一种含抗原表位K7的广谱弧菌疫苗及其制备与应用

文档序号:25993364发布日期:2021-07-23 21:06阅读:644来源:国知局
一种含抗原表位K7的广谱弧菌疫苗及其制备与应用

本发明涉及水产生物疫苗领域,尤其涉及一种含抗原表位k7的广谱弧菌疫苗及其制备与应用。



背景技术:

弧菌是海水养殖动物的主要病原之一。迄今见报到的引起海水养殖动物发生弧菌病的弧菌已有20多种,包括副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)、溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)、拟态弧菌(vibriomimicus)、创伤弧菌(vibriovulnificus)、河弧菌(vibrioflurialis)、弗尼斯弧菌(vibriofurnissii)、解蛋白弧菌(vibrioproteolyticus)、需钠弧菌(vibrionatriegens)、海利斯顿氏菌(vibriopelagius)、鳗弧菌(vibrioanguillarum)、哈维氏弧菌(vibrioharveyi)、美人鱼弧菌(vibriodamsela)、费氏弧菌(vibriofischeri)、灿烂弧菌(vibriosplendidus)、麦契尼可夫弧菌(vibriometschnikovii)、坎氏弧菌(vibriocampbellii),以及弧菌科的嗜水性气单胞菌(aeromonashydrophila)等。危害对象包括香鱼、鳗鲡、鲨鱼、鲑鳟鱼、鳕鱼、真鲷、梭鱼、石斑鱼、牙鲆、大菱鲆、平鲷、尖吻鲈等鱼类,对虾类、蟹类等甲壳类,鲍、文蛤、海湾扇贝、牡蛎等贝类。尽管传统的抗生素和化学药物治疗可有效控制弧菌的危害,但大量使用化学药物不仅增加了成本,而且隐患无穷。抗生素在杀灭了病原菌同时也杀灭了大量的有益菌,不仅导致耐药菌株和药物残留等问题,而且对环境和人类健康造成较大威胁。为此,研究和开发一个稳定、安全又实用的广谱弧菌疫苗对控制水产养殖病害、促进水产养殖业的健康持续发展具有重要意义。

目前,中国已获批的水产养殖疫苗只有四种:牙鲆溶藻弧菌-鳗弧菌-迟缓爱德华菌病多联抗独特型抗体疫苗、草鱼出血病病毒活疫苗、嗜水气单胞菌灭活疫苗、鳗弧菌减毒疫苗。已用于商业化的水产疫苗绝大多数属于传统的灭活或减毒疫苗,传统疫苗的具有工艺简单,成本较低,免疫效果良好等优点,但由于传统灭活或减毒疫苗存在接种副反应、菌株复活、对于一些重大的新型疾病无能为力等方面的问题,使得亚单位疫苗的开发成为了研究热点。

外膜蛋白(outermembraneprotein,omp)位于细胞表面,是杀菌性抗体和保护性抗体的良好靶点,并具有良好的抗原性,因而成为亚单位疫苗筛选和研究的热门对象。目前,国内外已发现并报道了多种具有免疫原性的弧菌外膜蛋白,包括ompa、psua、pvua、lamb、tolc、ompk、ompu、ompv、ompw等。然而,由于弧菌种类多,血清型复杂,单一来源的外膜蛋白,其抗原表位的组成也较为单一,难以对多种水产养殖中典型的弧菌感染都产生交叉免疫保护作用,这制约了重组外膜蛋白在亚单位疫苗中的应用。

表位疫苗的出现弥补了亚单位疫苗的一些不足,是近年来疫苗研究的新方向。首先,表位疫苗安全、无毒、稳定,可以直接刺激机体产生特异性免疫反应,其分子结构小而简单,不会引起自身免疫反应或免疫抑制。其次,表位肽疫苗可对抗原表位进行精确的定位,可对t、b细胞抗原表位进行不同组合,诱导多重免疫保护性反应;或者同时表达抗多种病原的抗原表位,制成针对多种病原体的疫苗广谱疫苗。随着细胞表位预测和定位技术的发展和利用,表位疫苗的筛选和设计成为一种疫苗开发的新策略,设计适当的多表位疫苗具有很好的广谱性。

抗原表位的筛选是多表位疫苗研制的基础。外膜蛋白ompk,是inoue等人于1995年在副溶血弧菌中发现的一种分子量约为28kda的外膜蛋白,该蛋白可作为噬菌体kvp40的受体,故称为ompk。近年来国内外大量研究表明,重组蛋白ompk在弧菌病防治中具有良好的免疫保护性,是一种潜在的弧菌疫苗候选抗原。不但如此,利用哈维氏弧菌的ompk重组蛋白免疫斜带石斑鱼,不仅能获得对哈维氏弧菌的抵抗力,而且能使其对溶藻弧菌和副溶血弧菌感染的产生免疫交叉保护。因此,外膜蛋白ompk是抗原表位筛选和研究的理想对象。但目前,对外膜蛋白ompk抗原表位的筛选及其免疫学特性的研究鲜有报道,更未出现基于ompk抗原表位设计的能够同时抵抗多种病原弧菌的广谱弧菌疫苗。



技术实现要素:

本发明的目的在于提供一种含抗原表位k7的广谱弧菌疫苗及其制备与应用,以解决现有技术存在的问题。

抗原表位k7在制备防治弧菌制剂的应用。

优选的,所述k7包括k7-3、k7-10、k7-4、k7-16、k7-5、k7-14、k7-12和k7-2,所述k7-3、k7-10、k7-4、k7-16、k7-5、k7-14、k7-12和k7-2的氨基酸序列分别如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8所示。

优选的,所述弧菌包括副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticusnty-ems,mccc1a02609,mccc1h00057)、溶藻弧菌(vibrioalginolyticusatcc33787,mccc1a11092,mccc1h00028)、哈维氏弧菌(vibrioharveyimccc1h00031,mccc1a00232)、鳗弧菌(vibrioanguillarummccc1h00003,mccc1h00007)、拟态弧菌(vibriomimicusmccc1a02602,mccc1h00078)、灿烂弧菌(vibriosplendidusmccc1a10925,mccc1a04069)和创伤弧菌(vibriovulnificusmccc1h00066,mccc1h00047)。

一种含抗原表位k7的广谱弧菌疫苗。

优选的,包括抗原表位k7-3、k7-10、k7-4、k7-16、k7-5、k7-14、k7-12、k7-2中的一种或者多种,设置在序列抗原表位k7两端的t细胞抗原表位k2;所述t细胞抗原表位k2的氨基酸序列如seqidno.20所示。

优选的,包括抗原表位k7-3、k7-10、k7-4、k7-16、k7-5、k7-14、k7-12和k7-2,抗原表位k7同源序列之间用gpgpg接头串联。构建得到的疫苗为evk-10。

优选的,将含抗原表位k7的广谱弧菌疫苗的序列转化为核苷酸序列,并进行密码子优化,分别在序列的两端加入限制性内切酶位点ndei(catatg)和xhoi(ctcgag),得到的核苷酸序列如seqidno.21所示。

上述含抗原表位k7的广谱弧菌疫苗的制备方法,包括以下步骤:

(1)采用化学法合成所述含抗原表位k7的广谱弧菌疫苗核苷酸序列,并将其插入到冷休克表达载体pcoldii中构建重组质粒pcoldii-evk-10;

(2)将重组质粒pcoldii-evk-10转化至大肠杆菌e.coliblr(de3)中,诱导抗原表位k7的广谱弧菌疫苗的表达。

上述含抗原表位k7的广谱弧菌疫苗在防治感染弧菌的应用。

与现有技术相比,本发明的含抗原表位k7的广谱弧菌疫苗具有以下优点:

(1)抗原表位k7来源于外膜蛋白ompk,在弧菌中高度保守。

(2)弧菌天然的k7抗原表位定位于弧菌细胞的表面,具有良好的免疫原性和抗原性,能诱导产生杀菌抗体,可作为广谱弧菌疫苗设计的有效靶标,可以在工程菌中获得高效而稳定的表达。

(3)可以利用多种抗原表位k7同源序列,构建基于能够同时抵抗多种病原弧菌的广谱弧菌疫苗,适用的弧菌包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌、拟态弧菌、灿烂弧菌和创伤弧菌等。

(4)制备方法简单。

附图说明

图1是抗原表位k7在外膜蛋白ompk三维结构中具体位置的示意图(a、侧视图;b、俯视图);

图2是抗原表位k7的19种同源序列及其在数据库中与查询匹配的序列数目;

图3是抗原表位k7的8种同源序列在不同弧菌中的分布情况;

图4是抗原表位k7的8种同源序列多克隆抗体的抗体效价测定;

图5是利用全细胞酶联免疫吸附测定抗原表位k7多克隆抗体对弧菌的识别情况;

图6是抗原表位k7在副溶血弧菌细胞表面的定位情况;

图7是抗原表位k7多克隆抗体的杀菌作用;

图8是多表位疫苗evk-10设计方案的示意图;

图9是冷休克表达载体pcoldii结构以及表达区域的示意图;

图10是多表位疫苗evk-10表达产物的蛋白电泳图;

图11是多表位疫苗evk-10亲和层析纯化产物的蛋白电泳图;

图12多表位疫苗evk-10纯化产物质谱鉴定比对结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1

k7是外膜蛋白ompk上一段长度为15个氨基酸的抗原表位。该抗原表位在外膜蛋白朝向细胞外的环状区域上,如图1所示。通过在国际生物基因数据库(genbank)搜索和比对发现了该抗原表位的19种同源序列,包括:

k7-3:tydsnqkdwngfqis、k7-10:tydsnkkdwngfqis、

k7-4:tydsnekdwngfqis、k7-16:tydsnmkdwngfqis、

k7-5:tydgnrkdwngfqis、k7-14:tyqgnqkdwngfqis、

k7-12:tydgnkkdwngfqvs、k7-2:tydgnnkgwngfqis、

k7-13:tydsnkkdwngyqis、k7-19:tydgnrkdwngyqvs、

k7-1:tydgnkkdwngfqis、k7-15:tydgnrkdwngyqis、

k7-17:fydgnekdwngfqis、k7-9:tyqgnnkdwngfqis、

k7-8:syygnqkdwngfqis、k7-18:rydfqtkdwngyqvs、

k7-7:tylgndkdwngfhfa、k7-11:tydgnredwngfqis、

k7-6:twdgdgkewngyhfa

氨基酸序列分别如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14、seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18、seqidno.19所示。

分别利用上述k7的19种同源序列在genbank中搜索和比对,然后统计在数据库中来自弧菌且与查询序列完全匹配的序列数目,即命中数(numberofhits,nohs)。统计结果如图2所示,这些同源序列在数据库中的命中数差异较大。有些同源序列命中数较高,如k7-3和k7-5,分别命中1136个和753个,表明具有这两种类型k7同源序列的弧菌数量较多。相反,有些同源序列命中数较较低,如k7-11和k7-6,分别命中16个和7个,表明具有这两种类型k7同源序列的弧菌数量较少。另一方面,抗原表位k7中的一个6个氨基酸的环状区域为该抗原表位的核心区域。聚类分析结果显示,前8个k7同源序列,即k7-3、k7-10、k7-4、k7-16、k7-5、k7-14、k7-12和k7-2,其所在的核心区域在所有命中数中占大多数(覆盖率大于96%)。提示抗原表位k7在弧菌中高度保守,且上述8个同源序列是弧菌抗原表位k7的主要类型。

对上述8个k7同源序列(k7-3、k7-10、k7-4、k7-16、k7-5、k7-14、k7-12和k7-2)在弧菌中的分布进行分析。结果如图3所示,k7-3至少分布于13种弧菌中,包括塔斯马尼亚弧菌(vibriotasmaniensis)、灿烂弧菌(vibriosplendidus)、vibriosalilacus、副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)、拟态弧菌(vibriomimicus)、vibriometoecus、迟缓弧菌(vibriolentus)、vibriohyugaensis、哈维氏弧菌(vibrioharveyi)、巨大弧菌(vibriogigantis)、魔鬼弧菌(vibriodiabolicus)、霍乱弧菌(vibriocholerae)、溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)等。k7-10至少分布于12种弧菌中,包括灿烂弧菌(vibriosplendidus)、青海弧菌(vibrioqinghaiensis)、副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)、欧文氏弧菌(vibrioowensii)、奥氏弧菌(vibrioordalii)、vibrioneptunius、拟态弧菌(vibriomimicus)、迟缓弧菌(vibriolentus)、哈维氏弧菌(vibrioharveyi)、河流弧菌(vibriofluvialis)、魔鬼弧菌(vibriodiabolicus)、鳗弧菌(vibrioanguillarum)等。k7-4至少分布于3种弧菌中,包括vibriometoecus、霍乱弧菌(vibriocholerae)、鳗弧菌(vibrioanguillarum)等。k7-16至少分布于3种弧菌中,包括创伤弧菌(vibriovulnificus)、魔鬼弧菌(vibriodiabolicus)、坎氏弧菌(vibriocampbellii)等。k7-5至少分布于9种弧菌中,包括创伤弧菌(vibriovulnificus)、拟态弧菌(vibriomimicus)、vibriometoecus、杀岩龙虾弧菌(vibriojasicida)、哈维氏弧菌(vibrioharveyi)、河流弧菌(vibriofluvialis)、霍乱弧菌(vibriocholerae)、溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)、易北河弧菌(vibrioalbensis)等。k7-14至少分布于6种弧菌中,包括副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)、欧文氏弧菌(vibrioowensii)、麦氏弧菌(vibriometschnikovii)、哈维氏弧菌(vibrioharveyi)、河流弧菌(vibriofluvialis)、溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)等。k7-12至少分布于4种弧菌中,包括副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)、哈维氏弧菌(vibrioharveyi)、vibrioantiquarius、溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)等。k7-2至少分布于4种弧菌中,包括贻贝弧菌(vibriomytili)、哈维氏弧菌(vibrioharveyi)、魔鬼弧菌(vibriodiabolicus)、溶藻弧菌(vibrioalginolyticus)等。

上述结果表明,抗原表位k7在弧菌中广泛分布,但在不同的弧菌中的分布具有多样性。例如,在副溶血弧菌中,抗原表位k7有k7-3、k7-10、k7-14和k7-12这4种类型,而在溶藻弧菌中,抗原表位k7有k7-3、k7-5、k7-14、k7-12和k7-2这5种类型。由于弧菌种类多,血清型复杂,单一来源的外膜蛋白,其抗原表位的组成也较为单一,难以对多种水产养殖中典型的弧菌感染都产生交叉免疫保护作用。例如,来源于哈维氏弧菌的ompk重组蛋白,其抗原表位的组成单一,只能对哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血等少数几种的弧菌感染产生免疫保护,而无法对其他种类或者其他血清型的弧菌感染产生广谱的免疫保护作用。这制约了重组外膜蛋白ompk在广谱弧菌疫苗中的应用。

为了确定抗原表位k7的免疫原性,以及确定其抗体与k7同源序列之间的免疫反应特性,分别以k7同源序列的化学合成肽为抗原,制备了8个k7同源序列的多克隆抗体,分别命名为anti-k7-3、anti-k7-10、anti-k7-4、anti-k7-16、anti-k7-5、anti-k7-14、anti-k7-12和anti-k7-2。酶联免疫吸附测定(elisa)结果如图4所示,上述8个多克隆抗体的抗体滴度均高于1:80000。同时,k7多克隆抗体能与不同的k7同源序列多肽发生交叉识别。表明抗原表位k7具有良好的免疫原性。

为了评估k7同源序列的多克隆抗体的抗原性,以k7同源序列(k7-3、k7-10、k7-4、k7-16、k7-5、k7-14、k7-12和k7-2)的多克隆抗体为一抗,以甲醛灭活的弧菌细胞为抗原进行全细胞酶联免疫吸附测定。结果如图5所示,k7同源序列的多克隆抗体能识别水产养殖动物中7种典型的病原弧菌(共16株),包括副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticusnty-ems,mccc1a02609,mccc1h00057)、溶藻弧菌(vibrioalginolyticusatcc33787,mccc1a11092,mccc1h00028)、哈维氏弧菌(vibrioharveyimccc1h00031,mccc1a00232)、鳗弧菌(vibrioanguillarummccc1h00003,mccc1h00007)、拟态弧菌(vibriomimicusmccc1a02602,mccc1h00078)、灿烂弧菌(vibriosplendidusmccc1a10925,mccc1a04069)和创伤弧菌(vibriovulnificusmccc1h00066,mccc1h00047),提示k7同源序列的多克隆抗体具有良好的抗原性。其中,以k7同源序列混合免疫制备的anti-k7-mix多克隆抗体能够交叉识别上述所有弧菌,其对弧菌细胞的识别能力与阳性对照(重组外膜蛋白ompk多克隆抗体anti-rompk)相当,对部分弧菌细胞的识别能力优于阳性对照。

为了确定弧菌细胞中天然的k7抗原表位在细胞膜表面的定位,以k7同源序列的多克隆抗体为一抗,以甲醛灭活的弧菌细胞为抗原进行激光共聚焦显微镜观察。结果如图6所示,抗原表位k7的多克隆抗体能够识别副溶血弧菌和溶藻弧菌的菌体细胞,提示弧菌天然的k7抗原表位暴露于弧菌细胞的表面。

为了进一步评估k7抗原表位能否诱导产生杀菌抗体,以豚鼠血清作为补体来源,对k7同源序列混合免疫制备的多克隆抗体anti-k7-mix进行补体介导的抗体杀菌活性分析。结果如图7所示,在anti-k7-mix多克隆抗体和补体的共同作用下,与对照平板相比,弧菌菌落数显著减少,提示anti-k7-mix为有效的杀弧菌抗体。

由于k7的同源序列(k7-3、k7-10、k7-4、k7-16、k7-5、k7-14、k7-12和k7-2)在不同的弧菌中的分布具有多样性。为了提高疫苗的广谱性,发挥不同来源抗原表位的互补作用,利用gpgpg接头将上述抗原表位串联,构建多表位疫苗evk-10(同时含有k7-3、k7-10、k7-4、k7-16、k7-5、k7-14、k7-12和k7-2吧),如图8所示。为了提高疫苗的免疫原性,在序列两端同时加入了一种t细胞抗原表位k2(mefggrsgifdlygy),氨基酸序列如seqidno.20所示。该抗原表位来自外膜蛋白ompk,且在弧菌中高度保守。二级结构分析工具protean和三维结构预测工具i-tasser分析显示,evk-10抗原性良好,各抗原表位间相对独立,并具有良好的表面可及性。预测多表位疫苗evk-10的表达产物含有206个氨基酸,理论分子量为21.996kda,等电点为5.49。

将多表位疫苗evk-10的序列转化为核苷酸序列,并进行密码子优化。分别在该序列的两端加入限制性内切酶位点ndei(catatg,氨基酸序列如seqidno.22所示)和xhoi(ctcgag,氨基酸序列如seqidno.23所示),核苷酸序列如seqidno.21所示。采用化学法合成evk-10的核苷酸序列,并将其插入到冷休克表达载体pcoldii中构建重组质粒pcoldii-evk-10。pcoldii是一种利用冷休克基因cspa启动子设计高效率蛋白质表达载体,如图9所示。将重组质粒pcoldii-evk-10转化至大肠杆菌e.coliblr(de3)中,诱导多表位疫苗evk-10的表达。e.coliblr(de3)为重组缺陷型(reca-)宿主,能稳定带有重复序列的目的基因,避免含有串联重复序列的evk-10基因在宿主菌中发生同源重组。

如图10所示,重组菌在20℃(泳道3)和37℃(泳道5)诱导下均能获得多表位疫苗evk-10的过量表达,过量表达产物分子量约为22kda。由于evk-10表达产物的n端含有组氨酸标签(6×histag),采用镍琼脂糖亲和层析对其进行纯化。如图11所示,经20mm咪唑(泳道3)洗脱后获得了多表位疫苗evk-10的纯化产物。切取纯化产物条带进行串联质谱鉴定。鉴定结果如图12所示,纯化产物序列与evk-10序列完全匹配,覆盖率为91%,提示多表位疫苗evk-10在工程菌中获得了高效而稳定的表达。

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