外泌体用于防止脑型疟疾发生的实验方法

本发明涉及疟疾预防技术领域，具体涉及外泌体用于防止脑型疟疾发生的实验方法。

背景技术：

疟疾是一种严重危害人类健康的全球感染性疾病。据2020who疟疾报告，2019年全球有89个国家和地区流行疟疾，约2.29亿人感染，因疟疾而死亡的人数达40.9万。特别是在非洲等发展中国家，疟疾仍然是5岁以下儿童死亡的主要原因。仅在撒哈拉以南非洲地区每年至少20万人死于重症疟疾，其中恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum，pf)引起的脑型疟疾(简称脑疟，cerebralmalaria,cm)是重症患者致死的主要原因。cm致死率高达15-25％，死亡人数占疟疾总死亡人数的90％，而且四分之一幸存病人还会患有长期的神经和认知缺陷。

因此深入了解cm发生、发展过程中相关致病机制及疟原虫与宿主相互作用是全球范围内控制和根除疟疾、开发有效疟疾疫苗的基础和前提。

寄生虫与寄生部位的组织均能够分泌外泌体，但虫源外泌体与宿主源外泌体难以区分。目前组织外泌体的提取尚处于起步阶段，因此选择最佳提取方法是未来工作的重点。虫源外泌体作用于宿主的机制仍不明确，其调控宿主细胞的生物活性物质还有待研究。

技术实现要素：

本发明提出的外泌体用于防止脑型疟疾发生的实验方法，可解决上述技术问题。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

外泌体用于防止脑型疟疾发生的实验方法，包括：

s1、利用p.y17xnl鼠疟模型，提取外周血后超速离心法或磁珠免疫捕获法分离纯化外泌体；

s2、利用外泌体或外泌体联合cpgodn免疫正常c57bl/6j小鼠，固定时间点p.banka攻击，动态观察感染过程、神经系统症状和血脑屏障(bbb)完整性，确定外泌体的免疫效应。

进一步的，所述s1具体包括外泌体提取和外泌体鉴定；

其中，外泌体提取包括balb/c小鼠经腹腔注射1×10⁶p.y17xnl寄生的红细胞(prbc)，确定虫血症20％-30％后提取外泌体；

采用超速离心法或磁珠免疫捕获法提取p.y17xnl感染的balb/c小鼠外周血中的外泌体，测蛋白浓度后置于-80℃冰箱中备用；

所述外泌体鉴定包括采用透射电镜和wb方法对上述提取的外泌体形态结构、粒径大小和表面特异性分子的表达进行分析。

进一步的，所述s2具体包括即外泌体免疫步骤如下：

c57bl/6j小鼠尾静脉注射外泌体5μg/只，于0天和20天各免疫一次；第二次免疫后20天c57bl/6j小鼠经腹腔注射1×10⁶p.banka寄生的红细胞prbc；

外泌体联合cpgodn免疫：c57bl/6j小鼠皮下注射外泌体10μg/只联合cpgodn10μg/只，20天后再次外泌体单独皮下注射5μg/只；第二次免疫后20天c57bl/6j小鼠经腹腔注射1×10⁶p.banka寄生的红细胞(prbc)。

另一方面，本发明还公开上述步骤所提取的外泌体。

由上述技术方案可知，本发明的外泌体用于防止脑型疟疾发生的实验方法，通过提取异种疟原虫感染后宿主外周血中的外泌体，采用尾静脉注射单独免疫外泌体或皮下注射外泌体联合cpgodn两种方法于0天和20天分别免疫c57bl/6j小鼠两次，第二次免疫20天后1×10⁶p.banka寄生的红细胞(prbc)攻击免疫小鼠，实验结果发现，与模型组相比，免疫组小鼠的虫血症明显降低，生存率高达90-100％。神经系统症状未出现，且小鼠的bbb保持完整性。证明外泌体可以有效保护c57bl/6j小鼠防止脑疟的发生。

附图说明

图1是本发明的方法流程图；

图2是投射电子显微镜和wb鉴定疟疾感染宿主外周血来源的外泌体；

图3是外泌体免疫小鼠的原虫血症水平和生存率；

图4是外泌体免疫小鼠血脑屏障(bbb))完整性检测。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

如图1所示，本实施例所述的外泌体用于防止脑型疟疾发生的实验方法，包括以下步骤：

s1、利用p.y17xnl鼠疟模型，提取外周血后用超速离心法或磁珠免疫捕获法分离纯化外泌体，对外泌体进行纯化和内毒素检测；

s2、利用尾静脉注射外泌体或皮下注射外泌体联合cpgodn免疫正常c57bl/6j小鼠，固定时间点p.banka攻击，动态观察感染过程、神经系统症状和血脑屏障(bbb)完整性，确定外泌体的免疫效应；

以下详细说明：

(1)外泌体提取：balb/c小鼠经腹腔注射1×10⁶p.y17xnl寄生的红细胞(prbc)，确定虫血症(20％-30％)后提取外泌体；采用超速离心法或磁珠免疫捕获法提取p.y17xnl感染的balb/c小鼠外周血中的外泌体，测蛋白浓度后置于-80℃冰箱中备用；

(2)外泌体鉴定：采用透射电镜和wb方法对上述提取的外泌体形态结构、粒径大小和表面特异性分子的表达进行分析；

(3)外泌体免疫方法：

外泌体免疫：c57bl/6j小鼠尾静脉注射外泌体(5μg/只)，于0天和20天各免疫一次；第二次免疫后20天c57bl/6j小鼠经腹腔注射1×10⁶p.banka寄生的红细胞(prbc)。

外泌体联合cpgodn免疫：c57bl/6j小鼠皮下注射外泌体(10μg/只)联合cpgodn(10μg/只)，20天后再次外泌体单独皮下注射(5μg/只)；第二次免疫后20天c57bl/6j小鼠经腹腔注射1×10⁶p.banka寄生的红细胞(prbc)。

(4)外泌体免疫效应：

疟原虫攻击的免疫小鼠感染过程观察：记录虫血症和生存率。尾静脉采血，制备薄血膜，giemsa染色，动态监测原虫血症水平及生存率；

神经系统症状评估：感染后第5天起每日监测两次以评估ecm的发生。

评分标准：皮毛竖起、弓背、步态不稳、肢体瘫痪、抽搐、昏迷。每出现一种症状给予1分，≥4分者考虑为严重ecm。

血脑屏障(bbb)完整性测定：于小鼠感染后第5天，静脉注射200μl伊文思蓝染料(2％evansbluedye，eb，sigma公司)，1小时后，经心脏灌注生理盐水而至流出清亮的液体为准，取脑并放入装有1ml甲酰胺(sigma公司)中号试管中，37℃温箱孵育48h，3000r/min离心15min，取上清液于紫外分光光度仪上(波长630nm)测定染料溢出物，检测bbb的通透性。

以下举例说明：

一、外泌体的提取和鉴定

透射电镜观察结果显示，p.y17xnl感染的balb/c小鼠外周血中的外泌体均为圆形或椭圆形囊泡结构且直径大小在50-150nm之间(图2a,2b)；cd9、tsg101为比较常用的外泌体特征性蛋白，通过wb比较超离出的外泌体和血清中cd9、tsg101的蛋白表达量，结果显示两者均表达阳性，但外泌体中cd9、tsg101的蛋白表达量明显高于上清液(图1c)，说明超离出的外泌体蛋白浓度较高，可用于后续实验。

二、疟疾宿主源外泌体免疫小鼠虫血症和生存率

通过提取p.y17xnl感染的balb/c小鼠外周血中的外泌体，固定时间点单独或联合cpgodn尾静脉(iv)或皮下(sc)免疫c57bl/6j小鼠二次，随后p.banka攻击。实验结果发现，与模型组小鼠相比，iv和sc组小鼠原虫血症上升缓慢，于感染后第9天达峰值，仅为14％和18％，且iv和sc两组之间无差异。模型组小鼠于感染后6-10天全部死于脑疟。外泌体免疫组小鼠的生存时间明显被延长，于感染后第10天开始出现死亡，但生存率高达90-100％(见图3a,3b)。

三、疟疾宿主源外泌体免疫小鼠血脑屏障(bbb)完整性

本发明采用体内伊文思蓝血脑屏障通透性试验检测了外泌体免疫对ecm小鼠bbb完整性的保护作用。结果发现，与模型组小鼠相比，外泌体经iv和sc途径免疫的c57bl/6j小鼠bbb泄漏的伊文思蓝染料量明显降低(p<0.05)(见图4a,4b)。

实验结论

1.与模型组小鼠相比，iv(尾静脉注射)和sc(皮下注射)组小鼠原虫血症上升缓慢，于感染后第9天达峰值，仅为14％和18％，且iv和sc两组之间无差异。

2.模型组小鼠于感染后6-10天全部死于脑疟。外泌体免疫组小鼠的生存时间明显被延长，于感染后第10天开始出现死亡，但生存率高达90-100％。

3.体内伊文思蓝血脑屏障(bbb)通透性试验：与模型组小鼠相比，外泌体经iv和sc途径免疫的c57bl/6j小鼠bbb泄漏的伊文思蓝染料量明显降低(p<0.05)，结果证明外泌体免疫可保护ecm小鼠bbb的完整性。

本发明上述步骤所提取的外泌体可制成相应的制剂，包括药学上可接受的辅剂，所述制剂的剂型可以为散剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、片剂或注射剂，上述外泌体可用于防止脑型疟疾病理损伤发生。

综上所述，本发明是利用外泌体联合cpgodn皮下免疫正常利用p.y17xnl鼠疟模型，提取外周血后超速离心法或磁珠免疫捕获法分离纯化外泌体，利用外泌体或外泌体联合cpgodn免疫正常c57bl/6j小鼠，固定时间点p.banka攻击，动态观察感染过程、神经系统症状和血脑屏障(bbb)完整性，确定外泌体的免疫效应。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。