用于人肿瘤的溶瘤脊髓灰质炎病毒

本申请为申请号201380070749.7，申请日为2013年11月21日，发明名称为“用于人肿瘤的溶瘤脊髓灰质炎病毒”的中国申请的分案申请。

本发明是利用由美国政府提供的资金完成的。根据国立卫生研究院的资助条款r01ca87537、p50ns20023、r01ca124756和r01ca140510，美国政府享有一定的权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年11月21日提交的、标题为“用于人肿瘤的溶瘤脊髓灰质炎病毒”的美国临时专利申请序列号no.61/729,021的优先权，其全部内容援引加入本申请。

发明的技术领域

本发明涉及抗肿瘤治疗领域。具体地，其涉及溶瘤病毒抗肿瘤治疗。

发明背景

pvs-ripo是一种溶瘤脊髓灰质炎病毒(pv)重组体。其由减活1型(萨宾)pv疫苗组成，所述疫苗含有人鼻病毒2型(hrv2)的外源内部核糖体进入位点(ires)。ires是位于pv基因组5’非翻译区内的、介导病毒的、不依赖m7g-帽翻译的顺式作用遗传因子。

pvs-ripo溶瘤治疗已经在组织培养试验(6、7、10、15-17)和动物肿瘤模型中被报道，但并未在人临床试验中报道。由于组织培养、动物模型和人之间的差异，疗效是不可预测的。而且，用于临床前研究的病毒制剂通常是不纯的，所以任何活性在调查中都不能归因于药剂。

本领域没有提供这样的溶瘤病毒药剂的实例：其中肿瘤模型中的生物活性正确预测了患者中的疗效。此原因是，溶瘤病毒治疗是在(a)感染的恶性细胞、(b)非恶性肿瘤微环境和(c)宿主免疫系统之间的复杂三角关系的结果。这种错综复杂的系统还没有在任何动物模型中重现。

在本领域中不断需要鉴定和开发对于人有效的抗癌治疗，尤其是对脑肿瘤患者。

发明概述

根据本发明的一个方面，提供了一种治疗携带实体肿瘤的人的方法，所述实体肿瘤表达necl5(cd155、hved、necl-5、pvs、tage4；柄蛋白(nectin)样5；柄蛋白样蛋白5)。将嵌合脊髓灰质炎病毒构建体直接施用至人体内肿瘤。该嵌合脊髓灰质炎病毒包括带有在所述脊髓灰质炎病毒的三叶草和所述脊髓灰质炎病毒的开放阅读框之间的所述脊髓灰质炎病毒5’非翻译区中的人鼻病毒2(hrv2)内部核糖体进入位点(ires)的脊髓灰质炎病毒的萨宾i型菌株。

这些及其它的实施方式——在阅读本说明书之后将对本领域技术人员显而易见——向本领域提供了治疗肿瘤的方法，包括脑肿瘤。

附图简述

图1a-1b(原图8)。瘤内pvs-ripo输注诱导肿瘤逐步退化。图1a.根据模拟(□)或pvs-ripo(■)治疗的肿瘤体积。图1b.在所示间期下从肿瘤中回收的平均病毒。

图2(原图12)。来自2012年4月16日的mri。显示疾病进展的轴位增强t1加权mri。

图3(原图13)。来自2012年5月9日的mri。输注pvs-ripo前获得的轴位增强t1加权mri。

图4(原图14)。来自2012年5月11日的mri。显示脑内gd-dtpa对比剂和可推测地pvs-ripo分布的轴位增强t1加权mri。

图5(原图15)。来自2012年6月6日的mri。显示疾病稳定性的轴位增强t1加权mri。

图6(原图16)。来自2012年7月9日的mri。揭示对疾病进展关注的轴位增强t1加权mri。

图7(原图17)。来自2012年7月11日的18-fdgpet扫描。结果提示了在mri所关注的区域没有代谢亢进活性。

发明详述

发明人已经开发了用于人的病毒构建体。先前，病毒构建体的实验室级制剂已经在细胞培养和动物模型中进行测试。但这些测试不足以把任何效果都归因于除粗制实验室级制剂中的其它成分外的病毒构建体本身。而且，正如本领域所熟知，细胞培养和动物模型并不能预测人体内的疗效。

由于脊髓灰质炎病毒是一种潜在的病原，所以必须采取额外的预防措施以确保致病因子不被引入到受试者。利用良好的制造工序和纯化，制成足够纯的制剂以准许在试验中引入人中。

可以使用直接将制剂施用至肿瘤的任何技术。直接施用不依赖于动脉血管系统而进入肿瘤。可以将制剂涂在肿瘤的表面、注射到肿瘤内、在手术过程中灌输到肿瘤部位内/处、通过导管输注到肿瘤内等。可以使用的一个具体技术是对流增强输送。

任何人肿瘤都可以得到治疗，包括儿童肿瘤和成人肿瘤。肿瘤可以在任何器官内，例如，脑、前列腺、乳房、肺、结肠和直肠，各种类型的肿瘤都可以得到治疗，包括，例如，成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、癌、腺癌等。其它肿瘤的实例包括肾上腺皮质癌、肛门癌、阑尾癌、i级(间变性)星细胞瘤、ii级星细胞瘤、iii级星细胞瘤、iv级星细胞瘤、中枢神经系统的非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、膀胱癌、乳腺肉瘤、支气管癌、支气管肺泡癌、宫颈癌、颅咽管瘤、子宫内膜癌、子宫内膜子宫癌、成室管膜母细胞瘤、室管膜细胞瘤、食管癌、鼻腔嗅神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、纤维组织细胞瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤、头颈癌、肝细胞癌、肝门部胆管癌、咽下癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞瘤、卡波西肉瘤、朗格汉斯组织细胞增生症、大细胞未分化肺癌、喉癌、唇癌、肺腺癌、恶性纤维组织细胞瘤、髓质上皮瘤、黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、内分泌瘤形成、鼻腔癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢透明细胞癌、上皮性卵巢癌、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、乳头状瘤病、鼻窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、松果体实质肿瘤、松果体母细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、肾细胞癌、15号染色体变化的呼吸道癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状非小细胞肺癌、鳞状颈部癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂癌、尿道癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌和肾母细胞瘤。

任选地，根据necl5表达可将患者进行分组。例如可以在rna或蛋白水平下利用探针、引物或抗体对其进行测定。necl5表达可指导用本发明的嵌合脊髓灰质炎病毒治疗或者不治疗的决策。necl5表达还可用于指导治疗的进攻性(aggressiveness)，包括治疗的剂量、频率和持续时间。

治疗方案可包括——除嵌合脊髓灰质炎病毒构建体的递送之外——肿瘤的手术切除、肿瘤的手术减小、化学治疗、生物治疗、放射治疗。这些形式是多种疾病状态中的标准治疗(standardofcare)，并且患者不必被拒绝该标准治疗。可以在标准治疗之前、期间或之后施用嵌合脊髓灰质炎病毒。可以在标准治疗失败之后施用嵌合脊髓灰质炎病毒。

申请人已发现，嵌合脊髓灰质炎病毒的临床药物制剂具有极好的遗传稳定性和同质性。这是特别有利的，因为已知脊髓灰质炎病毒在培养物和天然生物储蓄泡(reservoirs)中是高度易变的。可以使用用于遗传稳定性和同质性的任何合适的分析。用于稳定性的一种分析涉及对在39.5摄氏度下无生长能力进行测试。另一种分析涉及集群测序(bulksequencing)。还有另一个分析涉及对灵长类神经毒力进行测试。

尽管申请人不希望被任何特定的作用机理所限制，但相信多种机理可有助于其疗效。这些包括癌细胞的裂解、免疫细胞的募集和对癌细胞的特异性。此外，病毒是神经减活的。

上述公开内容对本发明进行了总体描述。本文公开的所有参考文献都通过引用明确并入。更加全面的理解可以通过参考以下具体实施例而获得，在此提供的实施例仅用于说明的目的，而并不意在限制本发明的范围。

实施例1

动物肿瘤模型。pvs-ripo的ind指导的疗效试验是在无胸腺小鼠的htb-15gbm异种移植模型中进行的。pvs-ripo(大多来自临床)以‘针对小鼠调整过的(mouse-adjusted)’、fda批准的最大起始剂量[为小鼠中减少的肿瘤大小将fda批准的最大起始剂量(10e8tcid)调整到(6.7×10e6tcid)]施用。输送模拟预期的临床路径，即，缓慢的瘤内输注。在这些条件下，15天后pvs-ripo诱导所有动物中的完全肿瘤退化(图8a)。尽管到第10天病毒从所治疗的肿瘤中回收，但水平最多是适中的，这表明直接病毒性肿瘤细胞杀伤单独并不能说明治疗效果(图8b)。

来自动物肿瘤模型的证据表明，pvs-ripo的瘤内接种引起直接病毒诱导的肿瘤细胞杀伤并引发针对感染/杀伤的肿瘤的强有力的宿主免疫反应(3、7、10)。对病毒输注的反应特征在于强烈的局部炎症反应，导致肿瘤的免疫浸润(immuneinfiltration)。最终对pvs-ripo输注的缓慢组织反应导致肿瘤块的死亡和其疤痕取代。

实施例2

临床试验。ind第14,735号‘pvsripo针对复发性成胶质细胞瘤的剂量发现和安全性研究(dose-findingandsafetystudyofpvsripoagainstrecurrentglioblastoma)’在2011年6月19日被fda批准并在2011年10月27日被irb批准。复发性成胶质细胞瘤(gbm)患者的i/ii期临床试验(nct01491893)目前正在招募患者。

至今为止已经有两名人受试者按irb批准的方案使用pvs-ripo进行治疗。来自第一名受试者的初步发现将在实施例3中进行描述。

实施例3

第一名受试者的初步发现。患者是一名21岁女护士生，其被确诊有右额gbm(whoiv级)。在20岁，2011年6月她被首次确诊，伴有严重头疼和对于疑似鼻窦感染的不成功治疗的病史。脑成像在2011年6月17日获得并显示出大的右额团块，大小5×6cm。2011年6月22日她接受了右额团块次全切除术，病理学确认为gbm(whoiv级)。考虑到患者的年龄、她良好的身体状况以及次全肿瘤切除术，决定将六周的放射治疗同时与每日口服75mg/m2替莫唑胺化学治疗和贝伐单抗每两周施用一次的结合对她进行积极治疗。2011年9月11日患者完成了六周的治疗。2011年10月03日，患者除了每两周一次10mg/kg的贝伐单抗外每月开始辅助治疗，五天替莫唑胺化学治疗。

2012年4月16日，患者在经历了在她睡觉时发生的第一次全面癫痫发作之后来到了诊所。那时，她已经完成了六个月的替莫唑胺与贝伐珠单抗的结合。她将癫痫发作归因于在学校增加的压力，因为她正在完成成为儿科肿瘤护士的学位，尽管她确诊为gbm和正在进行化学治疗。在那天得到的脑部mri显示出肿瘤复发，并有沿切除腔内侧的新的结节状增强(图12)。

给患者提供了多种治疗选择，但还是选择继续进行pvs-ripo临床试验。在她第一次全面癫痫发作之后，她开始服用开普兰(keppra)，但有时忘记服用，正因为如此和已知的肿瘤复发，在2012年5月06日患者在她睡觉时经历了第二次全面癫痫发作。她重回到了她的基本神经状况，并开始按协议进行登记。

在2012年5月11日患者通过预期的临床输送方法(在6小时内含有对比剂gd-dtpa的病毒悬浮液3ml的对流增强的瘤内输注，参见实施例4)接受用fda批准的最大量起始剂量(10e8)进行输注pvs-ripo并且没有经历神经学合并症或于此相关的其它并发症之前，在2012年5月9日得到后续mri(图13)。

在完成输注后立即获得的mri证明了输注物的分布(图14)。

我们的研究小组每周随访患者，并且在输注后两周在诊所见到患者，这时她没有任何新的神经病学症状、癫痫复发、疲劳、呼吸急促或虚弱。2012年6月7日在诊所再次对她进行评估，她的身体和神经状况保持正常。在那次就诊时得到的脑部mri显示了疾病的稳定性(图15)。

2012年7月9日在诊所见到患者。再一次，她没有任何新的神经病学症状，包括自pvs-ripo输注前2012年5月6日所观察到的癫痫发作之后没有任何复发癫痫活动。她还报告说她的心情很好，因为她对在护理学校的进步很满意，感觉自她输注后她能够更好地关注于学校。她也为搬来两个室友和她能够经常锻炼的事实而兴奋。在那天得到的她的脑mri显示了关系到疾病进展的轻微增加的团块效果和上线性增强(superiorlinearenhancement)的最小增加(图16)。

考虑到无临床恶化的令人不安的放射影像学改变，我们决定获得18-fdgpet扫描。18-fdgpet扫描显示出mri上关注区域的代谢减退活性，表明坏死过程(治疗反应效果；图17)。来自7月9日的pet扫描表明没有可存活肿瘤。在与患者和她妈妈讨论后，决定继续从临床和放射影像学角度密切注意患者。

在8月27日和10月22日的检查中，患者没有任何新的神经病学症状，包括自2012年5月6日(pvs-ripo输注之前)癫痫发作以来没有任何癫痫发作活动。患者报告了改善的认知/记忆功能、运动功能(锻炼)。自10月26日起，患者在神经病学方面是正常的。

由于在8月27日有利的放射影像学呈现，没有安排pet扫描。在10月22日对患者进行再次扫描，并且存在可量化的放射影像学反应。mri/pet重叠表明没有来自肿瘤复发一般区域的信号

实施例4

对流输注。利用从术前mri中所获得的信息，使用术前brainlabiplanflow系统基于预测的分布对导管轨迹进行设计。

本发明使用1mm的钆，连同替代示踪物124i-标记的人血清白蛋白一起，确定脊髓灰质炎病毒的分布。这也可用于其它药物输注。钆和放射标记的白蛋白与药物一起输注，并且多种mri序列和pet成像被用于定量分布。

要输送的药剂的整个体积将由临床药师预先装载到注射器中并就在开始输注之前，在手术室或nicu中的无菌条件下连接至导管。由于安排所有用于输注的必要组成的复杂性(手术室时间、药房时间和放射学预约)，已将+1天窗口建立在研究药物输注的研究中。这意味着，在活体组织检查/导管放置后的第二天开始允许输注。对于后续事件的协议和时间安排，这仍将被认为是“第0天”。在病毒输注时，包括肾上腺素和苯海拉明的紧急药物将是可供使用的，并且神经学状况、氧饱和度和心率将被监测。药物输注将在神经外科重症监护室(nscu)中进行，以便所有其它的紧急设备都将是可供使用的。从诱发麻醉用于导管布置开始，用预防性抗生素，如萘夫西林、第二代头孢菌素或万古霉素，对患者进行治疗。

根据我们自己的经验、先前发表的报告(19)以及利用相似输注技术的irb和fda批准的试验(irb#4774-03-4r0)，将以500l/hr的速度对患者进行输注。将medfusion3500输注泵预编程为500l/hr的输送速率。在最初开始时将药剂(其为10ml总体积，以占输注系统中3.3723ml的‘无效空间’)在20ml注射器中装载进注射器泵中，以避免输注中的任何中断。输送至患者的接种物的总量为3ml。导管本身(30cm长、1mm内径)不能预装有病毒悬浮液。因此，输注的最初～250μl将是留置导管‘无效空间’中的不含防腐剂的生理盐水。基于此，输注泵将被预编程用于输送3.250ml。使用medfusion3500(medex,inc.,duluth,ga)注射器输注泵进行输注。病毒注射过程将在6.5小时内完成。在输送pvsripo后立即将导管移除。

输注导管(pic030)和输注管(pit400)将由sophysa公司(crownpoint,in)提供。输注导管套件是具有1cm标记达20cm的30cm透明开放式导管(1.0mmid/2.0mmod)。该导管带有30cm不锈钢探针、有倒钩的带帽凹形路厄氏锁和不锈钢套管针。输注管套件由带有空气过滤器的3通活塞连接器、带有防虹吸阀的4m微内径管、红色通风帽和白色路厄氏锁帽组成。该导管产品被无菌、无热原包装并且仅供单次(一次)使用。使用medfusion3500(medex,inc.duluth,ga)注射器输注泵进行输注。

参考文献

每个引用的参考文献的内容明确并入本文中。

1.castriconir,adaga,adondero,gzona,plpoliani,etal.2009.nkcellsrecognizeandkillhumanglioblastomacellswithstemcell-likeproperties.jimmunol182:3530-39.

2.debreynes,yyu,aunbehaun,tvpestova,cuhellen.2009.directfunctionalinteractionofinitiationfactoreif4gwithtype1internalribosomalentrysites.procnatlacadsciusa106:9197-202.

3.dobrikovaey,tbroadt,jpoiley-nelson,xyang,gsoman,etal.2008.recombinantoncolyticpolioviruseliminatesgliomainvivowithoutgeneticadaptationtoapathogenicphenotype.molther16:1865-72.

4.dobrikovaey,cgoetz,rwwalters,sklawson,jopeggins,etal.2012.attenuationofneurovirulence,biodistribution,andsheddingofapoliovirus:rhinoviruschimeraafterintrathalamicinoculationinmacacafascicularis.jvirol86:2750-9.

5.ericksonbm,nlthompson,dchixson.2006.tightlyregulatedinductionoftheadhesionmoleculenecl-5/cd155duringratliverregenerationandacuteliverinjury.hepatology43:325-34.

6.goetzc,edobrikova,mshveygert,mdobrikov,mgromeier.2011.oncolyticpoliovirusagainstmalignantglioma.futurevirol6:1045-58.

7.goetz,c,rgeverson,lzhang,mgromeier.2010.mapksignal-integratingkinasecontrolscap-independenttranslationandcelltype-specificcytotoxicityofanoncolyticpoliovirus.molther18:1937-46.

8.gromeierm,lalexander,ewimmer.1996.internalribosomalentrysitesubstitutioneliminatesneurovirulenceinintergenericpoliovirusrecombinants.procnatlacadsciusa93:2370-5.

9.gromeierm,bbossert,marita,anomoto,ewimmer.1999.dualstemloopswithinthepoliovirusinternalribosomalentrysitecontrolneurovirulence.jvirol73:958-64.

10.gromeierm,slachmann,mrrosenfeld,phgutin,ewimmer.2000.intergenericpoliovirusrecombinantsforthetreatmentofmalignantglioma.procnatlacadsciusa97:6803-8.

11.gromeierm,dsolecki,ddpatel,ewimmer.2000.expressionofthehumanpoliovirusreceptor/cd155geneduringdevelopmentofthecentralnervoussystem:implicationsforthepathogenesisofpoliomyelitis.virology273:248-57.

12.iwasakia,rwelker,smueller,mlinehan,anomoto,etal.2002.immunofluorescenceanalysisofpoliovirusreceptorexpressioninpeyer'spatchesofhumans,primates,andcd155transgenicmice:implicationsforpoliovirusinfection.jinfectdis186:585-92.

13.joshis,skaur,ajredig,kgoldsborough,kdavid,etal.2009.typeiifn-dependentactivationofmnk1anditsroleinthegenerationofgrowthinhibitoryresponses.procnatlacadsciusa106:12097-102.

14.massond,ajarry,bbaury,pblanchardie,claboisse,etal.2001.overexpressionofthecd155geneinhumancolorectalcarcinoma.gut49:236-40.

15.merrillmk,gbernhardt,jhsampson,cjwikstrand,ddbigner,etal.2004.poliovirusreceptorcd155-targetedoncolysisofglioma.neuro-oncol6:208-17.

16.merrillmk,eydobrikova,mgromeier.2006.cell-type-specificrepressionofinternalribosomeentrysiteactivitybydouble-strandedrna-bindingprotein76.jvirol80:3147-56.

17.merrillmk,mgromeier.2006.thedouble-strandedrnabindingprotein76:nf45heterodimerinhibitstranslationinitiationattherhinovirustype2internalribosomeentrysite.jvirol80:6936-42.

18.nakair,ymaniwa,ytanaka,wnishio,myoshimura,etal.2010.overexpressionofnecl-5correlateswithunfavorableprognosisinpatientswithlungadenocarcinoma.cancersci101:1326-30.

19.nepliouevav,eydobrikova,nmukherjee,jdkeene,mgromeier.2010.tissuetype-specificexpressionofthedrbp76andgenome-wideelucidationofitstargetmrnas.plosone5:e11710.

20.ochiaih,sacampbell,gearcher,tachewning,edragunsky,etal.2006.targetedtherapyforglioblastomamultiformeneoplasticmeningitiswithintrathecaldeliveryofanoncolyticrecombinantpoliovirus.clincanres12:1349-54.

21.ochiaih,samoore,gearcher,tokamura,tachewning,etal.2004.treatmentofintracerebralneoplasiaandneoplasticmeningitiswithregionaldeliveryofoncolyticrecombinantpoliovirus.clincanres10:4831-8.

22.takaiy,jmiyoshi,wikeda,hogita.2008.柄蛋白sand柄蛋白-likemolecules:rolesincontactinhibitionofcellmovementandproliferation.natrevmolcellbiol9:603-15.

23.toyodah,jyin,smueller,ewimmer,jcello.2007.oncolytictreatmentandcureofneuroblastomabyanovelattenuatedpoliovirusinanovelpoliovirus-susceptibleanimalmodel.cancerres67:2857-64.

24.wahidr,mjcannon,mchow.2005.dendriticcellsandmacrophagesareproductivelyinfectedbypoliovirus.jvirol79:401-9.