁质寡糖及其药学上可接受的盐。

进一步的:所述的壳寡糖包括聚合度为50以内的壳寡糖单体中的至少一种,其是以壳聚糖为原料经酶解法制备得到的,其分子骨架为β-d-(1→4)-氨基葡萄糖连接的线性寡聚物,结构示意式如下:

式中n≤50,药用盐形式为盐酸盐或硫酸盐。

进一步的:所述的几丁质寡糖包括为聚合度50以内的几丁质寡糖单体中的至少一种,其是以所述壳寡糖为原料经n-乙酰化修饰法制备得到的,其分子骨架为β-d-(1→4)-乙酰氨基葡萄糖连接的线性寡聚物,结构示意式如下:

式中n≤50。

进一步的:所述壳寡糖和几丁质寡糖能够降低丙烯醛诱导的视网膜色素上皮细胞arpe-19的细胞损伤,从而起到保护细胞的作用。

进一步的:所述壳寡糖和几丁质寡糖能够提高丙烯醛诱导的视网膜色素上皮细胞arpe-19的细胞活力,且能够将细胞活力提高到80%及以上。

进一步的:所述壳寡糖和几丁质寡糖能够显著抑制丙烯醛引起的胞内和线粒体内活性氧ros的产生,从而阻止视网膜色素上皮细胞arpe-19氧化损伤的发生,但其对正常arpe-19细胞的ros水平无影响。

进一步的:所述壳寡糖和几丁质寡糖能够显著抑制丙烯醛引起的线粒体膜电位mmp的降低,但其对正常arpe-19细胞的线粒体膜电位无影响。

进一步的:所述壳寡糖和几丁质寡糖能够显著抑制丙烯醛引起的胞内谷胱甘肽水平gsh水平的降低,从而达到增强视网膜色素上皮细胞arpe-19抗氧化能力的作用,但对正常arpe-19细胞的胞内谷胱甘肽水平无影响。

进一步的:所述壳寡糖和几丁质寡糖能够显著抑制丙烯醛引起的超氧化物歧化酶sod和谷胱甘肽过氧化物酶gsh-px酶活力的降低,从而达到增强视网膜色素上皮细胞arpe-19抗氧化能力的作用,但对正常arpe-19细胞的sod、gsh-px酶活力无影响。

进一步的:所述壳寡糖和几丁质寡糖能够显著抑制丙烯醛引起的细胞中转录因子nrf2的核转移能力及其下游抗氧化酶血红素加氧酶1(ho-1)、醌氧化还原酶1(nqo1)的基因的表达水平的降低,从而提高视网膜色素上皮细胞arpe-19的抗氧化能力,但对正常arpe-19细胞的nrf2的核转移能力及其下游基因的表达水平无影响。

本发明还提供了一种预防和治疗老年性黄斑变性疾病的药物,所述药物含有海洋寡糖。

进一步的:所述药物为口服剂、注射剂、涂剂、洗剂、气雾剂或喷雾剂。

与现有技术相比,本发明的优点和有益效果是:

本发明通过一系列生物学实验和药理学实验证明海洋寡糖中的壳寡糖和几丁质寡糖系列化合物对丙烯醛诱导的arpe-19细胞损伤具有显著的保护作用,能够减少氧化应激引起的线粒体功能障碍,显著提高线粒体膜电位,有效降低细胞内以及线粒体内ros的堆积;促进nrf2的核转移,促进下游抗氧化酶的表达,提高细胞内gsh水平、sod和gsh-px的酶活,从而增强arpe-19细胞的抗氧化能力,对视网膜色素上皮细胞起到保护作用,减少视网膜色素上皮细胞的退化与凋亡;表明壳寡糖和几丁质寡糖可作为治疗药物应用于老年性视黄斑变性疾病的治疗。而且,本发明产品源于海洋天然多糖,具有资源丰富,易于产业化,安全有效等优点。另外壳寡糖和几丁质寡糖具有制备简单,结构明确,纯度较高等诸多优点。本发明为老年性视黄斑变性疾病的治疗药物的开发提供了新的化合物和思路。

附图说明

图1为壳二糖的高效液相色谱图(hplc)、质谱检测图(ms)和核磁共振氢谱(1h-nmr)。

图2为几丁质二糖的高效液相色谱图(hplc)、质谱检测图(ms)和核磁共振氢谱(1h-nmr)。

图3为壳寡糖单体和几丁质寡糖单体对丙烯醛诱导arpe-19细胞损伤的保护作用;其中con为空白对照组、mod为模型组、nac为阳性药组。

图4为壳寡糖单体cos-5和几丁质寡糖单体n-5对丙烯醛诱导的arpe-19细胞ros含量影响;其中control为空白对照组、model为模型组、nac为阳性药组。

图5为壳寡糖单体的cos-5和几丁质寡糖单体n-5对丙烯醛诱导的arpe-19细胞线粒膜电位的影响;其中control为空白对照组、model为模型组、nac为阳性药组。

图6为壳寡糖单体的cos-5和几丁质寡糖单体n-5对丙烯醛诱导的arpe-19细胞抗氧化能力的影响;其中control为空白对照组、model为模型组。

图7为几丁质寡糖单体n-5对丙烯醛诱导的arpe-19细胞抗氧化酶系统的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细的解释说明。

实施例1:壳寡糖单体的制备

本发明采用酶解法制备壳寡糖。配置10%(质量体积比)的壳聚糖悬浊液,加入适量的盐酸和自制的壳聚糖酶(由鲑鱼肾杆菌发酵制得,公开于专利cn2012102127915中),50℃降解至溶液澄清,100℃,10min灭酶活。将溶液过滤,滤液喷雾干燥后,用70%的乙醇醇沉,10000rpm/min离心,收集上清,减压浓缩,获得壳寡糖混合物。采用bio-gelp4和bio-gelp4fine分离纯化壳寡糖混合物,获得不同聚合度的壳寡糖单体。所得的寡糖单体经高效液相色谱(hplc)进行纯度分析,利用质谱、核磁对其进行结构确证。

以壳二糖(cos-2)为例进行说明。cos-2的高效液相色谱图见附图1a,为一单峰,纯度高,为95%。图1b为cos-2的质谱图,其中m/z341.2的峰为cos-2的[m+h]+离子峰,m/z363.2为cos-2的[m+na]+峰。图1c为cos-2的1h-nmr图,1hnmr(500mhz,d2o)δ5.47(d,0.65h,j=3.6hz,h-1α),4.99(d,0.35h,j=8.5hz,h-1β),4.91(d,1h,j=8.3hz,h-1′),4.10-4.03(m,2h,h-5,h-3),3.99-3.83(m,5h,h-6′-1,h-4,h-3′,h-5′,h-6-1),3.83-3.69(m,3h,h-6′-2,h-6-2,h-4′),3.37(dd,0.67h,j=3.7,10.6hz,h-2α),3.16(d,1h,j=10.6hz,h-2′),3.08(dd,0.33h,j=8.5,10.6hz,h-2β).

实施例2:几丁质寡糖单体的制备

本发明采用n-乙酰化修饰法制备几丁质寡糖。将1g实施例1制得的壳寡糖混合物(聚合度1~10)加入到35ml甲醇的水溶液中(甲醇∶水=8∶1,v/v),摇匀后,加入756mg的nahco3,冰浴条件下滴加5ml的ac2o,20min后撤去冰浴,室温反应4h。过滤,蒸干,得到几丁质寡糖混合物。几丁质寡糖混合物经石墨化炭黑柱层析分离制得不同聚合度的几丁质寡糖单体。所得的寡糖单体经高效液相色谱(hplc)进行纯度分析,利用质谱、核磁对其进行结构确证。

以几丁二糖(n-2)为例进行说明。n-2的高效液相色谱图见附图2a,为一单峰,纯度高,为98%。图2b为n-2的质谱图,其中m/z425.2的峰为n-2的[m+h]+离子峰,m/z447.2为n-2的[m+na]+峰。图2c为n-2的1h-nmr图,1hnmr(500mhz,d2o)δ5.21(d,0.65h,j=2.5hz,h-1α),4.71(d,0.35h,j=7.9hz,h-1β),4.61(d,0.6h,j=8.5hz,h-1′α),4.60(d,0.4h,j=8.4hz,h-1′β),3.97-3.46(m,12h,h-2,3,4,5,6-1,6-2,h-2′,3′,4′,5′,6-1′,6-2′),2.08,2.05(2s,6h,2×nhcoch3).

实施例3:壳寡糖单体和几丁质寡糖单体对丙烯醛诱导arpe-19细胞损伤的保护作用

利用丙烯醛损伤arpe-19细胞,建立体外细胞模型。利用此细胞模型检验壳寡糖单体、几丁质寡糖单体在体外水平对视网膜色素上皮细胞的保护作用,计算相应的细胞活力,阳性对照采用n-乙酰半胱氨酸(nac)。

将arpe-19细胞按2.5×104/孔接种于96孔细胞培养板中,培养24h后,吸走旧的培养基,分别设定空白对照组、模型组、样品保护组(图3a中样品为壳寡糖单体,图3b中样品为几丁质寡糖单体)、阳性药组(400μmol/l的nac)。其中,样品保护组分别加入200μl含样品的新鲜培养基,使样品的终浓度为200μmol/l(低剂量组)、400μmol/l(中剂量组)、800μmol/l(高剂量组);阳性药组加入200μl含nac的培养基;空白对照组和模型组分别加入含等体积pbs溶液的培养基,各组细胞继续孵育48h,吸去旧的培养基后,模型组、阳性药组和样品保护组再加入200μl含有75μmol/l丙烯醛acrolein的培养基,空白对照组加入等体积的培养基,继续培养24h后,mtt检测细胞活力。

结果如图3a和图3b所示,模型组中75μmol/l丙烯醛作用细胞后具有明显的损伤作用,细胞活力降低为50%左右,但壳寡糖单体(cos-2~6)和几丁质寡糖单体(n-2~6)预处理组能够明显降低丙烯醛诱导的arpe-19细胞损伤,提高细胞活力,并呈现一定的剂量依赖性。其中,聚合度为5的壳寡糖单体cos-5和几丁质寡糖单体n-5活性最佳,可将细胞活力提高至80%,因此选择cos-5和n-5进行后续实验。

实施例4:cos-5和n-5对丙烯醛损伤的arpe-19细胞ros含量的影响

利用丙烯醛损伤arpe-19细胞,建立体外细胞模型。利用此细胞模型检测cos-5和n-5对丙烯醛诱导的活性氧((reactiveoxygenspecies,ros)堆积的影响,阳性对照采用n-乙酰半胱氨酸(nac)。

将arpe-19细胞按2.5×104/孔接种于96孔细胞培养板中,培养24h后,吸走旧的培养基,分别设定空白对照组、样品对照组、模型组、样品保护组、阳性药组(400μmol/l的nac)。其中,样品对照组和样品保护组中分别加入200μl含cos-5或n-5的新鲜培养基,使样品的终浓度为400μmol/l;阳性药组加入200μl含nac的培养基;空白对照组和模型组分别加入含等体积pbs溶液的培养基,继续孵育48h,吸去旧的培养基后,模型组、阳性药组和样品保护组分别加入200μl含有75μmol/l丙烯醛的培养基,空白对照组和样品对照组加入等体积的培养基,继续培养24h后,吸去旧的培养基,用pbs溶液洗涤细胞2次后,按照试剂盒说明书操作,分别用dcfh-da和mitotrackerredcm-h2xros荧光探针进行活性氧ros测定。

结果如图4a和图4b所示,丙烯醛损伤细胞24h后,细胞内和线粒体内的ros的含量显著升高。与模型组相比,cos-5和n-5预处理组的ros水平显著地降低,表明cos-5和n-5可以抑制丙烯醛诱导的arpe-19细胞内和线粒体内的ros水平的升高。样品对照组结果表明:cos-5和n-5对于正常细胞的胞内和线粒体中的ros水平并无影响。

实施例5:cos-5和n-5对丙烯醛诱导的细胞线粒体膜电位(mmp)的影响

利用丙烯醛损伤arpe-19细胞,建立体外细胞模型。利用此细胞模型检测cos-5和n-5对丙烯醛诱导的细胞线粒体膜电位(mitochondrialmembranepotential,mmp)的影响,阳性对照采用n-乙酰半胱氨酸(nac)。

将arpe-19细胞按2.5×104/孔接种于96孔细胞培养板中,培养24h后,吸走旧的培养基,分别设定空白对照组、样品对照组、模型组、样品保护组、阳性药组(400μmol/l的nac)。其中,样品对照组和样品保护组分别加入200μl含cos-5或n-5的新鲜培养基,使样品的终浓度为400μmol/l;阳性药组加入200μl含nac的培养基;空白对照组和模型组分别加入含等体积pbs溶液的培养基,继续孵育48h,吸去旧的培养基后,模型组、阳性药组和样品保护组分别加入200μl含有75μmol/l丙烯醛的培养基,空白对照组和样品对照组加入等体积的培养基,继续培养24h后,吸去旧的培养基,用pbs溶液洗涤细胞2次后,按照试剂盒说明书操作,利用jc-1荧光探针测定线粒体膜电位(mmp)。

结果如图5所示,与空白对照组相比,丙烯醛损伤细胞24h后,细胞线粒体膜电位显著降低。与模型组相比,cos-5和n-5预处理组的mmp显著升高,表明cos-5和n-5可以抑制丙烯醛诱导的arpe-19细胞线粒体膜电位下降。样品对照组结果表明:对于正常状态下的arpe-19细胞,cos-5和n-5不能改变细胞的线粒体膜电位。

实施例6:cos-5和n-5对丙烯醛诱导的细胞抗氧化能力的影响

将arpe-19细胞按5×105/ml种于12孔细胞培养板中,培养24h后,吸走旧的培养基,分别设定空白对照组、样品对照组、模型组、样品保护组。其中,样品对照组和样品保护组分别加入1ml含cos-5或n-5的新鲜培养基,使样品的终浓度为400μmol/l;空白对照组和模型组分别加入含等体积的pbs溶液的培养基,继续孵育48h,吸去旧的培养基后,模型组和样品保护组加入1ml含有75μmol/l丙烯醛的培养基,空白对照组和样品对照组加入等体积的培养基,继续培养24h后,吸去旧的培养基,用pbs溶液洗涤细胞2次后,利用试剂盒分别检测胞内还原型谷胱甘肽(glutathione,gsh)水平、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,gsh-px)酶活力。

结果如图6所示,与空白对照组相比,丙烯醛损伤细胞24h后,细胞内gsh水平显著下降,sod和gsh-px的酶活力显著下降。与模型组相比,cos-5和n-5预处理组的gsh水平显著升高,sod和gsh-px的酶活力也显著升高,表明cos-5和n-5可以抑制丙烯醛诱导的arpe-19细胞胞内谷胱甘肽水平的下降,进而增强了arpe-19细胞的抗氧化能力。样品对照组结果表明:对于正常状态下的arpe-19细胞,cos-5和n-5不能提高细胞的抗氧化能力。

实施例7:n-5对nrf2核转移能力以及下游抗氧化酶表达的影响

将arpe-19细胞按5×105/ml种于6孔细胞培养板中,培养24h后,吸走旧的培养基,分别设定空白对照组,样品对照组,模型组,样品保护组。其中,样品对照组和样品保护组分别加入2ml含n-5的新鲜培养基,使样品的终浓度为400μmol/l,空白对照组和模型组分别加入含等体积的pbs溶液的培养基,继续孵育48h后,吸去旧的培养基,模型组和样品保护组加入2ml含有75μmol/l丙烯醛的培养基,空白对照组和样品对照组加入等体积的培养基,继续培养24h后,吸去旧的培养基,用pbs溶液洗涤细胞2次后,按照试剂盒要求分别对核内转录因子nrf2的蛋白表达以及下游血红素加氧酶1(hemeoxygenase,ho-1)和醌氧化还原酶1(nad(p)h:quinoneoxidoreductase1,nqo1)基因的mrna表达进行检测。

结果如图7所示,与空白对照组相比,加入丙烯醛损伤后,核内的nrf2蛋白水平(图7a)以及ho-1、noq1的mrna表达(图7b、7c)显著下降,而n-5预处理组能够提高nrf2蛋白的核转移能力以及下游的抗氧化酶的表达,提高ho-1和noq1的mrna的水平,进而提高arpe-19细胞的抗氧化能力,发挥了n-5对细胞的保护作用。样品对照组结果表明:对于正常状态下的arpe-19细胞,n-5不能提高nrf2的核转移和抗氧化酶的表达。

综上,本发明所述的壳寡糖单体和几丁质寡糖单体对丙烯醛诱导的arpe-19细胞损伤具有保护作用,能够显著地抑制细胞内以及线粒体内ros的生成,且定位于线粒体并提高了线粒体膜电位,减少丙烯醛对线粒体的氧化损伤,同时还能够提高细胞内gsh水平以及sod和gsh-px的酶活,提高nrf2的核转移能力,并促进下游抗氧化酶(ho-1、nqo1)的表达,增强了arpe-19细胞的抗氧化能力,减少丙烯醛诱导引起的氧化损伤,进而发挥壳寡糖单体和几丁质寡糖单体对细胞的保护作用,减少视网膜色素上皮细胞的退化与凋亡。而壳寡糖单体和几丁质寡糖单体对于正常状态的arpe-19细胞并不能增强其抗氧化能力。

本发明的壳寡糖和几丁质寡糖具有制备简单,结构明确,纯度较高等诸多优点,并且在体外水平上证明其对丙烯醛诱导的arpe-19细胞损伤具有显著的保护作用及其作用机制,为老年性黄斑变性疾病类药物的开发提供了新的途径。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案,而非对其进行限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的普通技术人员来说,依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

当前第1页1 2 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1