一种预防和控制人乳头瘤病毒感染（HPV）的活性生物蛋白的制备方法与流程

一种预防和控制人乳头瘤病毒感染(hpv)的活性生物蛋白的制备方法
技术领域
1.本发明属于医药领域，具体涉及一种预防和控制人乳头瘤病毒感染(hpv)的活性生物蛋白的制备方法。


背景技术：

2.人乳头瘤病毒持续感染属于宫颈比较常见的疾病类型。据不完全统计，全球正常女性宫颈hpv感染率可达到13％左右，而国内稍高于该值，其中性活跃女性中生殖道hpv感染甚至能超过80％。大多数情况下，hpv感染后可经机体免疫调节清除，但约有10％左右hpv会持续存于宫颈，这类持续感染是导致宫颈癌最为主要的一个原因。基于此，尽早诊断与治疗宫颈hpv持续感染十分关键。
3.目前，能够治疗或预防人乳头瘤病毒感染的产品并不少，但这些产品的治疗效果一般，无法彻底阻断hpv病毒感染。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种预防和控制人乳头瘤病毒感染(hpv)的活性生物蛋白的制备方法，采用该方法制备的活性生物蛋白能够预防和控制hpv的病毒、并阻止病毒感染。
5.为实现上述目的，本发明是采用如下技术方案实现的：
6.一种预防和控制人乳头瘤病毒感染(hpv)的活性生物蛋白的制备方法，包括以下步骤：
7.步骤1、取活性蛋白或活性肽溶于超纯水中，配置成浓度为0.05
‑
0.2g/ml的活性蛋白溶液；
8.步骤2、取酸酐或酸酐衍生物，加入水，配置成质量分数为10
‑
50％的酸酐水溶液；
9.步骤3、配置磷酸盐缓冲溶液，用盐酸调节溶液ph值；
10.步骤4、取活性蛋白溶液，将其加入到磷酸盐缓冲溶液中，搅拌均匀后，将酸酐水溶液缓慢倒入活性蛋白溶液中，30
‑
40℃下搅拌1h以上；
11.步骤5、将步骤4的溶液倒入透析袋中，之后放入磷酸盐缓冲溶液中透析；
12.步骤6、用注射器取步骤5的溶液，微孔滤膜过滤除菌；
13.步骤7、冷冻干燥后，冷藏保存。
14.作为本发明的优选，所述活性蛋白包括：活性动物胶原蛋白、重组人源胶原蛋白、抗菌蛋白；所述活性肽包括：抗菌肽nal
‑
p
‑
113、抗菌肽pl
‑
5。
15.作为本发明的优选，所述酸酐或酸酐衍生物包括：琥珀酸酐、琥珀酸酐衍生物、马来酸酐、马来酸酐衍生物、3
‑
羟基
‑
邻苯二甲酸酐、乙酸酐。
16.作为本发明的优选，磷酸盐缓冲液配置方式为：取7.9g氯化钠、0.2g氯化钾、0.24g磷酸二氢钾和1.8g磷酸氢二钾，溶于800ml超纯水中，用盐酸调节溶液ph值至7.0，最后加超
纯水定容至1l。
17.本发明的优点和积极效果：采用本发明提供的方法所获得的抗hpv活性生物蛋白经正负电荷作用破坏hpv蛋白构象，使hpv失活。同时，该活性生物蛋白也可与hpv衣壳蛋白的l1的c端和l2肽段的n端的正电荷区域结合，阻断病毒侵入宿主细胞，从而达到阻断hpv感染的目的。
附图说明
18.图1是gd蛋白对hpv6的抑制作用图。
具体实施方式
19.以下结合附图和具体实施方式对本发明作以进一步的阐述，以便本领域的技术人员更了解本发明所述的技术方案，但并不以此限制本发明。
20.实施例1
21.一种预防和控制人乳头瘤病毒感染(hpv)的活性生物蛋白的制备方法，包括以下步骤：
22.步骤1、取活性动物胶原蛋白冻干粉1g(西安凌丰生物科技有限公司)，溶于10ml超纯水中，配置成浓度为0.1g/ml的活性蛋白溶液；
23.步骤2、取20g琥珀酸酐，加入80ml水，配置成质量分数为20％的琥珀酸酐水溶液；
24.步骤3、配置磷酸盐缓冲溶液：取7.9g氯化钠，0.2g氯化钾，0.24g磷酸二氢钾和1.8g磷酸氢二钾，溶于800ml超纯水中，用盐酸调节溶液ph值至7.0，最后加超纯水定容至1l；
25.步骤4、取2ml 0.1g/ml活性蛋白溶液，加入5ml磷酸盐缓冲溶液中，搅拌均匀后，将5ml琥珀酸酐水溶液缓慢倒入活性蛋白溶液中，37℃下搅拌2h；
26.活性蛋白与琥珀酸酐化学反应式如下：
[0027][0028]
步骤5、透析：取透析袋10
‑
15cm，将其一端用棉绳扎死，由开口端倒入5ml步骤4获得的溶液，开口端用棉绳扎死，放入30ml磷酸盐缓冲溶液，用磁力搅拌器搅拌4h，促进溶液交换；
[0029]
步骤6、过滤除菌：用注射器取5ml步骤5获得的溶液，将注射器插入0.22μm一次性针头过滤器中，过滤除菌；
[0030]
步骤7、冷冻干燥：
‑
50℃下，真空(1.3
‑
13帕真空度)干燥至干，得活性生物蛋白，4℃保存。
[0031]
实施例2
[0032]
与实施例1的区别在于：活性动物胶原蛋白冻干粉替换成抗菌肽nal
‑
p
‑
113(来源：prospec)，琥珀酸酐替换成马来酸酐，其它步骤参照实施例1。
[0033]
实施例3
[0034]
与实施例1的区别在于：活性动物胶原蛋白冻干粉替换成抗菌肽抗菌肽pl
‑
5(来源：prospec)，琥珀酸酐替换成3
‑
羟基
‑
邻苯二甲酸酐，其它步骤参照实施例1。
[0035]
实施例4
[0036]
与实施例1的区别在于：活性动物胶原蛋白冻干粉替换成抗菌蛋白(来源：prospec)，琥珀酸酐替换成乙酸酐，其它步骤参照实施例1。
[0037]
本发明实施例1至实施例4制备的产品接枝率计算及对hpv6抑制率的研究：
[0038]
1、接枝率计算
[0039]
表1 活性生物蛋白接枝率
[0040]
产物名称接枝前羧基含量(mol/l)接枝后羧基含量(mol/l)接枝率(％)实施例1(gd蛋白)2.8
×
10
‑53.8
×
10
‑535.7％实施例21.7
×
10
‑52.34
×
10
‑537.6％实施例32.33
×
10
‑52.79
×
10
‑519.7％实施例43.08
×
10
‑54.34
×
10
‑540.9％
[0041]
2、对hpv6抑制率的研究
[0042]
表2 活性生物蛋白对hpv6的抑制作用
[0043][0044][0045]
上述对照组为直接采用活性动物胶原蛋白后将其溶于超纯水中，配置成上述浓度的溶液。