一类天然多酚功能化的抗氧化复合防晒剂及其制备方法

本发明涉及皮肤防护产品领域，特别涉及一类天然多酚功能化的抗氧化复合防晒剂及其制备方法。

背景技术：

太阳紫外线辐射根据波长分为三类，包括uva(400-315nm)、uvb(315-280nm)和uvc(280-100nm)。uvc通过臭氧-氧气循环完全减少和分散，剩余的uva和部分uvb到达地表。短期的uvb辐射对皮肤存在积极的因素，如胆钙化醇(维生素d)的合成，但高剂量的太阳紫外线(uv)是有害影响的，会造成包括红斑(晒伤)，皮肤过早老化和皮肤癌。为了抵消这些不利影响，使用含有活性紫外线过滤成分的防晒产品是一种常见的保护手段。这些产品可能包含无机和有机化合物的组合，通过吸收、散射和反射入射紫外线辐射的过程提供保护。

在防晒护肤品中，主要有效成分为化学防晒剂、物理防晒剂和天然防晒剂。大多数化学防晒剂都是芳香族化合物，如胡莫柳酯(hms)、阿伏苯宗(avb)、奥利克林(oct)，虽具有较好的紫外吸收效果，但其在光照下可会分解产生自由基，会产生副作用如刺激皮肤和体内富集，降低甲状腺素水平，甚至致癌，存在较大潜在风险。海登等研究发现，在人体中，2％的二苯甲酮-3及其代谢物在局部使用后，会通过尿液排出，这表明小的有机分子会穿透皮肤进入循环系统。

因此，避免与这些小分子的化学防晒剂直接接触是非常有必要的。物理防晒剂二氧化钛纳米粒子和氧化锌纳米粒子在保护皮肤免受紫外线辐射方面一直被证明是效果出色的，被广泛应用于防晒霜中。但由于其在紫外线照射下会产生强氧化的自由基导致皮肤老化，并可能穿过受损皮肤在肝、肾中富集。近年来，基于天然抗氧化剂的防晒产品引起了广泛关注。天然防晒剂是指具有防晒效果的天然提取物活性成分，如胡萝卜素、黄酮化合物等，多具有多酚结构而具有较强的抗氧化活性，同时还对紫外线具有较强的吸收，从而达到抗衰老和修复皮肤的作用。然而，由于存储时易氧化而使得添加天然提取物活性成分的高端产品发展受到限制。目前，国外高端防晒品牌常用的保持活性成分稳定性和持久释放性能的技术主要是利用微胶囊、多孔聚合物等进行负载。而在国内，相关研究仍处于起步阶段，高端产品领域几乎完全被外国品牌占据。

技术实现要素：

针对现有防晒产品中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一类天然多酚功能化的抗氧化复合防晒剂及其制备方法，所制备的抗氧化复合防晒剂可以消除物理防晒剂的ros产生导致皮肤老化和化学防晒剂的体内富集风险，并具有抗氧化和增强的防晒效果，有利于天然提取物活性成分的活性保持和缓释。

为了达到上述目的，本发明的技术方案为：

一类天然多酚功能化的抗氧化复合防晒剂，包括天然多酚功能化聚磷腈壳层；所述的天然多酚功能化聚磷腈壳层中的天然多酚包括白藜芦醇、柚皮素、姜黄素egcg中的一种，含有至少两个酚羟基；所述的聚磷腈为基于六氯环三磷腈和天然多酚类化合物共聚制备的交联聚磷腈；

所述的天然多酚功能化聚磷腈壳层在防晒剂中是厚度可控的壳层，或者是单独的纳米粒子。

基于上述所述的一类天然多酚功能化的抗氧化复合防晒剂，还包含内核，内核是氧化锌或二氧化钛纳米粒子，所述氧化锌或二氧化钛纳米粒子为商业化防晒剂用氧化锌或二氧化钛纳米粒子。

基于上述一类天然多酚功能化的抗氧化复合防晒剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)、将六氯环三磷腈hccp和天然多酚类化合物，置于圆底烧瓶中，超声下分散于有机溶剂中得到分散液；

步骤(2)、超声下在分散液中加入有机碱；

步骤(3)、适宜温度条件下超声反应一定时间；

步骤(4)、对反应后混合液离心分离固体产物，然后分别用无水乙醇和去离子水洗涤，在一定温度下真空干燥，得到产物为白色粉末。

所述的步骤(1)中天然多酚类化合物为白藜芦醇、柚皮素、姜黄素、egcg中的一种。

所述的步骤(1)中六氯环三磷腈hccp与天然多酚类化合物构成壳层材料，其投料摩尔比为1:5～5:1。

所述的步骤(1)中有机溶剂为有为乙腈、四氢呋喃、丙酮中的一种，每100mg六氯环三磷腈hccp加入50-200ml有机溶剂。

所述的步骤(1)中还加入二氧化钛或者氧化锌纳米粒子，二氧化钛tio2或氧化锌zno为核心材料，核心材料与壳层材料投料质量比为1:4～4:1；

所述的步骤(2)有机碱为三乙胺，用量为步骤(1)中有机溶剂体积用量的1:200-1:20

所述步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)中的超声功率均为50-800w。

所述步骤(3)的反应温度为20℃～80℃，反应时间为0.1～6h。

所述步骤(4)离心转速为10000rpm，真空干燥温度为40-60℃。

本发明优点效果：

本发明通过一锅法制备了兼具抗氧化性和防晒性能的天然多酚功能化的抗氧化复合防晒剂。通过选择不同的酚类化合物，可以得到功能化的复合防晒剂，经验证的有白藜芦醇和柚皮素两种，因其环状结构都能在uvb区域有一定的化学吸收，其自框架结构对uva区域能起到很好的反射作用，因而有强大的防晒性能；同时，抗氧化性能优异，在包覆二氧化钛或者氧化锌之后，在原有物理防晒剂优异防晒性能基础上，通过引入不同的多酚可以获得强度不同的抗氧化能力，且抗氧化能力与浓度呈正相关，得到的纳米粒子具有不同于小分子抗氧化剂的长效缓释的自由基清除能力，可在八小时内仍保持较高的自由基清除活性，对于皮肤而言作用更舒缓，更长效；此外，多酚型聚磷腈微球作为防晒剂有更高的安全性，其生物相容性较高且原材料无毒(hccp)或产自于纯天然的成分(res)，相较于传统有机防晒剂而言，其自框架结构使其阻隔于皮肤表层，而不会经皮肤渗透，同时聚磷腈的壳层机构也使得皮肤与光催化剂二氧化钛及氧化锌隔离开来，避免因其光催化产生的ros对人体带来的潜在危害，是一种安全高效的抗氧化防晒剂。

附图说明

图1中的(a-c)为实施例1和2制得的产物ppz-tio2,ppz-zno,ppz-res的扫描电镜图，(d-f)透射电镜图，(g-i)动态光散射水合半径分布图；

图2中的(a)为实施例1所合成相关的单体及聚合物纳米粒子的ir图，(b)为xrd图，(c-d)乙醇溶液中的uv吸收谱图。

图3为实施例1的所合成材料的细胞存活率测试结果，图3中的(a)为l929细胞在(20-80μg·ml-1)ppz-tio2,ppz-res,ppz-zno孵育8h后的存活率对比，(b)-(d)分别为ppz-tio2,ppz-res,ppz-zno孵育1h，2h，4h，8h时的细胞存活率。

图4为实施例1所得纳米粒子的紫外线过滤器的皮肤穿透性评估结果，其中图4中的(a)-(c)分别为荧光素fl，fl-ppz-tio2，fl-ppz-zno孵育6h后皮肤组织切片；(d)为(a)(b)(c)荧光强度对应的箱线图；(e)为荧光素fl，fl-ppz-tio2，fl-ppz-zno三种溶液荧光强度相当时的荧光谱图。

图5为实施例1所得产物ppz-res粒子和实施例2所得产物ppz-tio2粒子、ppz-zno粒子紫外区表现评价，其中图5中的(a)为三种纳米粒子紫外区化学吸收部分表征；(b)为三种纳米粒子紫外区全反射部分表征；(c)为连续照射8h时三种纳米粒子及某商用防晒霜br的稳定性表征。

图6为实施例1所得纳米粒子体外抗紫外线性能评价，其中图6中的(a)为体外抗紫外测试示意图；(b)为无保护状态和不同保护条件下细胞存活率表征；(c)-(i)为倒置荧光显微镜显微镜拍摄的不同保护条件下的活死细胞图片(白色圈内的为红色细胞，即死细胞)。

图7为实施例1所得纳米粒子作用下大剂量紫外线照射前后接受不同局部干预的小鼠背侧皮肤切片的组织学图片，其中图7中的(a)为体表抗紫外实验示意图；(b)-(l)为涂覆不同纳米粒子后照射太阳光后制备的组织学图片；(m)(n)为与(b)-(l)对应的表皮增厚情况统计。

图8为实施例1、2合成产物ppz-res、ppz-tio2和ppz-zno颗粒清除1,1-二苯基-2-苦肼基dpph自由基的活性测试结果，其中图8中的(a)为加入res、ppz-res、ppz-tio2以及ppz-zno(浓度均为2mg·ml-1)0h时的1,1-二苯基-2-苦肼基dpph乙醇溶液图片；(b)为室温避光条件下将(a)中溶液保存8h后的图片；(c)为不同浓度ppz-res的dpph自由基清除实验表征；(d)为ppz-tio2和ppz-zno的dpph自由基清除实验表征。

图9中的(a)为实施例3合成产物ppz-nar纳米粒子的透射电镜，(b)为扫描电镜，(c)为红外光谱测试。

图10中的(a)为实施例3合成产物ppz-nar纳米粒子在乙醇稀溶液中的紫外吸收谱图，(b)为固体紫外的化学吸收曲线，(c)为全反射曲线。

图11为本发明抗氧化复合防晒剂的核壳结构示意图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。本发明中未详细说明的工作原理属于现有技术和本领域的公知常识，本技术领域的技术人员应当知晓。

一类天然多酚功能化的抗氧化复合防晒剂，具有图11所示核壳结构，其特征在于，包括天然多酚功能化聚磷腈壳层和氧化锌或二氧化钛纳米粒子内核；如图11中所示，ⅰ中，r为白藜芦醇、柚皮素、姜黄素egcg中的一种，含有至少两个酚羟基；ⅱ所述氧化锌或二氧化钛纳米粒子为商业化防晒剂用氧化锌或二氧化钛纳米粒子。

所述聚磷腈为基于六氯环三磷腈和天然多酚类化合物共聚制备的交联聚磷腈。

所述天然多酚功能化聚磷腈壳层在所述抗氧化复合防晒剂中厚度可控，也可单独成纳米粒子。

所述天然多酚功能化的抗氧化复合防晒剂的粒径为100-1200nm。

所述的一类天然多酚功能化的抗氧化复合防晒剂，可以加二氧化钛或者氧化锌作为内核，也可无内核自行聚合成纳米粒子。

基于上述的抗氧化复合防晒剂的制备方法参照下面实施例。

实施例一

采用一锅沉淀聚合法制备六氯环三磷腈与白藜芦醇交联产物(ppz-res)，无内核，步骤如下：

(1)将六氯环三磷腈hccp90.0mg，白藜芦醇res为118.2mg置于250ml圆底烧瓶中，100w超声下分散于100ml乙腈得到分散液；

(2)100w超声下在分散液中加入2ml三乙胺(tea)；

(3)将烧瓶置于100w超声反应30min，反应温度为20℃；

(4)反应完成后，用离心分离固体产物，然后分别用无水乙醇和去离子水洗涤3次。最后，冷冻干燥48h，得到ppz-res为白色粉末。

实施例二

制备添加tio2具有内核的六氯环三磷腈与白藜芦醇交联产物产物ppz-tio2、ppz-zno，两者方法相似，以ppz-tio2为例，包括以下步骤：

(1)将六氯环三磷腈hccp129.6mg，白藜芦醇res为170.4mg、tio2200mg置于250ml圆底烧瓶中，400w超声下分散于100ml乙腈得到分散液；

(2)400w超声下在分散液中加入5ml三乙胺(tea)；

(3)将烧瓶置于400w超声反应6h，反应温度为80℃；

(4)反应完成后，用离心分离固体产物，然后分别用无水乙醇和去离子水洗涤3次。最后，冷冻干燥48h，得到ppz-tio2为白色粉末。

如图1所示分别为(a)ppz-res,(b)ppz-tio2,(c)ppz-zno的扫描电镜图片，透射电镜及对应的元素分布如(d)ppz-res,(e)ppz-tio2,(f)ppz-zno所示。用动态光散射光法测图谱，(g)ppz-res水化直径约为613nm,pdi约为0.038，zeta电位值为-23.5mv，(h)ppz-tio2水化直径约为479.4nm,pdi约为0.375，zeta电位值为-27.4mv，(i)ppz-zno水化直径约,258.2nm,pdi约为0.053，zeta电位值为-27mv，说明所制备的纳米粒子具有较好的分散稳定性。

图2的(a)通过傅里叶变换红外光谱(ftir)验证了p-cl与o-h的共价键的结合，证明了ppz-res,ppz-tio2和ppz-zno的生成。表现为反应后res在3300cm^-1的特征峰消失，而1160cm^-1处是磷腈环上的p＝n特征峰也证明了hccp与res的聚合。图2的(b)xrd谱图可以看出，各峰型保持极好。且在25左右的特征峰证明了ppz-res在tio2与zno表面的成功包覆。如图3(c)(d)分别对各单体以及缩聚反应后的交联产物进行紫外分光光度计的测试，res在320nm左右有很强的吸收峰，反应后吸收峰红移，产物在350nm左右出现吸收峰，说明了反应的成功进行。

细胞毒性采用细胞计数试剂盒-8(cellcountingkit-8,cck-8)对ppz-res，ppz-tio2和ppz-zno的生物相容性进行了定量评价。将l929细胞接种于96孔平板培养板。孵育一夜后与100μlppz-res，ppz-tio2和ppz-zno(20μg·ml^-1，40μg·ml^-1，60μg·ml^-1,和80μ·ml^-1)培养基在37℃1h,2h,分别4h和8h。100mlcck-8溶液代替原培养基。孵育4小时后，在450nm处测定吸光度。以同一时间间隔培养的正常l929细胞作为对照。如图3所示(a)为l929细胞在浓度为20-80μg·ml^-1的ppz-tio2,ppz-zno和ppz-res三种聚磷腈防晒纳米粒子的培养液中孵育8h所得到的结果，可以看出各纳米粒子随浓度增大细胞毒性少有增大，但整体保持较高存活率，达80％以上，其毒性来源于res分子以及zno纳米颗粒本身的毒性。(b)(c)(d)分别ppz-tio2,ppz-zno和ppz-res与l929细胞在浓度为20-80μg·ml^-1培养液中孵育1h，2h，4h，8h所得到的结果，进一步说明其微弱毒性随时间的增长稍有增大，但整体毒性不强，安全性高。

以10％的重量浓度分散在乙醇中，荧光素fl也溶解在乙醇中，并调整其荧光强度以匹配荧光素交联后的聚磷腈多酚型防晒纳米粒子(fl-ppz-res，fl-ppz-zno)溶液。3种溶液局部应用于裸鼠背侧皮肤。孵育6小时后，每个皮肤样本用乙醇和水局部清洗3次，每次5分钟并干燥。切除背部皮肤，准备组织学检查。样品在4％多聚甲醛中固定24h后，石蜡包埋，切成4μm的切片。组织切片在倒置荧光显微镜下拍得图片如图4所示。在六小时的孵育后，(a)涂覆fl小分子溶液的皮肤产生较强荧光，说明fl渗透进入了裸鼠皮肤组织，而涂覆fl-ppz-tio2(与ppz-res尺寸相当，选用同一种荧光颗粒进行实验)溶液(b)和fl-ppz-zno溶液(c)的裸鼠皮肤外表面有些许荧光，内部无明显荧光，说明皮肤将以上两种纳米粒子阻隔在外，未经表皮进入皮肤，通过(d)箱线图也可以说明，涂覆fl的荧光强度超过10％，而涂覆其余两种纳米颗粒分散液的荧光强度不超过2％；(e)为三种荧光强度相当的溶液荧光谱图。通过皮肤渗透性实验证明ppz-res，ppz-tio2与ppz-zno三种纳米粒子不会经表皮渗透皮肤,说明了聚磷腈纳米防晒颗粒具有很高的安全性。

通过紫外积分球进行了测定和分析，ppz-res分散于乙醇(10％wt％)中。悬浮液滴投在干净的石英载玻片(r＝1cm)上，以确保2.0mg·cm^-2的覆盖。干燥后，相同大小的第二石英载片放置在样品上面以保护它。在装有积分球的perkin-elmerlambda750紫外/可见分光光度计上获得片剂的紫外-可见吸收光谱(图5(a)(b)),同样方法制得ppz-tio2和ppz-zno片剂。

如图5所示，(a)为ppz-tio2,ppz-zno和ppz-res纳米颗粒在紫外区的化学吸收部分，而(b)则体现了以上三种聚磷腈防晒纳米粒子的反射效率。(c)为将ppz-tio2,ppz-zno和ppz-res纳米颗粒以及某款商用防晒霜涂覆在石英片上(均为1mg·cm^-2)，日光灯3mw·cm^-2连续照射8h所测得的稳定性折线图，可以看出，在连续长时间高强度的日照条件下，所制备的聚磷腈防晒纳米粒子具有很高的不输于商用防晒霜的防晒活性，可为皮肤提供长效的抗紫外保护。

对聚磷腈防晒纳米粒子进行了体外的抗紫外测试，如图6(a)示意图所示，正常细胞覆盖锡纸进行遮光保护，对照组只覆盖干净石英片，将一定量纳米粒子的乙醇分散液分别涂覆在2cm*2cm的石英片上，确保覆盖0.5mg·cm^-2，将其分别覆盖在培养l929细胞的96孔板上，在uvb光源下400μw·cm^-2照射30min，恒温培养箱培育24h，得到其细胞存活率如图6(b)所示，相比于未经保护而照射紫外线的细胞，经聚磷腈防晒纳米颗粒保护的细胞存活率与正常未经紫外线照射的细胞存活率相当。同时，重复以上操作后对细胞进行am/pi染色，通过倒置荧光显微镜得到如(c)-(i)的活死细胞图片，红色细胞为死细胞(白圈圈出)，绿色细胞为活细胞(白圈外其他细胞)可以直观的看出聚磷腈防晒纳米粒子对细胞的保护作用。

为进一步验证聚磷腈防晒纳米粒子的防晒效果进行了动物实验，将裸鼠背部皮肤划分6个象限如图7(a)，对正常皮肤进行遮挡，其他象限分别均匀涂覆含有不同聚磷腈防晒纳米粒子的(10％wt)分散液，在紫外线照射后对正常小鼠背侧皮肤进行苏木精伊红(h&e)染色，总紫外线剂量为4320j·m^-2。裸鼠表皮组织切片图片如图7(b)-(i)所示，(m)(n)分别为ppz-tio2及ppz-zno体系在保护下裸鼠表皮的相对增厚情况，ppz-tio2及ppz-zno在长时间紫外照射下为皮肤提供了长效的防护，表皮厚度较未进行紫外照射的正常皮肤略有增厚，提供了很大程度上的防护效果，说明了聚磷腈防晒纳米颗粒优异的防晒性能。

为验证所制备的聚磷腈防晒纳米颗粒具有抗氧化性，如图8(a)所示准备了纯1,1-二苯基-2-苦肼基(dpph)溶液作为对照组，其他组分别加入res，ppz-res,ppz-tio2以及ppz-zno纳米颗粒，质量浓度均为(2mg·ml^-1)，在加入res小分子后，dpph溶液迅速褪色，说明res的确具有很强的自由基清除能力，其他试管内瞬间的作tio2用不明显；室温避光条件下保存8h后，如(b)所示可以看出经过8h的作用，有ppz-res，ppz-tio2以及ppz-zno纳米颗粒的试管颜色也变浅至褪色，而单纯dpph自由基的试管仍然呈现紫色，这初步验证了所合成的聚磷腈防晒纳米粒子具有抗氧化性，并且可以起到长效的温和抗氧化作用。为进一步对其抗氧化性效果进行验证，采用0.2-2mg·ml^-1的ppz-res进行验证，如(c)所示，ppz-res的抗氧化性能呈现明显的浓度依赖性，随浓度的增大，抗氧化性逐渐增强。浓度在2mg·ml^-1时8h内可达到很好的自由基清除效果，(d)是选取与2mg·ml^-1ppz-res含量相当的ppz-tio2以及ppz-zno进行了dpph自由基清除测试，可以看出这两种纳米粒子的抗氧化效果得到了很好的保持。

实施例三

本实施例合成了六氯环三磷腈与柚皮素制备聚磷腈防晒剂。制备六氯环三磷腈与柚皮素交联产物ppz-nar方法与ppz-res相似，包括以下步骤：

(1)将六氯环三磷腈hccp90.0mg，柚皮素nar为140.96mg、置于250ml圆底烧瓶中，超声下分散于50ml乙腈得到分散液；

(2)超声下在分散液中加入0.5ml三乙胺(tea)；

(3)将烧瓶置于100w超声反应0.1h，反应温度为25℃；

(4)反应完成后，用离心分离固体产物，然后分别用无水乙醇和去离子水洗涤3次。最后，冷冻干燥48h，得到ppz-nar为黄色粉末。

通过透射电镜以及扫描电镜可以看出，ppz-nar的粒径可达800nm，如图9(a)、(b)、(c)，fiir谱图1160cm^-1处是磷腈环上的p＝n特征峰也证明了hccp与nar的聚合。在乙醇稀溶液中测定了nar小分子与ppz-nar纳米粒子的紫外吸收如图10(a)，可以看出交联后产物吸收峰发生了红移。通过紫外积分球进行了测定和分析，ppz-nar分散于乙醇(10％wt％)中。悬浮液滴投在干净的石英载玻片(r＝1cm)上，以确保2.0mg·cm^-2的覆盖。干燥后，相同大小的第二石英载片放置在样品上面以保护它。在装有积分球的perkin-elmerlambda750紫外/可见分光光度计上获得片剂的紫外-可见吸收光谱(图10(b)(c))，(b)为ppz-bar纳米颗粒在紫外区的化学吸收部分，在350nm之前有很强的化学吸收，而(c)则体现了以上聚磷腈防晒纳米粒子的反射效率。