化合物在制备SARS-Cov-2E蛋白抑制剂中的用途的制作方法

本申请涉及抗病毒药物技术领域，尤其是涉及化合物在制备sars-cov-2e蛋白抑制剂中的用途。

背景技术：

新型冠状病毒肺炎covid-19是由新型冠状病毒sars-cov-2感染导致的肺炎，目前除了对其诊断试剂、疫苗的开发外，还需要能够直接治疗covid-19的药物。多种高致病性病毒均编码具有离子通道活性的小分子膜蛋白，而病毒的离子通道对病毒的致病性至关重要，可作为理想的药物靶点，如抗甲型流感病毒药物金刚烷胺是一种离子通道拮抗剂。现有研究结果显示，包括sars-cov-2在内的所有冠状病毒都编码一种疏水小包膜(e)蛋白，以严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)为例，其e蛋白的离子通道活性对病毒的致病性和发病机制至关重要。sars-cov和sars-cov-2的e蛋白序列具有很高的同源性。鉴于此，sars-cov-2的e蛋白很可能也具有离子通道活性并对病毒的致病性起到至关重要的作用。所以，以sars-cov-2的e蛋白为靶点的sars-cov-2e蛋白抑制剂极有可能在covid-19的治疗中发挥重要作用。而目前尚未发现有效的新型冠状病毒sars-cov-2的e蛋白抑制剂。

技术实现要素：

本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种化合物在制备sars-cov-2e蛋白抑制剂中的用途。

本申请的第一方面，提供化合物或其药学上可接受的盐在制备产品中的用途，化合物的通式为a-l-b；

其中，a为

r¹选自氢、取代或未取代的烃基、取代或未取代的酰基中的任一种；

r²～r⁵分别独立选自羰基、取代或未取代的亚甲基中的任一种；

l选自取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚烯基、取代或未取代的亚杂烯基、取代或未取代的亚炔基、取代或未取代的亚杂炔基、取代或未取代的亚碳环基、取代或未取代的亚杂环基、取代或未取代的亚芳基、取代或未取代的亚杂芳基中的至少一种；

b为r⁶选自氢、卤素、氰基、硝基、叠氮基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳基、-or⁷、-sr⁸、-nr⁹r¹⁰中的任一种,r⁷～r¹⁰分别独立选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳基中的任一种；

产品具有a1～a3中至少一种功用：

a1.抑制sars-cov-2e蛋白的离子通道活性；

a2.降低sars-cov-2的致病力；

a3.预防和/或治疗sars-cov-2引起的新型冠状病毒肺炎。

根据本申请实施例的应用，至少具有如下有益效果：

申请人在实验过程中发现，具有上述结构的化合物或其药学上可接受的盐对于抑制sars-cov-2e蛋白的离子通道活性具有良好的效果，因而可以用于制备具有相应功用的产品。

其中，致病力是指病毒引起宿主感染的能力，病毒对宿主的感染程度的指标包括致病力(pathogenicity)和毒力(virulence)。现有研究表明，病毒的离子通道蛋白对病毒的复制和释放具有非常重要的影响。因此，通过抑制病毒特定蛋白的离子通道活性也就成为抑制病毒的致病力的一个重要途径。具体到本方案，上述化合物能够在很大程度上影响sars-cov-2e蛋白的离子通道活性，自然也就能够对其致病力造成重要影响，进而能够在一定程度上预防和/或治疗sars-cov-2引起的新型冠状病毒肺炎。

在本申请的一些实施方式中，r¹选自氢、取代或未取代的烃基、取代或未取代的酰基中的任一种，其中，烃基或酰基的碳原子数在1～20；进一步，碳原子数在1～10；更进一步，碳原子数在1～5或1～3；烃基或酰基的取代基的非限制性实例包括卤素、氰基、硝基等。

在本申请的一些实施方式中，r²～r⁵中亚甲基的取代基的非限制性实例包括卤素、氰基、硝基、烃基、卤代烃基等。

在本申请的一些实施方式中，r²～r⁵分别独立选自羰基、亚甲基、甲基取代的亚甲基中的任一种。

在本申请的一些实施方式中，a选自以下任一种：

在本申请的一些实施方式中，a选自以下任一种：

在本申请的一些实施方式中，l的基团上的取代基的非限制性实例包括卤素、氰基、硝基、烃基、卤代烃基等。

在本申请的一些实施方式中，l中的碳原子数在1～40；进一步，碳原子数在1～30；更进一步，碳原子数在1～20或1～15。

在本申请的一些实施方式中，l为其中，l¹选自亚烷基、卤代亚烷基、亚烷氧基、卤代亚烷氧基、含氮亚杂环基、卤代含氮亚杂环基中的任一种或不存在。

在本申请的一些实施方式中，l选自以下任一种：

在本申请的一些实施方式中，r⁶基团上烷基、烯基、炔基、芳基的取代基的非限制性实例包括卤素、氰基、硝基、烃基、卤代烃基等。

在本申请的一些实施方式中，r⁶选自烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基中的任一种。

在本申请的一些实施方式中，r⁶为三氟甲基、甲氧基中的任一种。

在本申请的一些实施方式中，化合物具有如下通式：

在本申请的一些实施方式中，化合物选自以下任一种：

在本申请的一些实施方式中，药学上可接受的盐为羟基萘甲酸盐。羟基萘甲酸盐的非限制性实例包括1-羟基-2-萘甲酸盐、3-羟基-2-萘甲酸盐、4-羟基-2-萘甲酸盐、5-羟基-2-萘甲酸盐、6-羟基-2-萘甲酸盐、7-羟基-2-萘甲酸盐、8-羟基-2-萘甲酸盐等。

本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

附图说明

图1是本申请的实施例1中的sars-cov-2e蛋白的离子通道活性测定结果。

图2是本申请的实施例2中化合物azd5153的盐对sars-cov-2e蛋白的离子通道活性的抑制效果的测定结果。

图3是本申请的实施例2中化合物azd5153的盐与sars-cov-2e蛋白的结合模型。

图4是本申请的实施例3中化合物abbv-075对sars-cov-2e蛋白的离子通道活性的抑制效果的测定结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。

下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。

在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。

本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

实施例1

sars-cov-2e蛋白离子通道活性测定

(1)表达sars-cov-2e蛋白

sars-cov-2e蛋白基因(ncbi参考序列：nc_045512.2)由genewiz公司合成，并亚克隆至带有ires-gfp的pcdna3.1载体上。使用lipofectamine3000试剂将上述质粒瞬时转染至中国仓鼠卵巢细胞系(cho)中表达sars-cov-2e蛋白。

(2)测试sars-cov-2e蛋白的离子通道活性

以未转染的cho细胞作为对照，通过全细胞电压钳实验检测sars-cov-2e蛋白的离子通道活性。具体过程如下：

将细胞钳制在0mv，给予细胞从-100mv至100mv的阶梯电压，增量为10mv。检测不同电压下细胞被激发出的最大电流，结果如图1所示。

-100mv电压下，未转染的cho细胞的电流大小为-88.5±24.4pa(n＝13)，表达sars-cov-2e蛋白的cho细胞的电流大小为-169.9±73.7pa(n＝15)；100mv电压下，未转染的cho细胞的电流大小为154.9±42.8pa(n＝13)，表达sars-cov-2e蛋白的cho细胞的电流大小为300.6±136.5pa(n＝15)。与不表达sars-cov-2e蛋白的cho细胞相比，在电压刺激下，表达sars-cov-2e蛋白的cho细胞被激发出了明显增大的内向电流和外向电流，不成对t检验表明两组细胞在同样的电压刺激下电流大小有显著性差异(p<0.05)。

上述实验结果表明sars-cov-2e蛋白具有离子通道活性。

实施例2

通过同源建模，建立sars-cov-2e蛋白的五聚体结构模型。由于sars-cov和sars-cov-2的e蛋白序列具有很高的同源性(94.7％)，根据sars-cov的蛋白结构，同源建模得到了sars-cov-2e蛋白的结构模型。利用sars-cov-2e蛋白的结构模型，利用列出的药物库、临床期药物库和天然产物库进行了共计5000个化合物的虚拟筛选。筛选结果包括化合物azd5153的6-羟基-2-萘甲酸盐(casno:1869912-40-2，分子式：c36h41n7o6，分子量：667.7540)，该化合物的结构式如下：

验证该化合物对sars-cov-2e蛋白的离子通道活性抑制

在细胞记录外液中加入终浓度为40μm的化合物，使用实施例1中的方法检测sars-cov-2e蛋白具有离子通道活性，结果如图2所示。

在该化合物作用下，-100mv电压下，表达sars-cov-2e蛋白的cho细胞的电流大小为-56.8±21.1pa(n＝13)；100mv电压下，表达sars-cov-2e蛋白的cho细胞的电流大小为102.4±11.6pa(n＝13)。与未添加化合物时相比，细胞电流有明显的降低，不成对t检验表明两组细胞在同样的电压刺激下电流大小有显著性差异(p<0.05)。

上述实验结果表明该化合物对sars-cov-2e蛋白的离子通道活性具有很强的抑制作用。

图3是本申请的实施例2中化合物azd5153的盐与sars-cov-2e蛋白的结合模型的局部示意图。参考图3，sars-cov-2e蛋白的疏水口袋由一个亚基的val25、phe26、val29以及相邻亚基的phe23和phe26形成的界面组成，其中，phe23和val29是azd5153与e蛋白作用的关键位点，azd5153的哌嗪基团(a-l-b通式中的a)可能与相邻两个亚基的phe23、phe26、val29等残基发生作用，同时其三唑并哒嗪基团(a-l-b通式中的b)可能与五聚体的另外两个亚基的leu18、leu19、asn15等残基发生作用，从而通过改变其空间位阻的方式抑制阳离子在其间传导，进而影响sars-cov-2e蛋白的离子通道活性。因此，满足本申请实施例所要求的通式a-l-b的化合物或其盐都能够对sars-cov-2e蛋白的离子通道活性产生明显的抑制作用，从而能够用于降低sars-cov-2的致病力，或预防和/或治疗sars-cov-2引起的新型冠状病毒肺炎。

实施例3

已有的研究显示，化合物azd5153可与bet(bromodomainandextraterminaldomain)蛋白brd4(bromodomain-containingprotein4，即溴结构域蛋白4)上的溴结构域结合，在一定程度上防止bet蛋白与乙酰化组蛋白和转录因子之间的蛋白质-蛋白质相互作用靶向抑制brd4蛋白，使肿瘤细胞增殖延缓，甚至诱发肿瘤细胞凋亡，从而达到抗肿瘤作用(expertopinionontherapeuticpatents,2014,24(2):185-199；naturestructural&molecularbiology,2014,21(12):1047-1057)。为此，发明人进一步以其它已知的brd4抑制剂为例研究是否同样能够实现对sars-cov-2e蛋白的离子通道活性抑制。验证过程中采用吡啶酮类的化合物abbv-075，其结构式如下：

采用实施例2的方法检测，结果如图4所示。实验结果显示，与未添加化合物abbv-075时相比，细胞电流没有有明显的降低，不成对t检验表明两组细胞在同样的电压刺激下电流大小没有显著性差异(p>0.05)。

实施例4

分别取结构式如下的化合物的1-羟基-2-萘甲酸盐、3-羟基-2-萘甲酸盐和6-羟基-2-萘甲酸盐，采用实施例2中的方法验证其对sars-cov-2e蛋白的离子通道活性抑制效果，化合物的制备参见journalofmedicinalchemistry,2016,59(17):7801-7817：

结果显示，与未添加对应化合物时相比，加入后细胞电流存在显著的降低，表明这些化合物同样对sars-cov-2e蛋白的离子通道活性具有明显的抑制效果。

综合上述实验可以看到，本申请实施例所提供的具有特定结构的化合物能够作为sars-cov-2e蛋白的离子通道活性抑制剂使用。另外，多种冠状病毒的研究都已经表明，离子通道蛋白对病毒的复制和释放具有非常重要的影响。因此，上述化合物及其盐也就能够对sars-cov-2的致病力造成重要影响，进而能够在一定程度上预防和/或治疗sars-cov-2引起的新型冠状病毒肺炎。

上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。