改进的疫苗组合物和使用方法与流程

本申请是申请日为2013年9月23日，中国国家申请号为201380060902.8，发明名称为“改进的疫苗组合物和使用方法”的发明申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请依据35usc§119(e)，要求2012年9月21日提交的美国临时申请系列号61/703,814的权益，其公开的全部内容通过引用结合到本文中。

尽管在免疫学领域内的研究量和兴趣不断增加，目前仍缺乏足以有效对抗各种传染性病原体或疾病如疟疾、hiv、丙型肝炎、流感和结核病的疫苗。例如，当前的流感疫苗诱导对抗来自病毒的两种主要表面蛋白(血凝素和神经氨酸酶)的抗体。因此，当前的流感疫苗仅有效地防止病毒株的感染，所述病毒株表达存在于疫苗中的这些蛋白的版本。然而，由于突变和重新分类，这两种表面蛋白频繁地改变。因此，流感疫苗必须每年重新配制以含有新形成的病毒株的血凝素和神经氨酸酶表面蛋白。

此外，流感病毒感染，特别是大流行株如h1n1和h5n1，代表一个不断增长的全球健康风险。该风险在老年人和在患有慢性疾病的人中明显更大，往往在这些患者群体中导致更高的死亡率。接种疫苗已是控制疾病的一个成功的手段。然而，由于在大流行中疫苗的潜在有限的可用性，由于当前的生产方法，以及也由于在老年人中的有限的效果，更有效的生产方法以及更有效的流感疫苗正在探寻中。对抗传染性病原体的流感疫苗和其它疫苗(其将有效对抗多个病原株，称为“通用疫苗”)正在积极探寻中。此外，当前的流感疫苗的效果显著变化。特别是由于与流感大流行株有关的健康风险，与流感抗原适配的并且能使当前抗原储备有效剂量节省的安全和有效的佐剂也正在积极探寻中。

诸如疟疾、hiv、丙型肝炎和结核病的病原体是细胞内的，需要诱导强的细胞免疫力(包括细胞毒性反应(ctl))以除去感染的细胞。这是公认的，即抗体应答的发展可通过传统的佐剂如明矾和弗氏佐剂(freund’sadjuvant)进行刺激。一些佐剂当用t-细胞表位肽配制时能引起t-细胞应答，这也是公认的。然而，大多数现有的佐剂，当与全蛋白或与病毒或细菌亚单位疫苗(以及活的和减毒的病毒疫苗)配制时，缺乏内化和加工抗原经由mhci类和ii类两者呈递以诱导细胞和抗体二者混合的免疫应答的能力。现在应该理解，许多疫苗将需要刺激体液和细胞两种免疫应答至足够有效。现在已知mhci类限制的cd8+t细胞的共同生成对于针对病毒和其它细胞内感染的疫苗是必要的。因此，开发基于减毒的病原体和含有重组抗原的无生命载体的疫苗存在着障碍，因为对于这样的作用剂来说，接近mhci类和ii类两者-限制的抗原加工途径是必要的。

特别是，使包含外源性蛋白加工的“交叉-呈递”能够通过i类和ii类加工途径进行，以改进亚单位和活病原体疫苗对抗各种细菌和病毒病原体的保护效果的方法是非常需要的。使“交叉-呈递”能够通过i类和ii类加工途径进行，产生抗体应答和t-细胞应答两者。

发明背景和简述

如上所述，免疫已难以诱导抵抗在新出现的流感株中发现的蛋白，如在引起禽流感的h5n1病毒中的那些蛋白。普遍认为困难出现部分是因为存在能识别一年生(annual)的病毒株(但不是新的病毒株)的记忆细胞。然而，需要初次应答以防御新出现的病毒株，因为它们在抗原性上更加不同于一年生的流感株。这样的初次应答通常需要加入佐剂。

加入佐剂(例如，mf59、aso3或铝盐)至流感疫苗中增加抗体滴度和持久性。然而，这些方法并不提供对该病毒的不同亚型的交叉-反应性。cd8+t细胞识别该病毒的不易变化的部分并可提供可由新疫苗诱导的更多交叉-反应性应答。

流感疫苗开发以及对于其它病原体的疫苗的焦点，最近一直朝着生成能够提供更多的交叉-反应性保护作用的记忆cd8+t细胞转移。如上所提及的，cd8+t细胞识别的抗原发现于病毒的不易变化的部分。已尝试了几种方法。例如，由cd8+t细胞识别的肽与脂质部分(pam-2-cys)结合，后者激活dc上的tlr以启动保护性cd8+t细胞。这种疫苗当经由鼻内递药给予时，生成迁移至肺的保护性cd8+t细胞。

cd8+t细胞特异性检测侵入胞浆的作用物，如病毒，且对cd8+t细胞的抗原呈递的要求不同于对cd4辅助t-细胞的那些。抗原通过mhc中编码的分子被传送到细胞表面。内化的抗原由mhcii类携带到细胞表面，这促进了cd4+t-细胞的激活。相反，内源性抗原通过mhci类到达细胞表面，这激活cd8+t-细胞。为激活细胞毒性t-细胞(cd8+)，由dc内化的抗原必须在再次出现在细胞表面上之前与mhci类途径交叉，一种称为交叉-呈递的过程，对于这个过程，dc的特定子集被特化。能够激活抗原交叉-呈递的佐剂系统正在积极探寻中并在开发新一代疫苗中是必要的。

存在几种其它感染，例如肝炎、hiv和疟疾，抗体对它们提供不充分的保护作用。在这些情况下，由抗体介导的体液免疫，和细胞-介导的免疫(其取决于细胞毒性t细胞或通过细胞因子激活免疫细胞的t细胞)二者可能对有效的保护是需要的。

树突状细胞(dc)是启动t细胞应答的主要抗原-呈递细胞，因而是佐剂应用的主要靶标。在存在感染时，信号通过对微生物成分的模式-识别受体(prr)被直接送到dc，和通过其它识别微生物成分的先天免疫细胞释放的炎性细胞因子间接送到dc。这些信号诱导dc的成熟并使它们迁移到次级淋巴器官，在那里它们能够与幼稚(naïve)t细胞相互作用并激活幼稚(naïve)t细胞。dc的成熟涉及微生物蛋白的增加的处理和它们对t细胞在主要组织相容性复合体(mhc)分子上的呈递。

已证实一些佐剂激活诱导t辅助细胞(th1)应答的信号，其特征在于在效应子位点激活抗微生物作用的产生ifnγ的t辅助细胞。佐剂如皂角苷驱动th1应答并被认为通过诱导dc中的il-12起作用。然而，铝盐不直接通过tlr诱导信号传导并且不刺激dc生产il-12。相反，已发现铝-基佐剂驱动th2应答。

佐剂通过各种机制起作用，进行交叉-呈递的能力最终取决于佐剂的机制。佐剂借此获得作用的一些机制包括抗原局部地保留在注射部位以产生一种缓慢-释放贮库效应，因此能使抗原持续释放至抗原呈递细胞。佐剂也可作为化学引诱剂以吸引免疫系统的细胞至抗原贮库，随后刺激这样的细胞以引起免疫应答。迄今为止最常用的佐剂是alum(氢氧化铝和磷酸铝)。大多数佐剂(包括alum)仅仅在提高抗体对抗原的应答中是有效的。佐剂如mpl能激活抗体应答，并且当用t-细胞表位肽配制时，也证实会引起ctl应答。

如上所述，虽然一些佐剂如阳离子脂质和mpl当与肽配制时能引起t-细胞应答，使用肽片段而不是全抗原是一个严重的限制，因为不同的肽片段会被不同个体的t细胞识别。结果，非常大的数量的不同片段将必须被鉴定并包括在这样的疫苗中。此外，已知肽引起保护性抗体应答的能力是弱的并且在几种肽中是不存在的。

一种有前景的方法是诱导ctl至内部蛋白质(如np)，其在不同的病毒中为高度保守的。血凝素(ha)t细胞表位也显示比抗体表位较少的变化。然而，现有的灭活疫苗像流感病毒疫苗(fluzone)主要由ha蛋白组成并且还不产生显著的cd8t细胞应答。

据报道由ctl和th1细胞二者杀死感染的细胞在消除因细胞内病原体所致的感染方面是有效的。然而，在某些情况下(如由乙型肝炎病毒所致的肝部感染)，产生ifnγ的cd8+t细胞提供更有效的保护作用，因为所述病毒可被清除并伴有最少量的宿主细胞死亡。类似地，产生ifnγ的cd8+t细胞在用rts,s疟疾疫苗接种的个体中显示与保护作用有关。这种疫苗含有融合于乙型肝炎病毒表面蛋白的寄生虫的蛋白。据报道，需要针对在寄生虫的生命周期的不同阶段表达的多抗原的体液和细胞-介导的免疫二者以防止疟疾感染。用于最成功的疟疾疫苗中的佐剂系统是as02，一种在颗粒系统中配制的含有皂角苷佐剂组分和tlr激动剂mpl二者的组合佐剂制剂。特别地，需要皂角苷和mpl佐剂二者一起以诱导交叉呈递并因此在免疫的个体中提供适度水平的保护作用。然而，相反地，使用具有氢氧化铝和mpl(as04)或在水包油乳液(as03)中的相同抗原的疫苗诱导高水平的抗体，但未能防止感染。

虽然活的减毒病毒和细菌疫苗可激活免疫系统的所有武器，但到目前为止佐剂还未达到这个目标。通过结合佐剂，如铝盐与mpl，或通过使用用dna然后病毒或细菌载体的初始-加强(prime-boost)策略，体液和细胞-介导的两种应答可有效地激活。然而，这样的多佐剂系统是复杂的并具有配制和安全性的潜在难题。

因此，存在对新的疫苗组合物的需求，所述疫苗组合物有效地诱导对病原体(例如流感病毒)的不同亚型的广泛的交叉-保护免疫。此外，治疗和预防疾病，如由细菌、病毒和真菌引起的那些疾病的新的和有效的方法也是非常需要的。因此，本公开提供疫苗组合物和使用组合物的方法，所述组合物呈现所需特性并提供交叉-呈递一种或多种抗原的相关优点，并且其中体液和/或细胞免疫应答实现。

本公开提供包含至少一种佐剂和至少一种抗原的疫苗组合物，其中佐剂是阳离子脂质。本公开还提供治疗哺乳动物的疾病的方法，预防哺乳动物的疾病的方法，和进行抗原交叉呈递以在哺乳动物中利用疫苗组合物诱导体液免疫应答和细胞免疫应答的方法。各种抗原的交叉呈递可通过用具有佐剂特性的阳离子脂质，配制特异性抗原来完成。

根据本公开的疫苗组合物和方法提供与现有领域的其它组合物和方法比较的几个优点。首先，疫苗组合物可诱导对不同亚型的流感的广泛交叉-保护免疫，以及开发可针对多个流感株提供保护作用的通用流感疫苗。

其次，疫苗组合物显示体液和细胞-介导的两种应答的很大增加并可提供开发新一代简单疫苗的简单佐剂平台，该疫苗不需要佐剂组合或病毒载体。这种在开发抗-病毒和抗-细菌疫苗中引起“交叉-呈递”的途径可提供一种新的和成本有效的方法，以开发提供改进的保护作用和治愈各种疾病的疫苗。

第三，流感疫苗组合物可提供一种开发通用流感疫苗的新方法，其由于提高的对ha蛋白的细胞cd8+t-细胞应答和在其中cd8t-细胞表位已知是保守的株中产生的“交叉-反应性”，而无需使用多个t-细胞表位肽。

构思了以下编号的实施方案，且这些实施方案是非限制性的：

1.一种包含至少一种佐剂和至少一种抗原的疫苗组合物，其中佐剂是阳离子脂质。

2.条款1的疫苗组合物，其中所述阳离子脂质是非甾体阳离子脂质。

3.条款1或条款2的疫苗组合物，其中所述阳离子脂质选自dotap、dotma、doepc及其组合。

4.条款1-3的任一项的疫苗组合物，其中所述阳离子脂质是dotap。

5.条款1-3的任一项的疫苗组合物，其中所述阳离子脂质是dotma。

6.条款1-3的任一项的疫苗组合物，其中所述阳离子脂质是doepc。

7.条款1-6的任一项的疫苗组合物，其中所述佐剂是阳离子脂质的对映体。

8.条款7的疫苗组合物，其中所述对映体是纯的。

9.条款7或条款8的疫苗组合物，其中所述对映体是r-dotap或s-dotap。

10.条款7或条款8的疫苗组合物，其中所述对映体是r-dotap。

11.条款7或条款8的疫苗组合物，其中所述对映体是s-dotap。

12.条款7或条款8的疫苗组合物，其中所述对映体是r-dotma或s-dotma。

13.条款7或条款8的疫苗组合物，其中所述对映体是r-dotma。

14.条款7或条款8的疫苗组合物，其中所述对映体是s-dotma。

15.条款7或条款8的疫苗组合物，其中所述对映体是r-doepc或s-doepc。

16.条款7或条款8的疫苗组合物，其中所述对映体是r-doepc。

17.条款7或条款8的疫苗组合物，其中所述对映体是s-doepc。

18.条款1-17的任一项的疫苗组合物，其中一种或多种抗原是蛋白-基抗原。

19.条款1-17的任一项的疫苗组合物，其中一种或多种抗原是肽-基抗原。

20.条款1-19的任一项的疫苗组合物，其中一种或多种抗原选自病毒抗原、真菌抗原、细菌抗原和致病性抗原。

21.条款1-19的任一项的疫苗组合物，其中一种或多种抗原是病毒抗原。

22.条款1-19的任一项的疫苗组合物，其中一种或多种抗原是真菌抗原。

23.条款1-19的任一项的疫苗组合物，其中一种或多种抗原是细菌抗原。

24.条款1-19的任一项的疫苗组合物，其中一种或多种抗原是致病性抗原。

25.条款1-24的任一项的疫苗组合物，其中至少一种抗原是来自病原体保守区的抗原。

26.条款24的疫苗组合物，其中所述致病性抗原是合成的或重组抗原。

27．条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中至少一种抗原选自rahynivtf(seq.id.no:1)、gqaepdrahynivtf(seq.id.no:2)、kssgqaepdrahynivtf(seq.id.no:3)、ymldlqpett(seq.id.no:4)、kssymldlqpett(seq.id.no:5)、kssmhgdtptlheymldlqpett(seq.id.no:6)、kssllmgtlgivcpicsqkp(seq.id.no:7)、kvprnqdwl(seq.id.no:8)、syvdffvwl(seq.id.no:9)、kyicnsscm(seq.id.no:10)和ksskvprnqdwl(seq.id.no:11)。

28.条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中至少一种抗原选自gp100(kvprnqdwl[seq.id.no.8])、trp2(syvdffvwl[seq.id.no.9])和p53(kyicnsscm[seq.id.no.10])，及其组合。

29.条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中所述抗原是gp100(kvprnqdwl[seq.id.no.8])和trp2(syvdffvwl[seq.id.no.9])。

30.条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中所述抗原是rahynivtf(seq.id.no:1)。

31.条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中所述抗原是gqaepdrahynivtf(seq.id.no:2)。

32.条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中所述抗原是kssgqaepdrahynivtf(seq.id.no:3)。

33.条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中所述抗原是ymldlqpett(seq.id.no:4)。

34.条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中所述抗原是kssymldlqpett(seq.id.no:5)。

35.条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中所述抗原是kssmhgdtptlheymldlqpett(seq.id.no:6)。

36.条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中所述抗原是kssllmgtlgivcpicsqkp(seq.id.no:7)。

37.条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中所述抗原是kvprnqdwl(seq.id.no:8)。

38.条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中所述抗原是syvdffvwl(seq.id.no:9)。

39.条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中所述抗原是kyicnsscm(seq.id.no:10)。

40.条款1-20的任一项的疫苗组合物，其中所述抗原是ksskvprnqdwl(seq.id.no:11)。

41.条款1-40的任一项的疫苗组合物，其中至少一种抗原选自脂蛋白、脂肽和用具有增加的疏水性或降低的疏水性的氨基酸序列修饰的蛋白或肽。

42.条款1-41的任一项的疫苗组合物，其中一种或多种抗原是脂化抗原或经修饰以增加抗原的疏水性的抗原。

43.条款1-42的任一项的疫苗组合物，其中至少一种抗原是经修饰的蛋白或肽。

44.条款1-43的任一项的疫苗组合物，其中经修饰的蛋白或肽结合于疏水基团。

45.条款1-44的任一项的疫苗组合物，其中结合于疏水基团的经修饰的蛋白或肽还包含抗原和疏水基团之间的连接序列。

46.条款45的疫苗组合物，其中所述疏水基团是棕榈酰基。

47.条款1-46的任一项的疫苗组合物，其中至少一种抗原是未修饰的蛋白或肽。

48.条款1-47的任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物是通用疫苗。

49.条款1-48的任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物是抗-病毒疫苗。

50.条款1-48的任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物是抗-真菌疫苗。

51.条款1-48的任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物是抗-细菌疫苗。

52.条款1-48的任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物是流感疫苗。

53.条款52的疫苗组合物，其中所述流感疫苗是通用流感疫苗。

54.条款52或条款53的疫苗组合物，其中所述流感疫苗包含流感病毒表面上发现的糖蛋白抗原。

55.条款54的疫苗组合物，其中所述抗原是血凝素抗原。

56.条款55的疫苗组合物，其中所述血凝素抗原包含表位区ha518-526。

57.条款55的疫苗组合物，其中所述流感疫苗是神经氨酸酶亚单位疫苗。

58.条款52-57的任一项的疫苗组合物，其中所述流感疫苗是h3n2疫苗。

59.条款52-57的任一项的疫苗组合物，其中所述流感疫苗是n1n1疫苗。

60.条款52-57的任一项的疫苗组合物，其中所述流感疫苗是布里斯班疫苗。

61.条款52-57的任一项的疫苗组合物，其中所述流感疫苗是h1n1疫苗。

62.条款52-61的任一项的疫苗组合物，其中所述流感疫苗包含来自一种或多种流感病毒的一种或多种蛋白抗原。

63.条款52-62的任一项的疫苗组合物，其中所述流感疫苗包含灭活病毒(如灭活的全病毒)。

64.条款52-61的任一项的疫苗组合物，其中所述流感疫苗包含减毒的病毒。

65.条款52-61的任一项的疫苗组合物，其中所述流感疫苗包含破裂的病毒。

66.条款52-61的任一项的疫苗组合物，其中所述流感疫苗包含重组病毒。

67.条款1-67的任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够诱导体液免疫应答。

68.条款67的疫苗组合物，其中所述体液免疫应答是抗体应答。

69.条款1-68的任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够诱导针对病原体的保守区的体液免疫应答。

70.条款1-69的任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够诱导细胞免疫应答。

71.条款70的疫苗组合物，其中所述细胞免疫应答是t细胞应答。

72.条款71的疫苗组合物，其中所述t细胞应答是cd8+t细胞应答。

73.条款1-72的任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够诱导针对病原体的保守区的细胞免疫应答。

74.条款1-73的任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够在患者中诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。

75.条款1-74的任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物能够交叉-呈递一种或多种抗原。

76.条款1-75的任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物产生体液免疫应答和细胞免疫应答。

77.条款1-76的任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物通过激活有丝分裂原-激活的蛋白(map)激酶信号传导途径，诱导哺乳动物的免疫应答。

78.条款77的疫苗组合物，其中map激酶信号传导途径通过刺激细胞外信号-调节的激酶("erk")-1、erk-2和p38的至少一种来激活。

79.条款1-78的任一项的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物提高哺乳动物的功能性抗原-特异性cd8+t淋巴细胞应答。

80.条款79的疫苗组合物，其中所述哺乳动物是人。

81.一种治疗哺乳动物的疾病的方法，所述方法包括给予哺乳动物有效量的疫苗组合物的步骤，其中疫苗组合物包含至少一种佐剂和至少一种抗原，和其中所述佐剂是阳离子脂质。

82.条款81的方法，其中所述疾病是致病性疾病。

83.条款81或条款82的方法，其中所述疾病由多个病原株引起。

84.条款81-83的任一项的方法，其中所述疾病是流感。

85.条款81-84的任一项的方法，其中所述方法诱导哺乳动物的体液免疫应答。

86.条款85的方法，其中所述体液免疫应答是抗体应答。

87.条款85或条款86的方法，其中所述体液免疫应答是针对病原体的保守区。

88.条款81-87的任一项的方法，其中所述方法诱导哺乳动物的细胞免疫应答。

89.条款88的方法，其中所述细胞免疫应答是t细胞应答。

90.条款89的方法，其中所述t细胞应答是cd8+t细胞应答。

91.条款88-90的任一项的方法，其中所述细胞免疫应答是针对病原体的保守区。

92.条款88-91的任一项的方法，其中所述方法诱导哺乳动物的体液免疫应答和细胞免疫应答。

93.条款88-92的任一项的方法，其中所述阳离子脂质是非甾体阳离子脂质。

94.条款88-93的任一项的方法，其中所述阳离子脂质选自dotap、dotma、doepc及其组合。

95.条款88-94的任一项的方法，其中所述阳离子脂质是dotap。

96.条款88-94的任一项的方法，其中所述阳离子脂质是dotma。

97.条款88-94的任一项的方法，其中所述阳离子脂质是doepc。

98.条款88-97的任一项的方法，其中所述佐剂是阳离子脂质的对映体。

99.条款98的方法，其中所述对映体是纯的。

100.条款98或条款99的方法，其中所述对映体是r-dotap或s-dotap。

101.条款98或条款99的方法，其中所述对映体是r-dotap。

102.条款98或条款99的方法，其中所述对映体是s-dotap。

103.条款98或条款99的方法，其中所述对映体是r-dotma或s-dotma。

104.条款98或条款99的方法，其中所述对映体是r-dotma。

105.条款98或条款99的方法，其中所述对映体是s-dotma。

106.条款98或条款99的方法，其中所述对映体是r-doepc或s-doepc。

107.条款98或条款99的方法，其中所述对映体是r-doepc。

108.条款98或条款99的方法，其中所述对映体是s-doepc。

109.条款81-109的任一项的方法，其中一种或多种抗原是蛋白-基抗原。

110.条款81-109的任一项的方法，其中一种或多种抗原是肽-基抗原。

111.条款81-110的任一项的方法，其中一种或多种抗原选自病毒抗原、真菌抗原、细菌抗原和致病性抗原。

112.条款81-110的任一项的方法，其中一种或多种抗原是病毒抗原。

113.条款81-110的任一项的方法，其中一种或多种抗原是真菌抗原。

114.条款81-110的任一项的方法，其中一种或多种抗原是细菌抗原。

115.条款81-110的任一项的方法，其中一种或多种抗原是致病性抗原。

116.条款81-115的任一项的方法，其中至少一种抗原是来自病原体保守区的抗原。

117.条款115或条款116的方法，其中所述致病性抗原是合成的或重组抗原。

118.条款81-117的任一项的方法，其中至少一种抗原选自rahynivtf(seq.id.no:1)、gqaepdrahynivtf(seq.id.no:2)、kssgqaepdrahynivtf(seq.id.no:3)、ymldlqpett(seq.id.no:4)、kssymldlqpett(seq.id.no:5)、kssmhgdtptlheymldlqpett(seq.id.no:6)、kssllmgtlgivcpicsqkp(seq.id.no:7)、kvprnqdwl(seq.id.no:8)、syvdffvwl(seq.id.no:9)、kyicnsscm(seq.id.no:10)和ksskvprnqdwl(seq.id.no:11)。

119.条款81-117的任一项的方法，其中至少一种抗原选自gp100(kvprnqdwl[seq.id.no.8])、trp2(syvdffvwl[seq.id.no.9])和p53(kyicnsscm[seq.id.no.10])，及其组合。

120.条款81-117的任一项的方法，其中所述抗原是gp100(kvprnqdwl[seq.id.no.8])和trp2(syvdffvwl[seq.id.no.9])。

121.条款81-117的任一项的方法，其中所述抗原是rahynivtf(seq.id.no:1)。

122.条款81-117的任一项的方法，其中所述抗原是gqaepdrahynivtf(seq.id.no:2)。

123.条款81-117的任一项的方法，其中所述抗原是kssgqaepdrahynivtf(seq.id.no:3)。

124.条款81-117的任一项的方法，其中所述抗原是ymldlqpett(seq.id.no:4)。

125.条款81-117的任一项的方法，其中所述抗原是kssymldlqpett(seq.id.no:5)。

126.条款81-117的任一项的方法，其中所述抗原是kssmhgdtptlheymldlqpett(seq.id.no:6)。

127.条款81-117的任一项的方法，其中所述抗原是kssllmgtlgivcpicsqkp(seq.id.no:7)。

128.条款81-117的任一项的方法，其中所述抗原是kvprnqdwl(seq.id.no:8)。

129.条款81-117的任一项的方法，其中所述抗原是syvdffvwl(seq.id.no:9)。

130.条款81-117的任一项的方法，其中所述抗原是kyicnsscm(seq.id.no:10)。

131.条款81-117的任一项的方法，其中所述抗原是ksskvprnqdwl(seq.id.no:11)。

132.条款81-131的任一项的方法，其中至少一种抗原选自脂蛋白、脂肽和用具有增加的疏水性或降低的疏水性的氨基酸序列修饰的蛋白或肽。

133．条款81-132的任一项的方法，其中一种或多种抗原是脂化抗原或经修饰以增加抗原的疏水性的抗原。

134.条款81-133的任一项的方法，其中至少一种抗原是经修饰的蛋白或肽。

135.条款134的方法，其中所述经修饰的蛋白或肽结合于疏水基团。

136.条款134或条款135的方法，其中结合于疏水基团的经修饰的蛋白或肽还包含抗原和疏水基团之间的连接序列。

137.条款136的方法，其中所述疏水基团是棕榈酰基。

138.条款81-137的任一项的方法，其中至少一种抗原是未修饰的蛋白或肽。

139.条款81-138的任一项的方法，其中所述疫苗组合物是通用疫苗。

140.条款81-138的任一项的方法，其中所述疫苗组合物是抗-病毒疫苗。

141.条款81-138的任一项的方法，其中所述疫苗组合物是抗-真菌疫苗。

142.条款81-138的任一项的方法，其中所述疫苗组合物是抗-细菌疫苗。

143.条款81-138的任一项的方法，其中所述疫苗组合物是流感疫苗。

144.条款81-138的任一项的方法，其中所述流感疫苗是通用流感疫苗。

145.条款143或条款144的方法，其中所述流感疫苗包含流感病毒表面上发现的糖蛋白抗原。

146.条款145的方法，其中所述抗原是血凝素抗原。

147.条款146的方法，其中所述血凝素抗原包含表位区ha518-526。

148.条款143或条款144的方法，其中所述流感疫苗是神经氨酸酶亚单位疫苗。

149.条款143-148的任一项的方法，其中所述流感疫苗是h3n2疫苗。

150.条款143-148的任一项的方法，其中所述流感疫苗是n1n1疫苗。

151.条款143-148的任一项的方法，其中所述流感疫苗是布里斯班疫苗。

152.条款143-148的任一项的方法，其中所述流感疫苗是h1n1疫苗。

153.条款143-152的任一项的方法，其中所述流感疫苗包含来自一种或多种流感病毒的一种或多种蛋白抗原。

154.条款143-153的任一项的方法，其中所述流感疫苗包含灭活病毒(如灭活全病毒)。

155.条款143-152的任一项的方法，其中所述流感疫苗包含减毒的病毒。

156.条款143-152的任一项的方法，其中所述流感疫苗包含破裂的病毒。

157.条款143-152的任一项的方法，其中所述流感疫苗包含重组病毒。

158.条款81-157的任一项的方法，其中所述疫苗组合物通过激活有丝分裂原-激活的蛋白(map)激酶信号传导途径，诱导哺乳动物的免疫应答。

159.条款158的方法，其中所述map激酶信号传导途径通过刺激细胞外信号-调节的激酶("erk")-1、erk-2和p38的至少一种而激活。

160.条款143-159的任一项的方法，其中所述疫苗组合物提高哺乳动物的功能性抗原-特异性cd8+t淋巴细胞应答。

161.条款81-138的任一项的方法，其中所述哺乳动物是人。

162.一种预防哺乳动物的疾病的方法，所述方法包括给予哺乳动物有效量的疫苗组合物的步骤，其中疫苗组合物包含至少一种佐剂和至少一种抗原，和其中所述佐剂是阳离子脂质。

163.条款162的方法，其中所述疾病是致病性疾病。

164.条款162或条款163的方法，其中所述疾病由多个病原株引起。

165.条款162-164的任一项的方法，其中所述疾病是流感。

166.条款162-165的任一项的方法，其中所述方法诱导哺乳动物的体液免疫应答。

167.条款166的方法，其中所述体液免疫应答是抗体应答。

168.条款166或条款167的方法，其中所述体液免疫应答是针对病原体的保守区。

169.条款162-168的任一项的方法，其中所述方法诱导哺乳动物的细胞免疫应答。

170.条款169的方法，其中所述细胞免疫应答是t细胞应答。

171.条款170的方法，其中t细胞应答是cd8+t细胞应答。

172.条款169-171的任一项的方法，其中所述细胞免疫应答是针对病原体的保守区。

173.条款162-172的任一项的方法，其中所述方法诱导哺乳动物的体液免疫应答和细胞免疫应答。

174.条款162-173的任一项的方法，其中所述阳离子脂质是非甾体阳离子脂质。

175.条款162-174的任一项的方法，其中所述阳离子脂质选自dotap、dotma、doepc及其组合。

176.条款162-175的任一项的方法，其中所述阳离子脂质是dotap。

177.条款162-175的任一项的方法，其中所述阳离子脂质是dotma。

178.条款162-175的任一项的方法，其中所述阳离子脂质是doepc。

179.条款162-178的任一项的方法，其中所述佐剂是阳离子脂质的对映体。

180.条款179的方法，其中所述对映体是纯的。

181.条款179或条款180的方法，其中所述对映体是r-dotap或s-dotap。

182.条款179或条款180的方法，其中所述对映体是r-dotap。

183.条款179或条款180的方法，其中所述对映体是s-dotap。

184.条款179或条款180的方法，其中所述对映体是r-dotma或s-dotma。

185.条款179或条款180的方法，其中所述对映体是r-dotma。

186.条款179或条款180的方法，其中所述对映体是s-dotma。

187.条款179或条款180的方法，其中所述对映体是r-doepc或s-doepc。

188.条款179或条款180的方法，其中所述对映体是r-doepc。

189.条款179或条款180的方法，其中所述对映体是s-doepc。

190.条款162-189的任一项的方法，其中一种或多种抗原是蛋白-基抗原。

191.条款162-190的任一项的方法，其中一种或多种抗原是肽-基抗原。

192.条款162-191的任一项的方法，其中一种或多种抗原选自病毒抗原、真菌抗原、细菌抗原和致病性抗原。

193.条款162-191的任一项的方法，其中一种或多种抗原是病毒抗原。

194.条款162-191的任一项的方法，其中一种或多种抗原是真菌抗原。

195.条款162-191的任一项的方法，其中一种或多种抗原是细菌抗原。

196.条款162-191的任一项的方法，其中一种或多种抗原是致病性抗原。

197.条款162-196的任一项的方法，其中至少一种抗原是来自病原体保守区的抗原。

198.条款162-197的任一项的方法，其中所述致病性抗原是合成的或重组抗原。

199.条款162-198的任一项的方法，其中至少一种抗原选自rahynivtf(seq.id.no:1)、gqaepdrahynivtf(seq.id.no:2)、kssgqaepdrahynivtf(seq.id.no:3)、ymldlqpett(seq.id.no:4)、kssymldlqpett(seq.id.no:5)、kssmhgdtptlheymldlqpett(seq.id.no:6)、kssllmgtlgivcpicsqkp(seq.id.no:7)、kvprnqdwl(seq.id.no:8)、syvdffvwl(seq.id.no:9)、kyicnsscm(seq.id.no:10)和ksskvprnqdwl(seq.id.no:11)。

200.条款162-198的任一项的方法，其中至少一种抗原选自gp100(kvprnqdwl[seq.id.no.8])、trp2(syvdffvwl[seq.id.no.9])和p53(kyicnsscm[seq.id.no.10])，及其组合。

201.条款162-198的任一项的方法，其中所述抗原是gp100(kvprnqdwl[seq.id.no.8])和trp2(syvdffvwl[seq.id.no.9])。

202.条款162-198的任一项的方法，其中所述抗原是rahynivtf(seq.id.no:1)。

203.条款162-198的任一项的方法，其中所述抗原是gqaepdrahynivtf(seq.id.no:2)。

204.条款162-198的任一项的方法，其中所述抗原是kssgqaepdrahynivtf(seq.id.no:3)。

205.条款162-198的任一项的方法，其中所述抗原是ymldlqpett(seq.id.no:4)。

206.条款162-198的任一项的方法，其中所述抗原是kssymldlqpett(seq.id.no:5)。

207.条款162-198的任一项的方法，其中所述抗原是kssmhgdtptlheymldlqpett(seq.id.no:6)。

208.条款162-198的任一项的方法，其中所述抗原是kssllmgtlgivcpicsqkp(seq.id.no:7)。

209.条款162-198的任一项的方法，其中所述抗原是kvprnqdwl(seq.id.no:8)。

210.条款162-198的任一项的方法，其中所述抗原是syvdffvwl(seq.id.no:9)。

211.条款162-198的任一项的方法，其中所述抗原是kyicnsscm(seq.id.no:10)。

212.条款162-198的任一项的方法，其中所述抗原是ksskvprnqdwl(seq.id.no:11)。

213.条款162-212的任一项的方法，其中至少一种抗原选自脂蛋白、脂肽和用具有增加的疏水性或降低的疏水性的氨基酸序列修饰的蛋白或肽。

214.条款162-213的任一项的方法，其中一种或多种抗原是脂化抗原或经修饰以增加抗原的疏水性的抗原。

215.条款162-213的任一项的方法，其中至少一种抗原是经修饰的蛋白或肽。

216.条款215的方法，其中所述经修饰的蛋白或肽结合于疏水基团。

217.条款215或条款216的方法，其中结合于疏水基团的经修饰的蛋白或肽还包含抗原和疏水基团之间的连接序列。

218.条款217的方法，其中所述疏水基团是棕榈酰基。

219.条款162-218的任一项的方法，其中至少一种抗原是未修饰的蛋白或肽。

220.条款162-219的任一项的方法，其中所述疫苗组合物是通用疫苗。

221.条款162-220的任一项的方法，其中所述疫苗组合物是抗-病毒疫苗。

222.条款162-219的任一项的方法，其中所述疫苗组合物是抗-真菌疫苗。

223.条款162-219的任一项的方法，其中所述疫苗组合物是抗-细菌疫苗。

224.条款162-219的任一项的方法，其中所述疫苗组合物是流感疫苗。

225.条款224的方法，其中所述流感疫苗是通用流感疫苗。

226.条款224或条款225的方法，其中所述流感疫苗包含流感病毒表面上发现的糖蛋白抗原。

227.条款226的方法，其中所述抗原是血凝素抗原。

228.条款227的方法，其中所述血凝素抗原包含表位区ha518-526。

229.条款224-228的任一项的方法，其中所述流感疫苗是神经氨酸酶亚单位疫苗。

230.条款224-229的任一项的方法，其中所述流感疫苗是h3n2疫苗。

231.条款224-229的任一项的方法，其中所述流感疫苗是n1n1疫苗。

232.条款224-229的任一项的方法，其中所述流感疫苗是布里斯班疫苗。

233.条款224-229的任一项的方法，其中所述流感疫苗是h1n1疫苗。

234.条款224-233的任一项的方法，其中所述流感疫苗包含来自一种或多种流感病毒的一种或多种蛋白抗原。

235.条款224-234的任一项的方法，其中所述流感疫苗包含灭活病毒(如灭活全病毒)。

236.条款224-233的任一项的方法，其中所述流感疫苗包含减毒的病毒。

237.条款224-233的任一项的方法，其中所述流感疫苗包含破裂的病毒。

238.条款224-233的任一项的方法，其中所述流感疫苗包含重组病毒。

239.条款162-238的任一项的方法，其中所述疫苗组合物通过激活有丝分裂原-激活的蛋白(map)激酶信号传导途径，诱导哺乳动物的免疫应答。

240.条款240的方法，其中所述map激酶信号传导途径通过刺激细胞外信号-调节的激酶("erk")-1、erk-2和p38的至少一种而激活。

241.条款162-240的任一项的方法，其中所述疫苗组合物提高哺乳动物的功能性抗原-特异性cd8+t淋巴细胞应答。

242.条款162-241的任一项的方法，其中所述哺乳动物是人。

243.一种在哺乳动物中进行抗原交叉呈递以诱导体液免疫应答和细胞免疫应答的方法，所述方法包括给予哺乳动物有效量的疫苗组合物的步骤，其中疫苗组合物包含至少一种佐剂和至少一种抗原，和其中所述佐剂是阳离子脂质。

244.条款243的方法，其中所述体液免疫应答是抗体应答。

245.条款243或条款244的方法，其中所述体液免疫应答是针对病原体的保守区。

246．条款243-245的任一项的方法，其中所述细胞免疫应答是t细胞应答。

247.条款246的方法，其中所述t细胞应答是cd8+t细胞应答。

248.条款243-247的任一项的方法，其中所述细胞免疫应答是针对病原体的保守区。

249.条款243-248的任一项的方法，其中所述阳离子脂质是非甾体阳离子脂质。

250.条款243-249的任一项的方法，其中所述阳离子脂质选自dotap、dotma、doepc及其组合。

251.条款243-250的任一项的方法，其中所述阳离子脂质是dotap。

252.条款243-250的任一项的方法，其中所述阳离子脂质是dotma。

253.条款243-250的任一项的方法，其中所述阳离子脂质是doepc。

254.条款243-249的任一项的方法，其中所述佐剂是阳离子脂质的对映体。

255.条款254的方法，其中所述对映体是纯的。

256.条款254或条款255的方法，其中所述对映体是r-dotap或s-dotap。

257.条款254或条款255的方法，其中所述对映体是r-dotap。

258.条款254或条款255的方法，其中所述对映体是s-dotap。

259.条款254或条款255的方法，其中所述对映体是r-dotma或s-dotma。

260.条款254或条款255的方法，其中所述对映体是r-dotma。

261.条款254或条款255的方法，其中所述对映体是s-dotma。

262.条款254或条款255的方法，其中所述对映体是r-doepc或s-doepc。

263.条款254或条款255的方法，其中所述对映体是r-doepc。

264.条款254或条款255的方法，其中所述对映体是s-doepc。

265.条款243-264的任一项的方法，其中一种或多种抗原是蛋白-基抗原。

266.条款243-264的任一项的方法，其中一种或多种抗原是肽-基抗原。

267.条款243-266的任一项的方法，其中一种或多种抗原选自病毒抗原、真菌抗原、细菌抗原和致病性抗原。

268.条款243-266的任一项的方法，其中一种或多种抗原是病毒抗原。

269.条款243-266的任一项的方法，其中一种或多种抗原是真菌抗原。

270.条款243-266的任一项的方法，其中一种或多种抗原是细菌抗原。

271.条款243-266的任一项的方法，其中一种或多种抗原是致病性抗原。

272.条款243-271的任一项的方法，其中至少一种抗原是来自病原体保守区的抗原。

273.条款271或条款272的方法，其中所述致病性抗原是合成的或重组抗原。

274.条款243-273的任一项的方法，其中至少一种抗原选自rahynivtf(seq.id.no:1)、gqaepdrahynivtf(seq.id.no:2)、kssgqaepdrahynivtf(seq.id.no:3)、ymldlqpett(seq.id.no:4)、kssymldlqpett(seq.id.no:5)、kssmhgdtptlheymldlqpett(seq.id.no:6)、kssllmgtlgivcpicsqkp(seq.id.no:7)、kvprnqdwl(seq.id.no:8)、syvdffvwl(seq.id.no:9)、kyicnsscm(seq.id.no:10)和ksskvprnqdwl(seq.id.no:11)。

275.条款243-273的任一项的方法，其中至少一种抗原选自gp100(kvprnqdwl[seq.id.no.8])、trp2(syvdffvwl[seq.id.no.9])和p53(kyicnsscm[seq.id.no.10])，及其组合。

276.条款243-273的任一项的方法，其中所述抗原是gp100(kvprnqdwl[seq.id.no.8])和trp2(syvdffvwl[seq.id.no.9])。

277.条款243-273的任一项的方法，其中所述抗原是rahynivtf(seq.id.no:1)。

278.条款243-273的任一项的方法，其中所述抗原是gqaepdrahynivtf(seq.id.no:2)。

279.条款243-273的任一项的方法，其中所述抗原是kssgqaepdrahynivtf(seq.id.no:3)。

280.条款243-273的任一项的方法，其中所述抗原是ymldlqpett(seq.id.no:4)。

281.条款243-273的任一项的方法，其中所述抗原是kssymldlqpett(seq.id.no:5)。

282.条款243-273的任一项的方法，其中所述抗原是kssmhgdtptlheymldlqpett(seq.id.no:6)。

283.条款243-273的任一项的方法，其中所述抗原是kssllmgtlgivcpicsqkp(seq.id.no:7)。

284.条款243-273的任一项的方法，其中所述抗原是kvprnqdwl(seq.id.no:8)。

285.条款243-273的任一项的方法，其中所述抗原是syvdffvwl(seq.id.no:9)。

286.条款243-273的任一项的方法，其中所述抗原是kyicnsscm(seq.id.no:10)。

287.条款243-273的任一项的方法，其中所述抗原是ksskvprnqdwl(seq.id.no:11)。

288.条款243-287的任一项的方法，其中至少一种抗原选自脂蛋白、脂肽和用具有增加的疏水性或降低的疏水性的氨基酸序列修饰的蛋白或肽。

289.条款243-288的任一项的方法，其中一种或多种抗原是脂化抗原或经修饰以增加抗原的疏水性的抗原。

290.条款243-289的任一项的方法，其中至少一种抗原是经修饰的蛋白或肽。

291.条款290的方法，其中所述经修饰的蛋白或肽结合于疏水基团。

292.条款290或条款291的方法，其中结合于疏水基团的经修饰的蛋白或肽还包含抗原和疏水基团之间的连接序列。

293.条款292的方法，其中所述疏水基团是棕榈酰基。

294.条款243-293的任一项的方法，其中至少一种抗原是未修饰的蛋白或肽。

295.条款243-294的任一项的方法，其中所述疫苗组合物是通用疫苗。

296.条款243-295的任一项的方法，其中所述疫苗组合物是抗-病毒疫苗。

297.条款243-295的任一项的方法，其中所述疫苗组合物是抗-真菌疫苗。

298.条款243-295的任一项的方法，其中所述疫苗组合物是抗-细菌疫苗。

299.条款243-295的任一项的方法，其中所述疫苗组合物是流感疫苗。

300.条款299的方法，其中所述流感疫苗是通用流感疫苗。

301.条款299或条款300的方法，其中所述流感疫苗包含流感病毒表面上发现的糖蛋白抗原。

302.条款301的方法，其中所述抗原是血凝素抗原。

303.条款302的方法，其中所述血凝素抗原包含表位区ha518-526。

304.条款299-303的任一项的方法，其中所述流感疫苗是神经氨酸酶亚单位疫苗。

305.条款299-304的任一项的方法，其中所述流感疫苗是h3n2疫苗。

306.条款299-304的任一项的方法，其中所述流感疫苗是n1n1疫苗。

307.条款299-304的任一项的方法，其中所述流感疫苗是布里斯班疫苗。

308.条款299-304的任一项的方法，其中所述流感疫苗是h1n1疫苗。

309.条款299-308的任一项的方法，其中所述流感疫苗包含来自一种或多种流感病毒的一种或多种蛋白抗原。

310.条款299-309的任一项的方法，其中所述流感疫苗包含灭活病毒(如灭活全病毒)。

311.条款299-308的任一项的方法，其中所述流感疫苗包含减毒的病毒。

312.条款299-308的任一项的方法，其中所述流感疫苗包含破裂的病毒。

313.条款299-308的任一项的方法，其中所述流感疫苗包含重组病毒。

314.条款243-313的任一项的方法，其中所述疫苗组合物通过激活有丝分裂原-激活的蛋白(map)激酶信号传导途径，诱导哺乳动物的免疫应答。

315.条款314的方法，其中所述map激酶信号传导途径通过刺激细胞外信号-调节的激酶("erk")-1、erk-2和p38的至少一种而激活。

316.条款243-315的任一项的方法，其中所述疫苗组合物提高哺乳动物的功能性抗原-特异性cd8+t淋巴细胞应答。

317.条款243-316的任一项的方法，其中所述哺乳动物是人。

附图简述

图1显示用商业流感疫苗和阳离子脂质-基流感疫苗对抗h3n2的血细胞凝聚抑制试验的结果。

图2显示用商业流感疫苗和阳离子脂质-基流感疫苗对抗h1n1的血细胞凝聚抑制试验的结果。

图3显示用商业流感疫苗和阳离子脂质-基流感疫苗对抗b布里斯班(brisbane)的血细胞凝聚抑制试验的结果。

图4显示r-dotap提高t细胞对血凝素内部i类限制的表位的应答。单用h5n1疫苗(灭活a/越南2004)，或用cfa(乳液)或者阳离子脂质辅助的h5n1疫苗对balb/c小鼠接种。

图5显示dotma和doepc提高t细胞对人乳头状瘤病毒株16的i类限制的表位的应答。用由阳离子脂质佐剂或montanide™和肽hpv-16e743-57组成的各种制剂接种c57bl/6小鼠。与montanide™比较，使用阳离子脂质具有优越的t-细胞增强结果。

本发明的各个实施方案在此描述如下。在本文描述的一个实施方案中，提供了疫苗组合物。疫苗组合物包含至少一种佐剂和至少一种抗原，其中佐剂是阳离子脂质。

在另一个实施方案中，提供了治疗哺乳动物的疾病的方法。该方法包括给予哺乳动物有效量的疫苗组合物的步骤，其中疫苗组合物包含至少一种佐剂和至少一种抗原，和其中所述佐剂是阳离子脂质。

在还一个实施方案中，提供了预防哺乳动物的疾病的方法。该方法包括给予哺乳动物有效量的疫苗组合物的步骤，其中疫苗组合物包含至少一种佐剂和至少一种抗原，和其中所述佐剂是阳离子脂质。

在还一个实施方案中，提供了进行抗原交叉呈递以在哺乳动物中诱导体液免疫应答和细胞免疫应答的方法。该方法包括给予哺乳动物有效量的疫苗组合物的步骤，其中疫苗组合物包含至少一种佐剂和至少一种抗原，和其中所述佐剂是阳离子脂质。

在各个实施方案中，疫苗组合物包含至少一种佐剂和至少一种抗原，其中佐剂是阳离子脂质。如本文所用的，术语“佐剂”指提高、增大和/或加强哺乳动物对抗原的免疫应答的物质。佐剂的剂量是本领域普通技术人员已知的，以及在pct/us2008/057678(由阳离子脂质刺激免疫应答(stimulationofanimmuneresponsebycationiclipids))、pct/us2009/040500(由阳离子脂质的对映体刺激免疫应答(stimulationofanimmuneresponsebyenantiomersofcationiclipids))中举例说明的那些，两者通过引用以其全文结合到本文中。

在本文所述的一些实施方案中，佐剂是免疫调节剂。如本文所用的，术语“免疫调节剂”指增强、指向和/或促进哺乳动物的免疫应答的免疫修饰剂。

在本文描述的一些实施方案中，佐剂是纳米粒子。如本文所用的，术语“纳米粒子”指具有基于纳米尺度测量的大小的粒子。如本文所用的，“纳米粒子”指具有小于约1,000纳米的尺寸的结构的粒子。在一些实施方案中，纳米粒子是脂质体。

在本文描述的一些实施方案中，佐剂是阳离子脂质。如本文所用的，术语“阳离子脂质”指许多脂质种类中的任何一种，其在生理ph下携带净正电荷或在低于pka的ph下具有可被质子化的基团且为带正电荷的。

已显示阳离子脂质-基纳米粒子除了其用作有效传递系统的能力外，它们还为有效的免疫-修饰佐剂，如在pct/us2008/057678(由阳离子脂质刺激免疫应答(stimulationofanimmuneresponsebycationiclipids))、pct/us2009/040500(由阳离子脂质的对映体刺激免疫应答(stimulationofanimmuneresponsebyenantiomersofcationiclipids))中所证实的，两者通过引用以其全文结合到本文中。含有如所期望的短和长的t-细胞表位肽的疫苗制剂中的阳离子脂质佐剂被证实引起优越的t-细胞免疫应答而无抗体免疫应答。

根据本公开的合适的阳离子脂质包括，但不限于：3-.β.[.sup.4n-(.sup.1n,.sup.8-二胍基亚精胺)-氨基甲酰基]胆固醇(bgsc)；3-.β.[n,n-二胍基乙基-氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(bgtc)；n,n.sup.1n.sup.2n.sup.3四-甲基四棕榈基精胺(cellfectin)；n-叔丁基-n'-十四烷基-3-十四烷基-氨基丙脒(clonfectin)；二甲基双十八烷基溴化铵(ddab)；1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟基乙基溴化铵(dmrie)；2,3-二油酰氧基-n-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-n,n-二甲基-1-丙铵(p--ropanaminium)三氟乙酸盐)(dospa)；1,3-二油酰氧基-2-(6-羧基精胺酰(spermyl))-丙基酰胺(dosper)；4-(2,3-双-棕榈酰氧基-丙基)-1-甲基-1h-咪唑(dpim)n,n,n',n'-四甲基-n,n'-双(2-羟基乙基)-2,3-二油酰氧基-1,4-丁烷-二铵碘化物)(tfx-50)；n-1-(2,3-二油酰氧基)丙基-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)或其它n-(n,n-1-二烷氧基)-烷基-n,n,n-三取代的铵表面活性剂；1,2二油酰基-3-(4'-三甲基铵基(ammonio))丁醇-sn-甘油(dobt)或胆固醇基(4'三甲基氨)丁酸盐(chotb)，其中三甲基铵基通过丁醇间隔臂(spacerarm)连接于双链(对于dotb)或者胆固醇基(对于chotb)；dori(dl-1,2-二油酰基-3-二甲基氨基丙基-.β.-羟基乙基铵)或dorie(dl-1,2-o-二油酰基-3-二甲基氨基丙基-.β.-羟基乙基铵)(dorie)或其如在wo93/03709中公开的类似物；1,2-二油酰基-3-琥珀酰基-sn-甘油胆碱酯(dosc)；胆固醇基半琥珀酸酯(chosc)；脂多胺(lipopolyamines)如双十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(dogs)和二棕榈酰磷脂酰乙醇戊基精胺(dppes)、胆固醇基-3.β.-羧基-酰氨基-亚乙基三甲基碘化铵、1-二甲基氨基-3-三甲基铵基-dl-2-丙基-胆固醇基甲酸酯碘化物、胆固醇基-3-o-羧基酰氨基亚乙基胺、胆固醇基-3-.β.-氧基琥珀酰氨基-亚乙基三甲基碘化铵、1-二甲基氨基-3-三甲基铵基-dl-2-丙基-胆固醇基-3-.β.-氧基琥珀酸酯碘化物、2-(2-三甲基铵基)-乙基甲基氨基乙基-胆固醇基-3-.β.-氧基琥珀酸酯碘化物、3-.β.-n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基胆固醇(dc-chol)，和3-.β.-n-(聚乙烯亚胺)-氨基甲酰基胆固醇；o,o'-二肉豆蔻基-n-赖氨酰天冬氨酸酯(dmke)；o,o'-二肉豆蔻基-n-赖氨酰-谷氨酸酯(dmkd)；1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟基乙基溴化铵(dmrie)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(dlepc)；1,2-二肉豆蔻基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(dmepc)；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(doepc)；1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(dpepc)；1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(dsepc)；1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(dotap)；二油酰基二甲基氨基丙烷(dodap)；1,2-棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷(dptap)；1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷(dstap)、1,2-肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(dmtap)；和十二烷基硫酸钠(sds)。此外，也设想了任何所述阳离子脂质的结构变体和衍生物。

在一些实施方案中，阳离子脂质选自dotap、dotma、doepc及其组合。在其它实施方案中，阳离子脂质是dotap。在还其它实施方案中，阳离子脂质是dotma。在其它实施方案中，阳离子脂质是doepc。在一些实施方案中，阳离子脂质是纯的。在其它实施方案中，阳离子脂质是非甾体阳离子脂质。

在一些实施方案中，阳离子脂质是阳离子脂质的对映体。术语“对映体”指阳离子脂质的立体异构体，所述阳离子脂质是其对应的立体异构体的非重叠的镜像，例如r和s对映体。在各个实例中，对映体是r-dotap或s-dotap。在一个实例中，对映体是r-dotap。在另一个实例中，对映体是s-dotap。在一些实施方案中，对映体是纯的。在各个实例中，对映体是r-dotma或s-dotma。在一个实例中，对映体是r-dotma。在另一个实例中，对映体是s-dotma。在一些实施方案中，对映体是纯的。在各个实例中，对映体是r-dopec或s-dopec。在一个实例中，对映体是r-dopec。在另一个实例中，对映体是s-dopec。在一些实施方案中，对映体是纯的。

在本文所述的各个实施方案中，组合物还包含一种或多种抗原。如本文所用的，术语“抗原”指当引入具有免疫系统的哺乳动物时(直接或在表达时，如在例如dna疫苗中)，被哺乳动物的免疫系统识别并能够引起免疫应答的任何物质(例如，蛋白、肽、多糖、糖蛋白、糖脂、核酸或其组合)。如本文所定义的，抗原-诱导的免疫应答可以是体液或细胞-介导的，或二者兼而有之。当一种物质能够特异性地与免疫系统的抗原识别分子，如免疫球蛋白(抗体)或t细胞抗原受体(tcr)相互作用时，其被称为“抗原性的”。

在一些实施方案中，一种或多种抗原是蛋白-基抗原。在其它实施方案中，一种或多种抗原是肽-基抗原。在各个实施方案中，一种或多种抗原选自病毒抗原、细菌抗原和致病性抗原。如本文所用的“微生物抗原”是微生物的抗原并包括，但不限于，传染性病毒、传染性细菌、传染性寄生虫和传染性真菌。微生物抗原可以是完整的微生物及其天然分离物、片段或衍生物、合成的化合物(其与天然存在的微生物抗原相同或类似，并且优选地诱导对相应的微生物(天然存在的微生物抗原源自其中)的特异性免疫应答)。在一个实施方案中，抗原是癌抗原。在一个实施方案中，抗原是病毒抗原。在另一个实施方案中，抗原是真菌抗原。在另一个实施方案中，抗原是细菌抗原。在各个实施方案中，抗原是致病性抗原。在一些实施方案中，致病性抗原是合成的或重组抗原。

在本公开的一些实施方案中，至少一种抗原包含选自以下的序列：rahynivtf(seq.id.no:1)、gqaepdrahynivtf(seq.id.no:2)、kssgqaepdrahynivtf(seq.id.no:3)、ymldlqpett(seq.id.no:4)、kssymldlqpett(seq.id.no:5)、mhgdtptlheymldlqpett(seq.id.no:6)、llmgtlgivcpicsqkp(seq.id.no:7)、kvprnqdwl(seq.id.no:8)、syvdffvwl(seq.id.no:9)、kyicnsscm(seq.id.no:10)和ksskvprnqdwl(seq.id.no:11)。在一个实施方案中，至少一种抗原包含序列rahynivtf(seq.id.no:1)。在另一个实施方案中，至少一种抗原包含序列gqaepdrahynivtf(seq.id.no:2)。在还一个实施方案中，至少一种抗原包含序列kssgqaepdrahynivtf(seq.id.no:3)。在一些实施方案中，kssgqaepdrahynivtf(seq.id.no:3)被修饰以进一步包含疏水基团。在一个实施方案中，疏水基团是棕榈酰基。

在其它实施方案中，至少一种抗原包含序列ymldlqpett(seq.id.no:4)。在另一个实施方案中，至少一种抗原包含序列kssymldlqpett(seq.id.no:5)。在还一个实施方案中，kssymldlqpett(seq.id.no:5)被修饰以进一步包含疏水基团。在一个实施方案中，疏水基团是棕榈酰基。

在其它实施方案中，至少一种抗原包含序列kssmhgdtptlheymldlqpett(seq.id.no:6)。在另一个实施方案中，kssmhgdtptlheymldlqpett(seq.id.no:6)被修饰以进一步包含疏水基团。在一个实施方案中，疏水基团是棕榈酰基。

在其它实施方案中，至少一种抗原包含序列kssllmgtlgivcpicsqkp(seq.id.no:7)。在一些实施方案中，kssllmgtlgivcpicsqkp(seq.id.no:7)被修饰以进一步包含疏水基团。在一个实施方案中，疏水基团是棕榈酰基。

在一些实施方案中，至少一种抗原包含序列kvprnqdwl(seq.id.no:8)。在其它实施方案中，至少一种抗原包含序列syvdffvwl(seq.id.no:9)。在另外的其它实施方案中，至少一种抗原包含序列kyicnsscm(seq.id.no:10)。在另一个实施方案中，至少一种抗原包含序列ksskvprnqdwl(seq.id.no:11)。在一些实施方案中，ksskvprnqdwl(seq.id.no:11)被修饰以进一步包含疏水基团。在一个实施方案中，疏水基团是棕榈酰基。

在一个实施方案中，抗原包含选自以下的序列：gp100(kvprnqdwl[seq.id.no.8])、trp2(syvdffvwl[seq.id.no.9])和p53(kyicnsscm[seq.id.no.10])，及其组合。

在一个实施方案中，抗原包含gp100序列0(kvprnqdwl[seq.id.no.8])或trp2序列(syvdffvwl[seq.id.no.9])。

在各个实施方案中，至少一种抗原选自脂蛋白、脂肽和用具有增加的疏水性或降低的疏水性的氨基酸序列修饰的蛋白或肽。在一些实施方案中，一种或多种抗原是经修饰以增加抗原的疏水性的抗原。在一个实施方案中，至少一种抗原是经修饰的蛋白或肽。在一些实施方案中，经修饰的蛋白或肽结合于疏水基团。在其它实施方案中，经修饰的结合于疏水基团的蛋白或肽还包含抗原和疏水基团之间的连接序列。在一些实施方案中，疏水基团是棕榈酰基。在还有的其它实施方案中，至少一种抗原是未修饰的蛋白或肽。

在本文描述的一些实施方案中，疫苗组合物是通用疫苗。如本文所用的，“通用”疫苗可保护哺乳动物对抗广泛范围的病原体，例如广泛范围的流感病毒，并可能在多个病原株中交叉有效。成功的开发通用流感疫苗可保护哺乳动物对抗广泛种类的相关病原体而不是仅仅几个病原体。通用疫苗有可能“成品(off-the-shelf)”使用并可提供对抗新出现的病原体的一些保护作用。例如，通用流感疫苗流感病毒可针对在这些病毒的世界范围的监测期间专家尚未鉴定的新出现的病毒提供一些保护作用。通用疫苗可降低疾病的严重性，加快身体清除病原体自身的能力，和减少感染的致死率直至可获得对抗该病原体的特异性疫苗。

在本文描述的一些实施方案中，疫苗组合物是抗-病毒疫苗。在本文描述的一些实施方案中，疫苗组合物是抗-真菌疫苗。在本文描述的一些实施方案中，疫苗组合物是抗-细菌疫苗。

在本文描述的一些实施方案中，疫苗组合物是流感疫苗。在本文描述的其它实施方案中，流感疫苗是通用流感疫苗。本公开证实，当与灭活的流感病毒的h3n2、n1n1和布里斯班株配制时，阳离子脂质显著地诱导提高的抗体保护作用。在来自小鼠-适应的病毒(h1n1):ha518-526，iystvassl，k^d限制的pr8株的血凝素(ha)内存在完全确立的cd8t细胞表位。已显示具有这种表位的疫苗保护小鼠避免致死性感染。这种表位在含有全长血凝素的h5n1病毒a/越南/2004中也是共有的。用h5免疫可在小鼠中诱导对h1n1的交叉-保护的cd8免疫，因此被认为是用于交叉保护免疫的一个好模型。当用阳离子脂质配制时，灭活的h5n1疫苗的有效交叉-呈递显示导致对抗cd8表位iystvassl的显著提高的ctl。除了经由mhcii类途径呈递蛋白外，阳离子脂质引起来自灭活病毒的外源性ha蛋白经由mhc-i类途径内化、加工和呈递为肽的能力，提供一种开发基于重组ha蛋白或活的减毒和灭活病毒的有效通用流感疫苗的新方法。

在本文所述的各个实施方案中，流感疫苗包含流感病毒表面上发现的糖蛋白抗原。在一个实施方案中，抗原是血凝素抗原。在其它实施方案中，血凝素抗原包含表位区ha518-526。

在本文所述的各个实施方案中，流感疫苗是神经氨酸酶亚单位疫苗。在本文所述的其它实施方案中，流感疫苗是h3n2疫苗。在本文所述的另外的其它实施方案中，流感疫苗是n1n1疫苗。在本文所述的其它实施方案中，流感疫苗是布里斯班疫苗。在本文所述的另外的其它实施方案中，流感疫苗是h1n1疫苗。

在本文所述的各个实施方案中，流感疫苗包含来自一种或多种流感病毒的一种或多种蛋白抗原。在本文所述的其它实施方案中，流感疫苗包含灭活病毒(如灭活全病毒)。在本文所述的另外的其它实施方案中，流感疫苗包含减毒的病毒。在本文所述的一些实施方案中，流感疫苗包含破裂的病毒。在本文所述的其它实施方案中，流感疫苗包含重组病毒。

在本文所述的各个实施方案中，疫苗组合物能够诱导体液免疫应答。如本文所用的，术语“体液免疫应答”涉及在细胞外液中发现的大分子(如分泌的抗体、补体蛋白和某些抗菌肽)介导的免疫方面。在一些实施方案中，体液免疫应答是抗体应答。在各个实施方案中，疫苗组合物能够诱导针对病原体的保守区的体液免疫应答。

在本文所述的各个实施方案中，疫苗组合物能够诱导细胞免疫应答。如本文所用的，术语“细胞免疫应答”涉及吞噬细胞、抗原-特异性细胞毒性t-淋巴细胞的激活，各种细胞因子在应答抗原时的释放等。在一些实施方案中，细胞免疫应答是t细胞应答。在某些实施方案中，t细胞应答是cd8+t细胞应答。在各个实施方案中，疫苗组合物能够诱导针对病原体的保守区的细胞免疫应答。

在本文所述的各个实施方案中，疫苗组合物能够进行抗原交叉呈递以诱导患者的体液免疫应答和细胞免疫应答。在某些实施方案中，疫苗组合物能够交叉-呈递一种或多种抗原。在其它实施方案中，疫苗组合物产生体液免疫应答和细胞免疫应答。

在本文所述的各个实施方案中，疫苗组合物通过激活有丝分裂原-激活的蛋白(map)激酶信号传导途径，诱导哺乳动物的免疫应答。由佐剂如阳离子脂质诱导的免疫应答描述于例如pct/us2008/057678(wo/2008/116078；“由阳离子脂质刺激免疫应答(stimulationofanimmuneresponsebycationiclipids)”)和pct/us2009/040500(wo/2009/129227；“由阳离子脂质的对映体刺激免疫应答(stimulationofanimmuneresponsebyenantiomersofcationiclipids)”)中，两者的全部内容通过引用以其全文结合到本文中。在一些实施方案中，map激酶信号传导途径通过刺激细胞外信号-调节的激酶(“erk”)-1、erk-2和p38的至少一种而激活。在其它实施方案中，所述组合物提高功能性抗原-特异性cd8+t淋巴细胞应答。术语“哺乳动物”是本领域技术人员熟知的。在一个实施方案中，哺乳动物是人。

在本文描述的一个实施方案中，提供了治疗哺乳动物的疾病的方法。该方法包括给予哺乳动物有效量的疫苗组合物的步骤，其中疫苗组合物包含至少一种佐剂和至少一种抗原，和其中所述佐剂是阳离子脂质。前述的疫苗组合物的实施方案适用于本文所述的治疗哺乳动物的疾病的方法。

在一些实施方案中，“治疗”、“处理”和“医治”，如本文在涉及传染性病原体所用的，指预防性治疗，所述预防性治疗增加受试者对感染病原体的抵抗力或降低受试者将被病原体感染的可能性；和/或在受试者已感染后进行治疗以与感染作斗争，例如，减轻或消除感染或防止其变得更糟。在一个实施方案中，方法是预防性治疗。

在一些实施方案中，疾病是致病性疾病。在其它实施方案中，疾病由多个病原株引起。在某些实施方案中，疾病是流感。

在各个实施方案中，所述方法诱导哺乳动物的体液免疫应答。在一些实施方案中，体液免疫应答是抗体应答。在其它实施方案中，体液免疫应答是针对病原体的保守区。

在各个实施方案中，所述方法诱导哺乳动物的细胞免疫应答。在一些实施方案中，细胞免疫应答是t细胞应答。在其它实施方案中，t细胞应答是cd8+t细胞应答。在某些实施方案中，细胞免疫应答是针对病原体的保守区。在其它实施方案中，所述方法诱导哺乳动物的体液免疫应答和细胞免疫应答。

在各个实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，给药经由map激酶信号传导途径，在哺乳动物的免疫系统的细胞中激活免疫应答。在各个实施方案中，map激酶信号传导途径通过刺激erk-1、erk-2和p38的至少一种而激活。

在其它实施方案中，免疫应答激活哺乳动物的细胞毒性t淋巴细胞。在一个实施方案中，细胞毒性t淋巴细胞是cd8+t细胞。在另一个实施方案中，给药提高功能性抗原-特异性cd8+t淋巴细胞应答。在还一个实施方案中，免疫应答激活哺乳动物的抗体应答。在其它实施方案中，免疫应答激活哺乳动物的干扰素-γ(ifn-α)。

在本文描述的一个实施方案中，提供了预防哺乳动物的疾病的方法。该方法包括给予哺乳动物有效量的疫苗组合物的步骤，其中疫苗组合物包含至少一种佐剂和至少一种抗原，和其中所述佐剂是阳离子脂质。前述的疫苗组合物和治疗哺乳动物疾病的方法的实施方案适合于本文所述的预防哺乳动物的疾病的方法。

在本文描述的一个实施方案中，提供了进行抗原交叉呈递以在哺乳动物中诱导体液免疫应答和细胞免疫应答的方法。该方法包括给予哺乳动物有效量的疫苗组合物的步骤，其中疫苗组合物包含至少一种佐剂和至少一种抗原，和其中所述佐剂是阳离子脂质。疫苗组合物，治疗哺乳动物的疾病的方法，和预防哺乳动物的疾病的方法的前述实施方案适合于本文描述的进行抗原交叉呈递以在哺乳动物中诱导体液免疫应答和细胞免疫应答的方法。

实施例1

流感疫苗制剂

注射用无菌水(wfi)或缓冲液被用于所有脂质体配制程序中。在本实施例中，r-dotap被用作示例性阳离子脂质。这些研究中使用的脂质体使用脂质薄膜制得。脂质薄膜在玻璃小瓶中通过(1)使脂质溶于有机溶剂如氯仿中，和(2)在干燥氮气的稳流下蒸发氯仿溶液而制得。通过将薄膜保持在真空下过夜，除去痕量的有机溶剂。然后通过加入需要量的wfi或缓冲液水解脂质薄膜，以制备最终浓度4mm或8mm的r-dotap阳离子脂质。然后挤出悬浮液至200nm的尺寸并于4℃贮存。也可使用通常在脂质体制剂中所用的其它阳离子脂质和方法，它们是本领域技术人员熟知的。

将含有3种流感抗原b布里斯班、a/加利福尼亚/07/2009(h1n1)、a/珀斯/16/2009(h3n2)的商业流感疫苗制剂在pbs中稀释至60μg/ml或12μg/ml，然后与8mm或4mmr-dotap或pbs按1:1v/v混合，以在pbs中得到30和6μg/ml，含有4mmdotap，或2mmdotap，或pbs。通过上下移液进行混合。没有乳液生成。溶液稍显混浊，但为透明的典型dotap制剂。未见到沉淀物。

实施例2

阳离子脂质-基流感疫苗的保护效力评价：对抗a/珀斯/16/2009(h3n2)的保护性血细胞凝聚抑制试验

对c57bl/6j小鼠在剃毛的侧腹用100μl皮下注射，以传递在pbs、4mmr-dotap或2mmr-dotap中的最终剂量3μg或0.6μg的抗原。在0天注射小鼠，然后在21天再次注射相同的制剂。在第14和35天进行尾静脉采血。

在试验前于-80℃冷冻贮存血清。样品关于治疗组编码。血细胞凝聚抑制试验针对病毒a/珀斯/16/2009(h3n2)进行以对诱导抗-流感抗体和疫苗产生的保护效果进行量化。

每组测试4只小鼠：

1.幼稚(naïve)

2.3ug+pbs

3.3ug+4mmr-dotap

4.3ug+2mmr-dotap

5.0.6ug+pbs

6.0.6ug+4mmr-dotap

7.0.6ug+2mmr-dotap

结果示于图1。在第一次注射(第14天采血)后，商业疫苗显示未有对抗h3n2病毒的保护抗体产生。相反，然而，阳离子脂质-基疫苗显示hai滴度的显著增加。在第2次注射(第35天采血)后，用高或低量的r-dotap，高抗原剂量疫苗显示抗体诱导效力的约8-10倍增加。在第2次注射(第35天采血)后，低抗原剂量疫苗显示抗体诱导效力的约40-倍增加，两种疫苗制剂的任何一种含有高或低量的r-dotap。与高抗原剂量商业疫苗相比，具有r-dotap的低剂量抗原疫苗增加效力约8-倍。

实施例3

阳离子脂质-基流感疫苗的保护效力评价：对抗大流行流感株a/加利福尼亚/07/2009(h1n1)的保护性血细胞凝聚抑制试验

对c57bl/6j小鼠在剃毛的侧腹用100μl皮下注射，以传递在pbs、4mmr-dotap或者2mmr-dotap中的最终剂量3μg或0.6μg的抗原。在0天注射小鼠，然后在21天再次注射相同的制剂。在第14和35天进行尾静脉采血。

在试验前于-80℃冷冻贮存血清。样品关于治疗组编码。血细胞凝聚抑制试验针对病毒a/加利福尼亚/07/2009(h1n1)进行以对诱导抗体和疫苗的保护效果进行量化。

每组测试4只小鼠：

1.幼稚(naïve)

2.3ug+pbs

3.3ug+4mmr-dotap

4.3ug+2mmr-dotap

5.0.6ug+pbs

6.0.6ug+4mmr-dotap

7.0.6ug+2mmr-dotap

结果示于图2。在第一次注射(第14天采血)后，阳离子脂质-基疫苗显示hai滴度的较高的增加。在第2次注射(第35天采血)后，r-dotap基疫苗根据抗原和阳离子脂质剂量显示抗体诱导效力的约2-8倍增加。在第2次注射(第35天采血)后，具有r-dotap的低抗原剂量疫苗与含有5-倍更高抗原剂量的高抗原剂量商业疫苗至少同样有效。

实施例4

阳离子脂质-基流感疫苗的保护效力评价：对抗流感株b布里斯班的保护性血细胞凝聚抑制试验

对c57bl/6j小鼠在剃毛的侧腹用100μl皮下注射，以传递在pbs、4mmr-dotap或者2mmr-dotap中的最终剂量3μg或0.6μg的抗原。在0天注射小鼠，然后在21天再次注射相同的制剂。在第14和35天进行尾静脉采血。

在试验前于-80℃冷冻贮存血清。样品关于治疗组编码。血细胞凝聚抑制试验针对病毒b布里斯班进行以对诱导抗体和疫苗的保护效果进行量化。

每组测试4只小鼠：

1.幼稚(naïve)

2.3ug+pbs

3.3ug+4mmr-dotap

4.3ug+2mmr-dotap

5.0.6ug+pbs

6.0.6ug+4mmr-dotap

7.0.6ug+2mmr-dotap

结果示于图3。在第一次注射(第14天采血)后，各疫苗之间几乎未观察到差异，且无疫苗提供显著的滴度。在第2次注射(第35天采血)后，r-dotap基疫苗根据抗原和阳离子脂质剂量显示效力的4-35倍增加。在第2次注射(第35天采血)后，根据r-dotap浓度，低抗原剂量疫苗的效力比含有5-倍更高的抗原剂量的高抗原剂量商业疫苗高4-8倍。

实施例5

用r-dotaph5n1流感疫苗接种后的cd8t细胞应答诱导

在开发流感疫苗以对不同亚型的流感诱导广泛交叉-保护免疫方面有相当大的益处。现有的tiv疫苗像流感病毒疫苗(fluzone)主要由ha蛋白组成且不生成显著的cd8t细胞应答。实施例2-4显示，在接种流感病毒疫苗(fluzone)后，r-dotap可大大地提高对ha的抗体应答。

在病毒(h1n1):ha518-526,iystvassl,k^d限制的小鼠-适应的pr8株的血凝素内存在完全确立的cd8t细胞表位。肽iystvassl与不相关的肽一起被用于ifnγelispot试验，以评价cd8应答。

方法：

完全弗氏佐剂(cfa)被用作阳性对照，因为已知cfa提供抗原的交叉-呈递，其也刺激对全卵清蛋白的cd8t细胞应答。cfa不能用于疫苗，因为其诱导严重和潜在的致死性炎性反应。

balb/c小鼠，5只小鼠/组

在0天接种疫苗，在第7天加强接种，在第14天进行elispot。

a.幼稚

b.仅仅cfa

c.h5n1疫苗，3ug/小鼠

d.h5n1疫苗，3ug/小鼠+cfa

e.h5n1疫苗，3ug/小鼠+r-dotap4mm

f.仅有r-dotap(4mm)

第14天：

处死，取出脾脏并用ha518-526肽和不相关的肽进行elispot。

elispot试验

ifn-γelispot板；2.5x105脾细胞/孔，刺激肽：ha518-526和hpve629-38(不相关的肽)，二者均为10mm。显色elispot板并扫描该板，计数ifn-γ斑点。

结论：

在单用h5n1接种疫苗后，获得对ha518-526表位的特异性elispots，并在用cfa或r-dotap辅佐后获得更大量的斑点(图4)。cfa仅适度地提高h5n1斑点，而r-dotap刺激2-倍的应答提高。应答是特异性的：在无肽孔或对不相关肽的应答中仅有非常低的斑点数。然而，在来自cfa接种疫苗的小鼠的孔中有显著的“背景”斑点(至多25斑点)。在cfa免疫后保持高水平的非-特异性免疫激活。

由于用含有全长血凝素的灭活h5n1疫苗进行接种并测定对内在的、i类-限制的肽表位的t细胞应答，这是涉及通过i类加工途径的外源性蛋白加工的“交叉-呈递”的指示。因此，r-dotap显示显著地提高已知在小鼠实验中为交叉-保护的内部ha表位的交叉呈递。

实施例6

对用r-dotap配制的多-表位肽的抗体应答评价

用hpv-16e7肽(aa43-57)配制的r-dotap经皮下注射给hla-a2小鼠。在第1、21和42天对小鼠接种疫苗并在第57天抽血并经elisa评价对肽疫苗的igg和igm抗体诱导。

结果：

表1：个体抗体免疫应答结果(e743-57)–log滴度

结论：

当用t-细胞表位肽配制阳离子脂质佐剂时，可忽略抗体应答。然而，可观察到强的ctl应答。

实施例7

阳离子脂质和辅佐的疫苗制剂中的免疫应答比较

使用包含不同阳离子脂质纳米粒子和不同抗原组件的疫苗制剂的t-细胞免疫应答通过elispot评价。在该实施例中，使用各种阳离子脂质纳米粒子doepc和dotma配制疫苗制剂，并与乳液佐剂montanide™比较。

在本实施例中评价了各种不同的疫苗制剂。在一个制剂中，抗原包含肽抗原棕榈酰-kssgqaepdrahynivtf[seq.id.no.3](0.11mm)和阳离子脂质doepc(1mm)。在第二个制剂中，抗原包含肽抗原棕榈酰-kssgqaepdrahynivtf[seq.id.no.3](0.11mm)和阳离子脂质dotma(1mm)。在第三个制剂中，抗原组件包含经修饰的肽抗原[seq.id.no.3](0.11mm)和乳液佐剂montanide™。

各种疫苗制剂的t-细胞效力通过经由elispot测定对t-细胞表位肽hpv-16e749-57rahynivtf[seq.id.no.2]的抗原-特异性免疫应答来评价。

结论：

在接种dotma、doepc和montanide™(各自用seq1配制)后，获得对e749-57表位的特异性elispots。与montanide™佐剂比较，在用阳离子脂质dotma或doepc配制后获得更大数目的斑点(见图5)。该实施例显示阳离子脂质作为有效的免疫调节佐剂起作用并诱导比乳液佐剂montanide™优越的cd8+t-细胞免疫应答。

实施例8

在用dotma或doepch5n1流感疫苗接种后的cd8t细胞应答的诱导

在来自病毒(h1n1):ha518-526,iystvassl,k^d限制的小鼠-适应的pr8株的血凝素内存在完全确立的cd8t细胞表位。肽iystvassl与不相关肽一起被用于ifnγelispot试验，以评价cd8应答。在本实施例中，dotma或doepc(包括各自的对映体)可用作示例性阳离子脂质。

方法：

完全弗氏佐剂(cfa)被用作阳性对照，因为已知cfa提供抗原的交叉-呈递，其也刺激对全卵清蛋白的cd8t细胞应答。cfa不能用于疫苗，因为其诱导严重和潜在的致死性炎性反应。

可评价balb/c小鼠，5只小鼠/组

在0天接种疫苗，在第7天加强接种，在第14天进行elispot。

a.幼稚

b.仅用cfa

c.h5n1疫苗,3ug/小鼠

d.h5n1疫苗,3ug/小鼠+cfa

e.h5n1疫苗,3ug/小鼠+r-dotap4mm

f.仅用r-dotap(4mm)

第14天：

处死，取出脾脏并用ha518-526肽和不相关的肽进行elispot。

elispot试验

ifn-γelispot板；2.5x105脾细胞/孔，刺激肽：ha518-526和hpve629-38(不相关的肽)，二者均为10mm。可显色elispot板并可扫描该板，可计数ifn-γ斑点。

<110>pds生物科技公司

<120>改进的疫苗组合物和使用方法

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