一种抑制Th1细胞极化的小分子制剂及其应用

文档序号:25992675发布日期:2021-07-23 21:05阅读:320来源:国知局
一种抑制Th1细胞极化的小分子制剂及其应用

本发明属于细胞免疫调控技术领域,具体涉及一种抑制th1细胞分化的小分子制剂及其应用。



背景技术:

免疫系统是有机体重要的生理防线,通过活化产生免疫细胞及相关细胞因子,识别并清除外来病原体与自身产生的损伤细胞或肿瘤细胞等,发挥免疫监视、防御、调控等作用,维持机体内环境稳定,保障机体健康。

失控或功能失调的免疫反应源自异常活化的免疫系统,异常的免疫攻击也是造成多种自身免疫性系统疾病(如克罗恩病、1型糖尿病、移植物抗宿主病等)的主要诱因。维持免疫系统稳态,抑制异常活化的免疫反应,确保免疫应答的可控性对于防治免疫紊乱所致的自身免疫性系统疾病具有重要意义。

cd4+t细胞在获得性免疫反应和免疫调节中处于重要地位,cd4+t细胞具有高度可塑性,能够通过识别不同的tcr抗原信号与共刺激信号,活化为th1、th2、th17、treg和tfh等多种辅助性t细胞(th,helpertcell)亚群,发挥免疫调控的多样性,共同维持机体的免疫稳态。1型辅助性t淋巴细胞(th1细胞)的异常活化与多种免疫稳态失调的发生密切相关,也是导致多种免疫系统疾病如过敏反应、系统性红斑狼疮、急性移植物抗宿主病、多发性硬化等疾病发生的根源。il12可以诱导t淋巴细胞向th1细胞分化,并激活ifn-γ表达,是经典的促炎因子,在炎症发生早期发挥重要功能,是启动炎症反应、驱动th1细胞分化的关键促炎因子。目前临床上应用于治疗免疫紊乱所致的自身免疫性系统疾病常依赖于激素类药物或免疫抑制剂,但常伴发耐药性及长期免疫抑制所致感染等问题。

微小rna(microrna,mirna)是生物体内一类具有调控基因表达作用的非编码小rna分子,其发夹状前体经dicer酶切成为21-24nt的成熟的mirna,通过与靶基因mrna碱基互补配对的方式,启动mrna降解并下调基因表达。在生物体发育、细胞程序性凋亡坏死、细胞增殖、免疫和神经系统模式形成等生命过程中,mirna的表达与调控发挥着至关重要的作用,其表达异常可以与多种疾病发生相关。

因此,深入研究mirna的功能将有助于理解生物发育与疾病发生的作用机制,亟需开发一种mirna药物用于预防和治疗自身免疫性疾病。



技术实现要素:

本发明旨在解决如上所述的问题,目的在于提供一种抑制t淋巴细胞向th1细胞分化的小分子制剂及其应用。

为实现上述目的,本发明具体技术方案如下:

本发明第一方面,提供了一种抑制t淋巴细胞向th1细胞分化(th1极化)的小分子制剂,所述小分子制剂包括mir-148a-3p或其模拟物。

在一些具体实施方式中,所述mir-148a-3p选自以下mirna中的至少一种:初始mir-148a-3p、前体mir-148a-3p和成熟mir-148a-3p;所述初始mir-148a-3p在人细胞内被剪切并表达成成熟mir-148a-3p;所述前体mir-148a-3p在人细胞内被剪切并表达成成熟mir-148a-3p。

优选的,所述mir-148a-3p为成熟mir-148a-3p;所述mir-148a-3p的核苷酸序列为seqidno:1和/或seqidno:2所示。

本发明第二方面,提供了所述的小分子制剂在制备预防或治疗免疫系统疾病的药物组合物中的应用。

在一些具体实施方式中,所述小分子制剂mir-148a-3p抑制il12-ifn-γ信号通路,进而抑制t淋巴细胞向th1细胞分化。

在一些具体实施方式中,所述免疫系统疾病为th1细胞极化所致的免疫系统过度激活相关的疾病。

优选的,所述免疫系统疾病包括过敏反应、系统性红斑狼疮、急性移植物抗宿主病、多发性硬化症等。

本发明第三方面,提供了mir-148a-3p在制备il12-ifn-γ信号通路抑制剂中的应用。

在一些具体实施方式中,所述抑制剂能降低il12-ifn-γ信号通路中相关基因的表达。

优选的,所述il12-ifn-γ信号通路中相关基因包括il12rβ1、il12rβ2、tbx21、stat4和ifn-γ。

本发明第四方面,提供了一种调控小鼠cd4+幼稚t淋巴细胞(cd4+t淋巴细胞)向th1细胞分化的方法,包括以下步骤:

分离提取小鼠的脾淋巴细胞,经磁珠分选出其中的cd4+t淋巴细胞,将mir-148a-3p导入cd4+t淋巴细胞,在il12/il2/anticd28/antiil4/anticd3ε的混合因子作用下,诱导其向th1细胞分化。

在一些具体实施方式中,所述il12/il2/anticd28/antiil4/anticd3ε各因子浓度为:il12:10ng/ml;il2:5ng/ml;anticd28:0.5μg/ml;antiil4:1μg/ml;anticd3ε:1μg/ml。

在一些具体实施方式中,所述将mir-148a-3p导入cd4+t淋巴细胞的方法为:用脂质体包裹mir-148a-3pmimic,接种于磁珠分选后的cd4+t淋巴细胞;所述mir-148a-3pmimic为双链rna的小分子制剂,其中正义链为5’-ucagugcacuacagaacuuugu-3’,反义链为5’-aaaguucuguagugcacugauu-3’。

在一些具体实施方式中,所述脂质体包裹mir-148a-3pmimic的转染方法:控制mirna终浓度为100nm,小鼠cd4+t淋巴细胞培养密度为1×106/ml,培养时间为72-96小时,转染培养基为含10%fbs的1640培养基,不含抗生素。

在一些具体实施方式中,所述向小鼠cd4+t淋巴细胞导入mir-148a-3p可阻断混合因子诱导th1细胞分化的途径,mir-148a-3p可靶向抑制il12-ifn-γ介导的th1细胞极化。

在一些具体实施方式中,所述分离提取小鼠脾淋巴细胞的方法为:无菌条件下取六周龄c57bl/6小鼠的脾脏,置于盛有1640培养基内,用眼科剪剪碎脾脏,移入200目无菌筛网上,用玻璃棒研磨,边研磨边滴入1640培养基,直至研磨分散的脾细胞全部经滤网流出,收集脾细胞450g离心10min,去上清重悬,加入等体积淋巴细胞分离液,450g离心30min,吸取淋巴细胞层,加入pbs重悬,400g离心10min,pbs洗涤后加入红细胞裂解液静置5min,1500rpm离心10min,收集细胞计数,利用miltenyicd4+t细胞分离试剂盒,分离脾淋巴细胞中的cd4+t淋巴细胞,计数,按1×106/ml种于6孔板中,加入混合因子诱导其向th1细胞分化,培养时间72-96h。

基于上述技术方案,本发明具有以下有益效果:

1、本发明利用mir-148a-3p转染抑制小鼠cd4+t淋巴细胞,发现mir-148a-3p靶向和抑制il12-ifn-γ通路,进而抑制cd4+t淋巴细胞向th1淋巴细胞分化,显著抑制了th1细胞的极化效果,由此提出了抑制小鼠1型辅助性t淋巴细胞分化的小分子制剂,可用于抑制th1细胞极化所致的免疫系统过度激活。

2、本发明提供的抑制小鼠th1细胞极化的方法,利用脂质体承载小分子化合物mir-148a-3p转染小鼠cd4+t淋巴细胞,方法操作简便,可以稳定上调mir-148a-3p表达;优选th1细胞极化培养条件和mir-148a-3p转染体系,可快速、方便、高效地进行转染与细胞培养。

附图说明

图1小鼠cd4+t淋巴细胞向th1淋巴细胞分化结果,在il12/il2/anticd28/antiil4/anticd3ε的混合因子作用下诱导th1细胞分化培养72h至96h,流式细胞术检测ifn-γ和cd4双阳细胞占比,其中正常诱导th1极化可达77.4%(a),转染mir-148a-3p后th1的极化比例下降至64.7%(b),统计结果如c所示(*p=0.045)。

图2采用q-pcr法检测诱导th1细胞分化培养后th1分化组与mir-148a-3p处理组的细胞内ifn-γ、stat1、stat4、tbx21、il12rβ1和il12rβ2基因的表达水平。

图3采用westernblot检测诱导th1细胞分化培养后th1分化组与mir-148a-3p处理组的细胞内pi-stat4和stat4蛋白水平。

图4生物信息学预测mir-148a-3p对il12-ifn-γ通路各组分il12rβ1、il12rβ2、tbx21、stat4和ifn-γ的靶标序列(图4a)及人工构建突变序列(图4b),mir-148a-3p对该通路各组分均有一定靶向性。

图5双荧光素酶报告基因检测ifn-γ、stat4、tbx21、il12rβ1和il12rβ2的表达。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。

下述实施例中所有的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。

本发明主要使用的材料为:

胎牛血清(fbs)为pan公司产品;流式细胞术相关抗鼠单克隆抗体:anti-mousecd4-pe、anti-mouseifn-γ-apc、isotyperat-igg2a-apc、isotyperat-igg2a-pe,均为ebioscience公司产品;pbs(8.0gnacl、2.9gna2hpo4·12h2o、0.2gkcl、0.24gkh2po4定容溶解于1000ml去离子水中,调整ph值至7.4,非特殊指出,本文中所用pbs皆为此配方);1640培养基(2.4ghepes、2.2gnahco3、10g1640培养基溶解于1000ml去离子水中调整ph值至7.4,非特殊指出,本文中所用1640培养基皆为此配方);anti-il-14、anti-cd28、anti-cd3ε、il-12、il-2为美国tonbo公司产品;neaa美国为gibco公司产品;鼠脾脏组织淋巴细胞分离液购于中国灏洋华科生物科技有限公司;miltenyicd4+t细胞分离试剂盒购于德国美天旎公司;trizol购于美国sigma公司;rt-pcr试剂盒为takara公司产品;dual-luciferase试剂盒购于美国promega公司;mir-148a-3pmimic、引物购自上海生工生物工程(上海)股份有限公司,其具体序列如表1所示。

实施例1小鼠cd4+t淋巴细胞的分离

分离提取小鼠脾淋巴细胞的方法为:无菌条件下取六周龄c57bl/6小鼠的脾脏,置于盛有1640培养基内,用眼科剪剪碎脾脏,移入200目无菌筛网上,用玻璃棒研磨,边研磨边滴入1640培养基,直至研磨分散的脾细胞全部经滤网流出,收集脾细胞450g离心10min,去上清重悬,加入等体积淋巴细胞分离液,450g离心30min,吸取淋巴细胞层,加入pbs重悬,400g离心10min,pbs洗涤后加入红细胞裂解液静置5min,1500rpm离心10min,收集细胞计数,利用miltenyicd4+t细胞分离试剂盒,分离脾淋巴细胞中的cd4+t淋巴细胞。

实施例2小鼠th1细胞的诱导分化

cd4+t细胞分选后,计数,按1×106/ml种于6孔板中,置于含10%fbs的1640完全培养基,加入混合因子诱导th1细胞分化,各因子浓度为:il12:10ng/ml,il2:5ng/ml,anticd28:0.5μg/ml,antiil4:1μg/ml,anticd3ε:1μg/ml加入neaa及55μmβ-巯基乙醇,培养时间为72h至96h。在细胞培养至36h时,进行半量换液,移除1ml原始培养基,用1ml含10%fbs的1640完全培养基混合2倍浓度因子、neaa及55μmβ-巯基乙醇。

实施例3mir-148a-3p小分子制剂的制备与转染

1、将1.00od260的mir-148a-3pmimic用125μldepc水稀释,使其终浓度为20μm。其中mir-148a-3p的序列如表1所示,上述序列购自上海生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1rna及引物序列

2、转染

cd4+t细胞按1×106/ml种于6孔板,加入1640完全培养基及th1诱导剂后。将3μlmir-148a-3pmimic稀释于100μljetprimebuffer中,加入6μljetprime,轻轻混合,室温下静置15min,形成复合物。将脂质体复合物加入六孔板中,转染体系为100μl,mirna终浓度为100nm。36小时左右半量换液。

3、流式细胞术分析

检测cd4+t细胞向th1细胞分化所用流式抗体为anti-mousecd4-pe、anti-mouseifn-γ-apc、isotyperat-igg2a-apc、isotyperat-igg2a-pe。收取诱导th1细胞分化培养后th1分化组与mir-148a-3p处理组的细胞,加流式抗体anti-mousecd4-pe4℃避光孵育30min,pbs洗涤,离心,4%中性甲醛固定10min,0.1%triton破膜10min,0.1%tween-20洗涤,离心,流式抗体anti-mouseifn-γ-apc4℃孵育30min,洗涤,离心,加入pbs,上机检测。结果如图1所示:流式细胞术检测ifn-γ和cd4双阳细胞占比,其中正常诱导th1极化可达77.4%(a),转染mir-148a-3p后th1的极化比例下降至64.7%(b),统计结果如c所示(*p=0.045)。

4、rna提取及检测

收取诱导th1细胞分化培养后th1分化组与mir-148a-3p处理组的细胞,trizol法提取总mrna,利用总rna1μg、rnafreewater、oligodt1μl、random1μl、5×m-mlvbuffer4μl、dtt2μl、dntp1μl、m-mlv1μl、rnaseinhibitor1μl制备逆转录混合反应液20μl,在pcr扩增仪上进行逆转录反应(70℃,10min;42℃,1h;70℃,10min),反应结束后,逆转录产物cdna置于冰上或储存于-20℃保存。rt-pcr检测il12rβ1、il12rβ2、tbx21、stat4和ifn-γ的基因表达量。其中rt-pcr引物序列如表1所示。反应体系:cdna1μl,pcr上下游引物(seqidno:3-12,10μm)1μl,pt-pcrmastermix10μl和rnafreewater8μl;反应条件:95℃10min,95℃15s,60℃1min,共40个循环;95℃15s,60℃1min,95℃15s。gapdh作为内参,数据采用2-△△ct法进行分析。

诱导th1细胞分化培养后th1分化组与mir-148a-3p处理组的细胞内基因表达改变情况如图2所示。mir-148a-3p处理后,il12-ifn-γ相关信号通路各组分il12rβ1、il12rβ2、tbx21、stat4和ifn-γ的基因表达水平显著低于th1分化组。

5、western蛋白检测

westernblot检测stat4、磷酸化stat4(pi-stat4)蛋白水平变化。收集th1细胞分化培养后th1分化组与mir-148a-3p处理组的细胞,pbs洗2遍,细胞裂解液4℃裂解细胞15min,13000rpm4℃离心10min,bca蛋白浓度测定试剂检测蛋白含量。取30μl蛋白样品加上样缓冲液煮沸变性后,经10%sds-page分离后,转移到pvdf膜上,含5%脱脂奶粉室温封闭1h。4℃过夜孵育一抗,用tbst洗膜3次,加入二抗室温孵育1h,再用tbst洗膜3次,ecl化学发光显影。

结果如图3所示,与诱导th1分化组相比,转染mir-148a-3p后th1分化的关键转录因子stat4蛋白水平显著下调,pi-stat4蛋白水平显著低于th1分化组。

6、双荧光素酶报告系统构建与靶序列突变载体构建

经生物信息学分析,发现mir-148a-3p对th1极化所必需的il12-ifn-γ通路各组分ifn-γ、stat4、tbx21、il12rβ1和il12rβ2的3’utr序列存在特异性结合靶点(图4a),据此针对各靶点分别构建突变序列(图4b)以验证mir-148a-3p对该通路各组分的靶向性调控作用。

利用psicheck2双荧光素酶报告载体,分别构建ifn-γ、stat4、tbx21、il12rβ1和il12rβ2的3’utr序列(psi-wt)及靶标点突变序列(psi-mutant)的克隆。将psi-wt和psi-mutant载体分别与mir-148a-3pmimic共同转染至hela细胞中,进行双荧光素酶报告系统,检测mir-148a-3p对il12-ifn-γ通路是否有一定靶向性。

转染前1d将hela细胞接种于96孔板中,细胞接种密度为5×103/孔,加入100μl含10%fbs的dmem完全培养基,细胞密度达到50%左右进行转染,将0.025μg载体、1μlmir-148a-3pmimic稀释于20μljetprimebuffer中,加入2μljetprime轻轻混合,室温下静置15min,形成转染复合物。将脂质体复合物加入80μldmem完全培养基,转染体系为100μl,加入96孔板中,mirna终浓度为100nm。12小时左右弃上清,加入100μl含10%fbs的dmem完全培养基。37℃5%co2孵箱培养,培养时间为36h。

图5所示为双荧光素酶报告系统针对mir-148a-3p对该通路各组分il12rβ1、il12rβ2、tbx21、stat4和ifn-γ均有一定靶向性,mir-148a-3pmimic处理后可靶向下调报告基因renilla-luciferase的表达,而靶向序列突变后,经mir-148a-3p处理并不能下调报告基因renilla-luciferase的表达。

虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。

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<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120>一种抑制th1细胞极化的小分子制剂及其应用

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