GC376化合物的新用途

本发明属于医药领域，具体涉及化合物gc376和瑞德西韦在制备用于治疗新型冠状病毒肺炎的药物中的用途。

背景技术：

新型冠状病毒肺炎“covid-19”是由新型冠状病毒sars-cov-2引起的急性传染病。目前，针对该病毒还没有有效的药物以及疫苗。因此，寻找到对新型冠状病毒有抑制效果的已上市药物具有重要意义。

新型冠状病毒基因在宿主细胞内将产生2个重叠的转录翻译产物,多聚蛋白1a与1ab。多聚蛋白经过主蛋白酶和木瓜样蛋白酶的水解后才能产生一系列具有生物功能的蛋白单体，从而完成病毒的复制和包装。以蛋白酶为靶点的抗病毒药物在hiv和hcv药物开发中取得巨大的成功，如利托那韦、达芦那韦、特拉匹韦等。因此新型冠状病毒的主蛋白酶是个理想的药物开发靶点。

gc376是由堪萨斯大学和威奇塔州立大学共同研制的病毒蛋白酶抑制剂。但是，由于gc376属于多肽类似物，在体内容易被降解，药代半衰期短，难以维持有效的血药浓度。gc376对传染性胃肠炎病毒(tgev)、小鼠肝炎病毒(mhv)、牛冠状病毒(bcv)、猫传染性腹膜炎病毒(fipv)、人冠状病毒均有抑制活性。其结构式如下：

瑞德西韦是一种吉利德公司开发的针对埃博拉病毒的核苷类似物，2020年10月22日，美国食品药品管理局(fda)批准了吉利德科学的抗病毒药物瑞德西韦用于治疗新冠住院患者，成为美国首个正式获批的新冠治疗药物。但是世卫组织表示，瑞德西韦对改善新冠肺炎住院患者病亡率影响不大，其在单独施用时抗病毒活性不够好。

技术实现要素：

本发明首次公开了化合物gc376和瑞德西韦联用可用于高效抑制(甚至完全抑制)新型冠状病毒或治疗新型冠状病毒肺炎。具体地，本发明提供了以下技术方案：

1.化合物gc376和瑞德西韦在制备用于抑制新型冠状病毒sars-cov-2的药物或试剂盒中的用途，其中gc376的结构式如下：

2.根据项目1所述的用途，其中，所述gc376的浓度为1μm-100μm。

3.根据项目1所述的用途，其中，所述瑞德西韦的浓度为1μm-100μm。

4.根据项目1所述的用途，其中，当所述gc376和瑞德西韦存在于试剂盒中时，所述gc376与瑞德西韦同时、依次或分别施用。

5.一种药物组合物(优选用于抑制新型冠状病毒sars-cov-2或治疗新型冠状病毒肺炎)，其包含化合物gc376和瑞德西韦，以及任选地药学上可接受的载体。

6.根据项目5所述的药物组合物，其中所述gc376的浓度为1μm-100μm。

7.根据项目5所述的药物组合物，其中所述瑞德西韦的浓度为1μm-100μm。

8.一种制品(优选用于抑制新型冠状病毒sars-cov-2或治疗新型冠状病毒肺炎)，其包含化合物gc376和瑞德西韦，以及任选地容器和使用说明书，所述使用说明书描述所述gc376与瑞德西韦同时、依次或分别施用，其中gc376的结构式如下：

本发明相对于现有技术具有以下优点和效果：

gc376和瑞德西韦之间具有协同作用，gc376的靶点是新冠病毒的蛋白酶，瑞德西韦的靶点是新冠病毒的rna聚合酶，2种药物作用的是病毒不同的复制阶段。将gc376和瑞德西韦进行联用之后对于新型冠状病毒的抑制效果远高于二者分别的技术效果之和，可实现完全抑制新型冠状病毒的增殖，并且通过小剂量的gc376和瑞德西韦即可实现完全抑制新型冠状病毒的效果，从而降低了大剂量施用药物对受试者的副作用。例如，如实施例4所示，低剂量(即分别为1μm)的gc376与瑞德西韦联用即可实现完全抑制新型冠状病毒的增殖，其对病毒的抑制效果远高于分别以高剂量(即，5μm)单独施用的gc376与瑞德西韦对病毒的抑制效果。

附图说明

图1显示了gc376在不同浓度下对新型冠状病毒主蛋白酶的反应曲线图；

图2显示了gc376对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制曲线图；

图3显示了gc376与新型冠状病毒主蛋白酶的复合物晶体结构；

图4显示了gc376和瑞德西韦对新型冠状病毒的抑制曲线图；

图5显示了1.6μmgc376对感染新型冠状病毒细胞的保护效果；

图6显示了感染新型冠状病毒的细胞病变图；

图7显示了gc376和瑞德西韦联用对新型冠状病毒的抑制效果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

下述实施案例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规实验方法。下述实施案例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

本发明的术语

在本发明中，术语“药学上可接受的载体”是指药物制剂中的活性成分以外的成分，其对受试者是无毒的。药学上可接受的载体包括，但不限于，缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

在本发明中，“容器”可采用通常药物中所使用的类型和形状，例如可以为瓶状、管状、罐状等，其材质可以是玻璃或有机聚合物或其他药物可接受的材质；或者是任何其他的本领域技术认可的药物可用的类型。

在本发明的具体实施方案中，所使用的gc376化合物可通过商购获得(例如购自陶素生化)，其浓度为1μm-100μm；具体地，所述浓度可以是1.00μm-1.10μm、1.00μm-1.20μm、1.00μm-1.30μm、1.00μm-1.40μm、1.00μm-1.50μm、1.00μm-1.60μm、1.00μm-1.70μm、1.00μm-1.80μm、1.00μm-1.90μm、1.20μm-1.50μm、1.20μm-1.60μm、1.20μm-1.80μm、1.20μm-2.00μm、1.30μm-1.50μm、1.30μm-1.60μm、1.30μm-1.80μm、1.30μm-2.00μm、1.40μm-1.60μm、1.40μm-1.80μm、1.40μm-2.00μm、1.50μm-1.80μm、1.50μm-2.00μm、1.60μm-1.80μm、1.60μm-2.00μm、1.70μm-1.80μm、1.70μm-1.90μm、1.70μm-2.00μm、1.80μm-1.90μm、1.80μm-2.00μm、1.90μm-2.00μm、3μm-8μm、5μm-15μm、10μm-20μm、10μm-30μm、10μm-40μm、10μm-50μm、20μm-30μm、20μm-40μm、20μm-50μm、50μm-80μm、50μm-100μm、80μm-100μm；更具体地，所述浓度可以是1.00μm、1.05μm、1.10μm、1.15μm、1.20μm、1.25μm、1.30μm、1.35μm、1.40μm、1.45μm、1.50μm、1.55μm、1.60μm、1.65μm、1.70μm、1.75μm、1.80μm、1.85μm、1.90μm、1.95μm、2.00μm、2.05μm、2.06μm、2.10μm、2.20μm、2.30μm、2.40μm、2.50μm、2.60μm、2.70μm、2.80μm、2.90μm、3.00μm、3.10μm、3.20μm、3.30μm、3.40μm、3.50μm、3.60μm、3.70μm、3.80μm、3.90μm、4.00μm、4.10μm、4.20μm、4.30μm、4.40μm、4.50μm、4.60μm、4.70μm、4.80μm、4.90μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm或100μm。

在本发明的具体实施方案中，所使用的瑞德西韦可通过商购获得(例如购自吉利德)，其浓度为1.00μm-100.00μm；具体地，所述浓度可以是1.00μm-2.00μm、1.00μm-3.00μm、1.00μm-4.00μm、2.00μm-3.00μm、2.00μm-4.00μm、2.00μm-5.00μm、3.00μm-4.00μm、3.00μm-5.00μm、4.00μm-5.00μm、5μm-10μm、10μm-20μm、10μm-30μm、10μm-40μm、10μm-50μm、20μm-30μm、20μm-40μm、20μm-50μm、50μm-80μm、50μm-100μm、80μm-100μm；更具体地，所述浓度可以是1.00μm、1.05μm、1.10μm、1.15μm、1.20μm、1.25μm、1.30μm、1.35μm、1.40μm、1.45μm、1.50μm、1.55μm、1.60μm、1.65μm、1.70μm、1.75μm、1.80μm、1.85μm、1.90μm、1.95μm、2.00μm、2.10μm、2.20μm、2.30μm、2.40μm、2.50μm、2.60μm、2.70μm、2.80μm、2.90μm、3.00μm、3.10μm、3.20μm、3.30μm、3.40μm、3.50μm、3.60μm、3.70μm、3.80μm、3.90μm、4.00μm、4.10μm、4.20μm、4.30μm、4.40μm、4.50μm、4.60μm、4.70μm、4.80μm、4.90μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm或100μm。

实施例1gc376对新型冠状病毒主蛋白酶活性的抑制效果

试验方法：

用pbs溶液将20mm的gc376(陶素生化targetmol，货号：t5188)溶液进行稀释，得到浓度分别为1000μm、200μm、40μm、8μm、1.6μm、0.32μm的gc376溶液。

在黑色96孔板分别加入10μl上述稀释后的各浓度的gc376溶液，每个浓度重复3个孔，再加入30μl的3μm新型冠状病毒主蛋白酶(购自苏州金斯瑞)溶液。同时设对照组：其中，阴性对照组为加入10μlpbs溶液和30μl的3μm新型冠状病毒主蛋白酶溶液，重复3个孔；空白对照组为加入40μlpbs缓冲液，重复3个孔。然后将黑色96孔板放入37度培养箱孵育30分钟。然后向每个孔中加入10μl的20μm底物(dabcyl-tsavlqsgfrkme-edans，购自苏州金斯瑞)溶液，其中新型冠状病毒主蛋白酶可水解该底物释放荧光，从而通过检测荧光来反映酶活性。立即用酶标仪测量60分钟内每分钟的荧光值(ex340nm、em490nm)，每个孔共测量61次。

用graphpadprism软件绘制横坐标为时间、纵坐标为荧光值的蛋白酶反应曲线图，并计算30分钟内酶反应速率v。阴性对照的酶反应速率作为vmax，将加入不同浓度gc376后的酶反应速率作为vx，空白对照的荧光变化速率为v0，则不同浓度gc376对酶反应活性的抑制率为1-(vx-v0)/(vmax-v0)×100％。然后用graphpadprism分析作图后得到gc376对主蛋白酶的ic50值。

由图1可知，在40μm或200μmgc376存在时，主蛋白酶的活性被完全抑制；在8μmgc376存在时，主蛋白酶的活性被抑制了85％。图2结果显示了gc376对新型冠状病毒主蛋白酶活性的半数抑制浓度为2.06μm。

实施例2gc376与主蛋白酶的复合物晶体结构

试验方法：将20mm的gc376溶液(100％dmso溶解)按照1:100的比例加入到10mg/ml的主蛋白酶溶液中，然后4℃孵育过夜。孵育结束后，12,000rpm离心1h收集上清液。采用悬滴法将1μl上清液与1μl池液混合，并在中间凹槽中加入100μl池液(hampton公司)(所述池液含有10％peg6000,100mmmes(ph6.1)和3％dmso)，然后放置于18℃恒温晶体培养室每天使用显微镜观察晶体的生长情况。一天后出现gc376与主蛋白酶的复合物晶体。

从图3中可以看出gc376占据了主蛋白酶的酶活中心位点，并且与主蛋白酶的催化残基145位半胱氨酸形成了共价键，从而阻止了主蛋白酶水解其底物，明确了gc376的作用机制。

实施例3gc376在细胞水平对病毒的抑制效果

试验方法：

用dmem培养基将20mm的gc376进行梯度稀释，得到浓度分别为200μm、40μm、8μm、1.6μm、0.32μm、0.064μm、0.0128μm、0.00256μm的溶液。同时，将10mm的瑞德西韦溶液(陶素生化)用dmem培养基稀释成100μm、20μm、4μm、0.8μm、0.16μm、0.032μm溶液作为阳性对照。用dmem培养基将100％的dmso稀释成1％dmso培养基溶液作为空白对照。

在生物安全柜内用dmem稀释新型冠状病毒(来自中国疾病预防中心)至0.01moi(感染复数)。将长满非洲绿猴肾细胞vero细胞(购自上海细胞所)的96孔板拿至生物安全柜。向96孔板每个孔中加入100μl的0.01moi病毒溶液，同时向3个孔加入100μl的dmem(作为未感染组)，放入到co2培养箱中培养2h。在生物安全柜内将病毒上清液吸弃，并用pbs清洗，然后向不同孔中加入100μl上述稀释后的含不同浓度gc376的培养基溶液、含有瑞德西韦的培养基溶液(阳性对照)或100μl1％dmso培养基溶液(空白对照)。同时，向未感染组加入含1％dmso的培养基溶液。每个浓度梯度重复3遍。将细胞培养板移出生物安全柜，放入co2培养箱中，5％co2、37℃下培养。48小时后裂解细胞，提取rna，进行rt-pcr检测ct值。72小时后，将96孔板拿出培养箱，用显微镜观察(注意：小心操作，以防瓶内感染性液体泄露)，记录细胞病变情况并进行拍照。

图4结果显示gc376对新型冠状病毒具有较好的抑制活性，对新型冠状病毒的半数抑制浓度ec50达到0.70μm。在1.6μmgc376存在下，感染了新型冠状病毒的细胞没有观察到明显的病变(图5)，而没有加入gc376的细胞，在感染了新型冠状病毒后出现了明显的细胞病变(图6)。这表明1.6μm的gc376可以有效抑制新型冠状病毒的增殖。

实施例4gc376与瑞德西韦联合抗新冠病毒实验

vero细胞铺24孔板(50000细胞/孔)，24h后再利用100pfu的病毒进行孵育感染2h。感染后，单层细胞分别用含有5μmgc376、1μmgc376、5μm瑞德西韦、1μm瑞德西韦、1μmgc376+1μm瑞德西韦以及不加药物的avicell培养基进行固定(每组4个重复)。将板子放置于37℃培养72h后，4％多聚甲醛固定后用1％结晶紫染色后拍照(见图7)。从实验结果可以看出1μmgc376+1μm瑞德西韦可以明显地抑制(或基本完全抑制)新型冠状病毒的增殖。

按照实施例4的操作方法，施用1μmgc376+100μm瑞德西韦组合以及施用100μmgc376+1μm瑞德西韦组合也可实现类似的技术效果，可基本完全抑制新型冠状病毒的增殖。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。