一种新型柑橘橘络提取物及其制备方法和改善肠道菌群作用的医学用途与流程

本发明涉及医药、食品和保健品领域，尤其涉及一种新型柑橘橘络提取物及其制备方法和改善肠道菌群作用的医学用途。
背景技术：
：柑橘果胶是来源于植物细胞壁的多糖，一般可作为食品添加剂使用，有很好的胶凝、稳定、乳化、增稠、悬浮功能，同样的，天然柑橘果胶分子量大(5-30万da),食用后无法被肠道吸收而不能使其在体内充分发挥作用。鉴于此，对其分子进行大小及结构的改性，具有增强生物学功能的前景。果胶改性的几类主要方法，包括化学(ph)改性、酶改性、热改性、辐照改性、接枝改性、交联改性和取代改性；目前，国内外的小分子果胶提取技术,主要是利用天然柑橘果胶经过改性方法制备，包括化学(ph)改性、酶改性、热改性、辐照改性、接枝改性、交联改性和取代改性；这些方法进行天然果胶分子链断链的处理,可得到分子量为2000-35000da的小分子果胶,酯化度2-30％,水解的作用一是将果胶直链切断以降低分子量，二是降低酯化度，直链切断的过程中采用的工艺，会导致果胶的活性降低，服用后得到的效果仅有10％左右。过去，因为小分子果胶只有欧美、日本等国家的极少数企业掌握核心生产技术，我国小分子果胶产业长期受限于国外技术垄断，产品绝大多数以进口为主，所以迫切需要自主研发、技术领先的国产小分子果胶充实国内市场，我们完全可以充分利用我国丰富的柑橘资源，生产出优质的小分子柑橘果胶，满足国内日益增长的市场需求，可苦于技术的限制，使得这一市场基本被国外企业占领。申请人范晓青申请了中国发明专利(cn200610050803.3.cn200610051667.x,cn201010226113.5.cn201110028976.6)公开了低分子柑桔果胶的新用途，该低分子柑桔果胶由干柑桔皮提取果胶后采用氢氧化钠和氢氧化钾催化获得低分子柑桔果胶。其采用将果胶直链切断以降低分子量的方式,会导致果胶的活性降低。本发明的发明人高海峰申请的中国发明专利申请(申请号cn201610531658.4,公开日：2016.12.07)公开了一种柑橘罐头加工工艺中同步提取果胶及多酚的方法,分别通过不同级别的分离装置分离出柑橘罐头加工工艺水中的高分子果胶、低分子果胶以及多酚、单糖等物质，避免了传统罐头加工中工艺水难处理造成环境污染及物质浪费，且各个不同分子量物质的分离采用的分离提取方式也都不同，比如超滤、纳滤等，不会使回收工艺太过复杂。本发明还提供了一种柑橘罐头工艺水中提取果胶及多酚的系统，根据高分子果胶、低分子果胶以及多酚、单糖分子量大小不同，采用不同的膜装置用于过滤的分离装置，促使分离出的上述物质纯度较高，系统中包含除盐装置能有效的去除工艺水中的重金属以及盐类，避免了这些物质对提取后的高分子果胶、低分子果胶以及酚、单糖的污染。便秘是临床上常见的症状之一。随着生活节奏的加快,人们的工作压力越来越大,加上生活不规律与饮食结构的变化，经加工精制的低纤维食品不断增多，导致了肠道蠕动减弱、直肠肌肉无力等，出现便秘。长期的便秘可使肠道细菌发酵而产生的致癌物质刺激肠黏膜上皮细胞，导致异形增生,易诱发癌变。为此，申请人申请中国发明专利申请(申请号：2017102129097,申请h：2017-04-01)公开了一种新型柑橘橘络提取物，该提取物包括柑橘橘络提取高分子果胶后的萃取液经过物理分离制备的小分子果胶和柑橘黄酮，所述的提取物每100ml含小分子果胶32000mg,柑橘黄酮^400mgo本发明的柑橘橘络提取物小分子果胶和柑橘黄酮属于天然的复合成分对润肠通便有很好的效果。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供一种新型柑橘橘络提取物，该柑橘橘络提取物中小分子果胶是一种从柑橘橘络中直接提取出的水溶性多糖，保持了果胶的活性，柑橘黄酮是从柑橘橘络中直接分离提取出的黄酮类物质的总称。本发明的第二个目的是提供一种上述的柑橘橘络提取物的制备方法，本发明的第三个目的是提供上述的柑橘橘络提取物的医药用途。本发明的第四个目的是提供上述的柑橘橘络小分子果胶的医药用途。为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：一种新型柑橘橘络提取物，该提取物包括柑橘橘络在提取高分子果胶后的萃取液经过物理分离制备的小分子果胶和柑橘黄酮，所述的提取物每100ml含小分子果胶32000mg,柑橘黄酮3400mgo作为优选，所述的小分子果胶的摩尔质量为50000da以下。作为再优选，所述的小分子果胶的摩尔质量为1000-50000da之间。为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：一种制备所述的柑橘橘络提取物的方法，该方法包括以下的步骤：1)原料的处理将柑橘橘络原料，进入酸提罐，并加热至40-50℃,调节ph至3.5-4.5,保温3～5小时；2)过滤浸提后的液体，经过滤滤出残渣,取滤液进入萃取罐,滤渣进行二次浸提；3)萃取浸提后的液体进入萃取罐,加入萃取液,进行高分子果胶萃取，萃取后的萃取液进入压榨装置,将得高分子果胶；4)回收萃取液萃取液经过萃取回收装置回收,萃取液残留部分为小分子果胶和黄酮的原料液；5)超滤i含有小分子果胶和黄酮的原料经过超滤滤出大于5万分子量的果胶和杂质；6)超滤n选用1000分子量的超滤分离和浓缩超滤i滤后的滤液,得到小分子果胶液；7)纳滤选用纳滤膜分离黄酮液,将超滤n的透过滤进入纳滤膜进行分离后浓缩,得柑橘黄酮液。为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：上述的柑橘橘络提取物用于制备润肠通便、调节肠道菌群或改善肠道黏膜屏障功能的药物、食品或保健品中的应用。为了实现上述的第四个目的，本发明采用了以下的技术方案：本发明还公开了柑橘橘络小分子果胶用于制备润肠通便、调节肠道菌群或改善肠道黏膜屏障功能的药物、食品或保健品中的应用，所述的柑橘橘络小分子为果胶柑橘橘络在提取高分子果胶后的萃取液经过物理分离制备的小分子果胶。优选，所述的柑橘橘络小分子果胶的摩尔质量为50000da以下，再优选,所述的柑橘橘络小分子果胶的摩尔质量为1000-50000da之间。本发明所述的柑橘橘络小分子果胶的是柑橘橘络提取物中物理分离制备的小分子果胶。其制备方法包括但不限于以下两种方法：1、采用如中国发明专利申请(申请号：2017102129097,申请0:2017-04-01)公开的技术方案获得；2、采用本发明的发明人高海峰申请的中国发明专利申请(申请号cn201610531658.4,公开0:2016.12.07)公开方法获得。本发明柑橘橘络小分子果胶是一种从柑橘橘络中直接提取出的水溶性多糖，本方法制备的柑橘橘络小分子果胶，摩尔质量在1000-50000道尔顿，独有的世界级膜分离生产技术，很好了保持了果胶的活性。其区别于国内外市场改性小分子果胶的特性主要有:纯天然、无添加、高活性，即不破坏果胶自身的化学结构活性。本发明小分子果胶来源于植物细胞壁，是一种通过at,4糖昔键连接起来的聚半乳糖醛酸的长链多糖聚合物，是一种纯天然膳食纤维,不能被人体内消化液中的酶类所分解,部分可在大肠内被微生物发酵分解为短链脂肪酸,从而降低肠道ph值,抑制肠道有害菌生长，促进有益菌增殖，增强大肠蠕动功能。同时还可吸收本身容积2.5倍的水分，使粪便变软而易于排出，解除便秘之忧，排毒效果快速显著。柑橘黄酮是从柑橘橘络中直接分离提取出的黄酮类物质的总称，黄酮类物质具有抗氧化、抗血栓、抗肿瘤、抗菌消炎、抗病毒和排毒等多种作用，对物质代谢有调节作用。本发明的柑橘橘络提取物小分子果胶和柑橘黄酮属于天然的复合成分对润肠通便有很好的效果。本发明富含小分子果胶的柑橘橘络提取物具有较好的改善肠道黏膜屏障功能的作用，机制与增加连接蛋白表达和短链脂肪酸合成有关，研究还发现了小分子果胶具有调节肠道菌群的作用。附图说明图1是本柑橘橘络小分子果胶对肠道菌群的影响试验流程图。图2为以样本相似性对默认丰度最高30个0tu信息的热图。图3为门水平菌群结构变化图。图4为纲水平菌群结构变化图。图5为目水平菌群结构变化图。图6为科水平菌群结构变化图。图7为属水平菌群结构变化图。图8本发明实施例1的工艺流程图。具体实施方式实施例1如图8示的一种制备柑橘橘络提取物的方法，该方法包括以下的步骤：1)原料的处理柑橘橘络经过粉碎、清洗、甩干后进入酸提罐，并加热至40-50℃,用酸(hc1)调节ph至3.5-4.5,保温4小时。2)过滤浸提后的液体，经过滤滤出残渣，取滤液进入萃取罐，滤渣进行二次浸提。3)萃取浸提后的液体进入萃取罐,加入萃取液,进行高分子果胶萃取，萃取后的萃取液进入压榨装置,将得高分子果胶。4)回收萃取液萃取液经过萃取回收装置回收,萃取液残留部分为小分子果胶和黄酮的原料液。5)超滤i含有小分子果胶和黄酮的原料经过超滤滤出大于5万分子量的果胶和杂志。6)超滤n选用1000分子量的起滤分离和浓缩超滤i滤后的滤液，得到1000-5万的小分子果胶液。7)纳滤选用纳滤膜分离黄酮液,将起滤n的透过滤进入纳滤膜进行分离后浓缩,得柑橘黄酮液。实施例21.1材料实施例1获得，成品为褐色悬浊液。经过测定，每100ml含小分子果胶32000mg,柑橘黄酮(vp)3400mg,总固形物^4500mgo1.2动物与分组清洁级(ii级)昆明种雄性小白鼠150只，体重为22～25g,由军事医学科学院实验动物中心提供。设0.2、0.4、0.8ml/(25g·bw)(分别相当于人体推荐量的5、10、20倍)三个剂量的实验组，同时设便秘模型对照组和阴性对照组，每组15只动物。1.3方法按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中“通便功能检验方法”进行,具体方法如下：1.3.1小肠运动实验各实验组按0.8毫升/只经口给予受试物，阴性和模型对照组给予等量的蒸馅水，每天灌胃1次，连续7天。末次给样的当天下午,各组动物禁食不禁水16h,次日早晨给予模型对照组和三个实验组剂量为5mg/(kg·bw)的复方地芬诺酯溶液(常州康普药业制药责任公司生产，批号＝1604014)[0.2ml/(10g·bw)】，阴性对照组给予等量蒸馅水。等待30min后，三个剂量组给予含相应受试物的墨汁(取印度墨水1ml,加入49ml蒸馅水配制成2％墨汁，灌胃剂量为0.1ml/10g·bw。用墨汁与灌胃液勾兑，灌胃总量保持1ml),模型对照组和阴性对照组给予2％墨汁。给予墨汁25min后颈椎脱臼处死动物,打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管，置于大张白色塑料纸上，轻轻将小肠拉成直线进行测量。肠管长度为“小肠总长度”，从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”。按下列公式计算墨汁推进率(p),并进行数据转换(x)后再统计分析。墨汁推进率(p)＝(墨汁推进长度/小肠总长度)x100％；x＝sinv_po1.3.2排便实验给受试物方法同小肠运动实验。末次给样的当天下午,各组动物禁食不禁水16h,次日早晨给予模型对照组和三个实验组剂量为10mg/(kg·bw)的复方地芬诺酯溶液[0.2ml/(10g·bw)】，阴性对照组给予等量蒸馅水。等待30min后，三个剂量组给予含相应受试物的洋红溶液(取洋红粉末lg,加入49ml蒸馅水配制成2％洋红，灌胃剂量为0.1ml/10g·bw。用洋红与灌胃液勾兑成混合液,灌胃总量保持1ml),模型对照组和阴性对照组给予2％洋红，同时开始计时。从灌胃洋红开始,观察记录每只动物首次排红便所需时间、6h排便粒数并称重。1.3.3统计学处理采用spss软件进行方差分析及两两检验。2结果2.1柑橘橘络提取物对小鼠体重的影响从表1、2结果可见，各剂量组小鼠在实验前后的体重与阴性对照组及模型对照组比较，均无显著性差异(p〉0.05),表明该提取物对小鼠体重增长无显著影响。表1小鼠小肠运动实验前后体重比较(x±s)注:表中各组间比较差异均无显著性意义(p〉0.05)。表2小鼠排便实验前后体重比较g+s)注:表中各组间比较差异均无显著性意义(p〉0.05)o2.2柑橘橘络提取物对小鼠小肠运动的影响由表3可见,便秘模型对照组小鼠的墨汁推进率显著低于阴性对照组(p<0.05),表示便秘模型建立成功。低、中剂量组小鼠的墨汁推进率高于模型对照组(p<0.05),经数据转换后统计分析,5倍、10倍剂量组与便秘模型组相比具有显著差异(p<0.05)，其中10倍组的效果要好于5倍组,表明该提取物具有促进小鼠的小肠运动的作用。表3柑橘橘络提取物对小鼠小肠运动的影响(x+s)注：1.ap〈o.05,表示各组墨汁推进率与便秘模型对照组比较有显著性差异；2.bp<0.05,表示各组墨汁推进率转换值x与便秘模型对照组比较有显著性差异。2.3柑橘橘络提取物对小鼠排便时间、排便频率和排便量的影响由表4可见,便秘模型对照组的小鼠首便时间大于阴性对照组(p<0.01),而粪便的粒数小于阴性对照组(p<0.0d。各剂量组的首便时间比便秘模型对照组有所缩短，其中5倍、10倍剂量组与模型对照组相比差异有极显著性意义(p<0.01),20倍组与模型组相比差异有显著性意义(p<0.05)；各剂量组粪便粒数大于便秘模型对照组,其中5倍、10倍组与模型对照组差异有极显著性意义(p<0.01),20倍组与模型组相比差异有显著性意义(p〈0.05)；各剂量组粪便重量均大于便秘模型对照组，并有极显著性差异(p<0.01)。以上结果表明，三个剂量组受试样品能明显缩短便秘小鼠的首便时间，并增加其所排便数量及重量。注：与便秘模型对照组相比，*pv0.05,**pv0.01；ap<0.05,aap<0.01；#p<0.05,##p<0.01。实施例3柑橘橘络小分子果胶对肠道黏膜屏障功能的影响实验老鼠分组ac组是空白对照组,健康群体；aa组是模型对照组,菌群失调患者群体；tc组是阴性对照，健康群体正常饮食；ta组是菌群失调群体但给予正常饮食；tp组是菌群失调群体给予本发明柑橘橘络提取物中小分子果胶(杭州络通生物科技有限公司生产)治疗组；1、短链脂肪酸指标短链脂肪酸(scfa)对人体健康具有重要意义，能够影响结肠上皮细胞的转运，促进结肠细胞和小肠细胞的代谢、生长、分化，为肠粘膜上皮细胞及肌肉、肾、心、脑提供能量,增加肠道血供，影响肝纸质与碳水化合物的调控等。短链脂肪酸对于维持大肠的正常功能和结肠上皮细胞的形态和功能具有重要作用，短链脂肪酸还可促进钙的吸收。主要看tp组与ta组的差异，反应的是小分子果胶对于菌群失调患者的治疗作用。表5短链脂肪酸指标短链脂肪酸acaatctatp丙酸1.75±0.320.49±0.410.72±0.211.41±0.112.41土0.25*丁酸1.61±0.500.28±0.040.56±0.140.60±0.210.99土0.01*乙酸6.19±0.971.59±0.226.02±0.258.66±3.109.53±1.60异戊酿i1.30土0.63i0.27土0.21|。.54土0.36|0.70土0.23|0.69土0.05*pvo.05,tp组与ta组相比表5中tp组的丙酸、丁酸、乙酸明显高于ta组。本发明的本柑橘橘络小分子果胶具有较好的改善肠道黏膜屏障功能的作用，机制与增加连接蛋白表达和短链脂肪酸合成有关。2、血清中各项指标二胺氧化酶(dao)是人类和哺乳动物小肠粘膜上层绒毛中具有高度活性的细胞内酶，在组胺和多种多胺代谢中起作用，其活性与粘膜细胞的核酸和蛋白合成密切相关，能够反映肠道机械屏障的完整性和受损伤程度。白介素10ul-10)是一种多细胞源、多功能的细胞因子，调节细胞的生长与分化,参与炎性反应和免疫反应，是目前公认的炎症与免疫抑制因子。在肿瘤、感染、器官移植、造血系统及心血管系统中发挥重要作用,与血液、消化、尤其是心血管系统疾病密切相关。内毒素(lps)是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。脂多糖对宿主是有毒性的。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。表6血清中各项指标血清acaatctatpdao368.88±35.20454.35±76.99316.18±39.25437.63±71.74208.74±78.90*d-la124.71±35.80227.86±57.6997.25±16.59168.51±29.9097.72±33.78*il-1043.38±8.5460.66±8.6741.25±7.6050.64±8.7032.96±9.38*tnf-a394.16±49.95642.80±74.40485.74±88.32547.15±76.33318.89±62.17*ifn-r75.47±41.29140.29±27.52116.74±16.74103.37±8.8291.55±24.01lps52.54±36.3890.98±7.9768.39±8.8172.16±13.6822.90±8.20**pv0.05.tp组与ta组相比tp组的dao、d-la、lps明显低于ta组。表7血清炎性因子含量变化(pg/ml)tp组的il-10(白介素10).tnf-a(肿瘤坏死因子a)、ifn-r(干扰素-r)明显低于3、组织大肠中各项指标表8组织大肠中各项指标组织-大肠*pvo.05,tp组与ta组相比tp组的dao、d-la、lps明显低于ta组。实施例4柑橘橘络小分子果胶对肠道菌群的影响实验老鼠分组c：实验开始之前的粪便，ac：灌水7天后的对照粪便，aa：灌抗生素7天后的模型组粪便，tc：对照组14天之后的粪便，ta：模型组14天之后的粪便，tp：模型组灌橘络饮料14天后的粪便。试验方法如图1所示。实验结果如下：1、如图2所示，16s测序结果优化处理后共得到203个物种操作单元(otu),图2为以样本相似性对默认丰度最高30个otu信息的热图，tp组0tu21,0tu25,0tu8等的丰度高于ta组。2、门水平菌群结构变化如图3所示:小分子果胶可降低拟杆菌门、变形菌门的同时可提高厚壁菌门和防线菌门的数量(如表9所示)o表9phylumc贰tctatpbacteroidetes58.6466761.943330,09333372.3866782.2471,3proteobacteria4.67333318.5299.3633311.113334.8433334.423333firtnicutes29.4833313.976670.31.12.0666711.7366723.29333actinobacteria5.6566670：.0466670.0733331.7733330.3166670.823333verrucomicrobia1.0466674.970.0033330q.0733330.016667deferribacteres0.156667q02.650.7866670.026667unclassified0.3366670.540:000euryarchaeota000.156667000cyanobacteria0000.00666700.113333tenericutes0.003333000003、纲水平菌群结构变化如图4所示：小分子果胶抑制gama,beta变形菌纲的数量,提高球菌,丹毒丝菌,coriobacteria菌纲的数量。4、目水平菌群结构变化如图5所示:样品聚类结果表明小分子果胶组菌群结构与正常对照组菌群结构相似。可以提高乳酸杆菌、双歧杆菌,丹毒丝菌等目的数量，降低拟杆菌目的数量。5、科水平菌群结构变化如图6所示：小分子果胶可提高绿菌科、双岐菌科、乳酸菌科、脱硫菌科等有益菌的数量，降低脱铁杆菌、产碱杆菌科等的数量.6、属水平菌群结构变化如图7所示:小分子果胶可抑制e.coli、螺旋菌、真杆菌等,同时可提高无害梭菌、脱硫杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、罗伊氏菌、毛螺菌等的丰度。上图有统计学意义变化的五种菌属。当前第1页12