一种治疗肾炎的中药组合物及其医药用途的制作方法

本发明的目的是提供一种治疗肾病，包括过敏性紫癜性肾炎、慢性肾炎等的中药组合物及其制备方法和医药用途，其特征为含白僵蚕、蝉蜕、姜黄和大黄。其制备方法特征在于粉碎混合使用；或用溶剂提取，浓缩成浸膏，或经过乙醇沉淀取上清液减压浓缩成浸膏，以浸膏使用；或进一步干燥为粉末使用。
背景技术：
：过敏性紫癜性，是由感染、食物所引起的一种毛细血管变态疾病；以坏死性小血管炎为主要病理改变，可累及全身多器官。过敏性紫癜性引起的肾损害成为过敏性紫癜性肾炎，临床表现除有皮肤紫癜、关节肿痛、腹痛、胃肠道黏膜出血、便血外，主要为血尿、蛋白尿和肾功能异常等，严重威胁患者的生命健康。目前西医的治疗方法主要采用免疫抑制剂、糖皮质激素、细胞毒药物等，治疗效果欠佳且副作用大，而中医治疗讲究辨证施治，标本兼治，疗效确切，安全可靠且复发率低，故而本领域技术人员致力于开发副作用小，使用安全，疗效可靠的治疗过敏性紫癜性肾炎的药物，以满足临床需求。技术实现要素：本发明的目的是提供一种治疗过敏性紫癜性肾炎的中药组合物及其应用，其使用方便、效果显著、副作用小。本发明根据药理学筛选发现可以治疗慢性肾炎等疾病过敏性紫癜性肾炎，药理学研究结果见实施例。本发明提供一种中药组合物，所述组合物由白僵蚕、蝉蜕、姜黄和大黄为中药原料药制备而成。其中，所述中药原料药最优为各自的炮制品，即：酒炒白僵蚕，去土全蝉蜕，去皮姜黄，生川大黄。所述原料药的重量份如下表1，最优组合如表2：表1.复方配伍剂量表2.复方配伍最佳剂量序号原料名称重量份1白僵蚕62蝉蜕33姜黄94大黄12本发明所述中药组合物，是将所述中药原料药经过提取加工得到中药提取物，然后以中药提取物为药物活性物质，经过制剂学加工，得到的可供服用的中药制剂。本发明所述的中药提取物，其中含有乙酰多巴胺多聚体类成分，至少包括化合物1，2，3三种化合物，三种化合物的含量之和大于0.05％，优选的，三种化合物的含量之和大于等于0.3％，最优选的，三种化合物的含量之和在0.3％-98％之间。本发明进一步提供所述中药提取物的制备方法，其特征在于其制备方法特征在于粉碎混合使用；或用溶剂提取，浓缩成浸膏，或经过乙醇沉淀取上清液减压浓缩成浸膏，以浸膏使用；或浸膏进一步干燥为粉末使用。其中溶剂是指由水和/或与水相容的溶剂(如醇，优选为乙醇)所构成的混合溶剂，其中水含量为0-100％，优选为水含量为30％。上述中药提取物的制备方法，其特征在于提取方式包括渗漉法、煎煮法、回流法、溶剂提取法(包括但不限于超声提取、连续超声震荡提取)，优选为溶剂提取法中的回流法和连续超声震荡提取。上述中药提取物的制备方法，其特征在于加溶剂4-20倍，室温提取3-24小时，回流/加热提取1-5小时，提取1-4次。优选为加溶剂6-10倍，室温提取2-4小时，回流/加热提取为1-2小时，提取2-3次。上述中药提取物的制备方法，其特征在于上述所得中药组合物提取液，提取后加压浓缩，冷却后加入乙醇至乙醇浓度达到40％-90％沉淀，离心，取上清液过滤，减压浓缩成浸膏，或干燥成粉末。其中，乙醇沉淀浓度优化为60％-85％，最佳为60％。本发明所述的中药组合物，可以是任何可服用的药物制剂形式，如片剂，胶囊，注射剂等。本发明进一步包括所述中药提取物，中药组合物的医药用途，可用于治疗肾病，包括过敏性紫癜性肾炎、慢性肾炎等。附图说明图1he染色结果图(a)空白组；(b)模型组；(c)醋酸泼尼松组；(d)雷公藤多苷片组；(k-m)中药提取物sjs组图2pas染色结果图(a)空白组；(b)模型组；(c)醋酸泼尼松组；(d)雷公藤多苷片组；(k-m)中药提取物sjs组图3不同组别hspn大鼠血清iga水平的影响和免疫荧光染色法观察iga在肾小球中的沉积图(a)对hspn大鼠血清iga水平的影响(*p<0.05,**p<0.01).(b)免疫荧光染色法观察iga在肾小球中的沉积(a)空白组；(b)模型组；(c)醋酸泼尼松组；(d)雷公藤多苷片组；(k-m)中药提取物sjs组图4各组别对肾脏tgf-β1表达水平的影响(a)空白组；(b)模型组；(c)醋酸泼尼松组；(d)雷公藤多苷片组；(k-m)中药提取物sjs组图5采用westernblot分析mcp-1,iga和tlr4在大鼠肾脏中的表达结果图(a)空白组；(b)模型组；(c)醋酸泼尼松组；(d)雷公藤多苷片组；(k-m)中药提取物sjs组图6溶剂、化合物1(1)、化合物2(2)、化合物3(3)、混合对照品uplc色谱图(从下至上)具体实施方式(包括并不仅限于以下实施例)实施例1中药提取物sjs的制备取所述粉碎的原料药粉末共5kg，具体如下表所示，加入50l水，连续震荡提取，室温提取4h，100℃提取1h，提取后冷却静置，取上清液离心，过滤，减压干燥成浸膏，即得中药提取物sjs(a)。序号原料名称重量1酒炒白僵蚕1.0kg2去土全蝉蜕0.5kg3去皮姜黄1.5kg4生川大黄2.0kg实施例2中药提取物sjs的制备取所述粉碎的原料药粉末共9.1kg，具体如下表所示，加入40l水，连续震荡提取，室温提取4h，100℃提取1h，提取后减压浓缩，进一步冷冻干燥成粉末，即得中药提取物sjs(b)。序号原料名称重量1白僵蚕3.0kg2蝉蜕0.1kg3姜黄3.0kg4大黄3.0kg实施例3中药提取物sjs的制备取所述粉碎的原料药粉末共3.3kg，具体如下表所示，加入50l的95％乙醇，连续震荡提取，室温提取4h，100℃提取1h，提取后减压浓缩，冷却后加入乙醇至乙醇浓度达到60％沉淀，离心，取上清液过滤，减压浓缩成浸膏，浸膏水溶解，上到大孔树脂柱，55％乙醇水洗脱后洗脱液a弃去，继用60％乙醇水洗脱，回收乙醇洗脱液b，回收溶剂，减压干燥成粉末，即得中药提取物sjs(c)。序号原料名称重量1酒炒白僵蚕0.1kg2去土全蝉蜕3.0kg3去皮姜黄0.1kg4生川大黄0.1kg实施例4治疗过敏性紫癜性肾炎(hspn)实验1.实验动物分组、给药方案及标本的采集实验动物分组、给药方案：选取健康清洁型雄性sd大鼠140只，体重为120～150g。所有大鼠适应性喂养l周，造模前两次尿蛋白定性试验均呈阴性(试纸条法)。将入选的140只sd大鼠(雄性)以随机数字表法分为空白组20只、模型组9只(12周末处理5只)、西药阳性药物组9只、中药阳性药物组9只、升降散组(中药组合物sjs(a))分为低剂量k、中剂量l、高剂量m组，10只/组，给药方案如表3所示。表3给药方案组别药物给药剂量按每只老鼠300g算给药体积给药浓度空白组a模型组b西药阳性药c醋酸泼尼松片6.3mg/kg1.9mg/只2ml1mg/ml中药阳性药d雷公藤多苷片9.4mg/kg2.8mg/只2ml1.4mg/ml低剂量k中药组合物sjs5g/kg1.5g/只2ml0.75mg/ml中剂量l中药组合物sjs10g/kg3g/只2ml1.5mg/ml高剂量m中药组合物sjs20g/kg6g/只4ml1.5mg/ml动物模型的建立：运用牛血清白蛋白(bsa)+脂多糖(lps)+ccl4方法造就iga肾病模型：以蒸馏水配制免疫原bsa，隔天灌胃4ml/kg，持续8周；皮下注射蓖麻油0.3ml+ccl40.1ml，每周1次，持续9周；以生理盐水配制0.025％lps，于第6、8、10、12周尾静脉注射0.2ml/只；于此同时造就瘀热模型，复合为hspn大鼠模型：于第9周幵始隔天灌服25％干姜水10ml/kg，持续4周；建模期间将室温调节至30℃。空白组以等量蒸馏水灌胃，等量生理盐水皮下或尾静脉注射，生存温度为正常室温。第12周末造模结束。标本的采集：尿样本的收集：实验结束(实际19周末)用代谢笼收集所有实验大鼠24h尿液，记录24h尿量，分装后新鲜尿液送检测定。血样本收集：实验结束(第16周末)(实际19周末)，用2％戊巴比妥钠0.3ml/100g麻醉，开腹分离腹主动脉，用普通管收集(一般每只老鼠能收集2管7～8ml血)，4000r/min离心15min，取上清液血清放在-20℃，供测血生化指标。组织取材：取双侧肾组织、心脏、肺脏、肝脏、脾脏和睾丸等，在清洁pbs轻轻摇动，洗去血液称重。肾脏分四块，一部分放入4％多聚甲醛(4％pfa)中固定供病理变化(he染色、pas染色、iga免疫荧光)组织切片及免疫荧光、免疫组化石蜡切片用。另一侧肾脏分离肾皮质后锡箔纸包好，标记后在液氮储存，为pcr、wb实验用。2.实验结果尿液指标检测结果：空白组、模型组、阳性对照组以及升降散给药组的尿样本检测结果如下：表4尿生化结果(n＝8,mean±sd)注：与模型组比：**p<0.01,*p<0.05表4结果表明，阳性药组和模型组相比，尿液中tp，bun，scr含量显著降低，升降散组和模型组比较，尿液中tp，bun，scr含量也显著降低，说明阳性药组和升降散组治疗效果显著，且升降散中剂量组和中药阳性药组治疗效果基本相同，升降散高剂量组治疗效果优于西药阳性药。血清指标检测结果：血清中alb(血清白蛋白)、alt(谷丙转氨酶)、ast(谷草转氨酶)、tp(总蛋白)、tchol(血清总胆固醇)、tg(甘油三酯)、bun(尿素氮)、scr(血肌酐)、glob(球蛋白)含量结果如下：表5血清指标结果(n＝8,mean±sd)注：与模型组比：**p<0.01,*p<0.05表5结果表明，阳性药组和模型组相比，alb、alt、ast、tp、tchol、tg、bun、scr和glob含量均显著降低，且西药阳性药的效果优于中药阳性药；升降散组和模型组比较，alb、alt、ast、tp、tchol、tg、bun、scr和glob含量也均显著降低，且剂量越高，治疗效果越好。另外，升降散组中剂量和中药阳性药治疗效果基本一致，高剂量组和西药阳性药治疗效果基本一致，均有明显的改善作用。he染色结果：由图1结果可得，空白组肾被膜完整，未见结缔组织增生及炎性渗出；未见皮质内脊小球变性、坏死，系膜细胞增生，系膜区扩大等情况；肾小管无玻璃样变和坏死，肾孟粘膜完整，未见变性、坏死、脱落。模型组皮质内肾小球系膜细胞増生，系膜区扩大；大部分肾小管细胞肿胀，空泡变性明显，间质灶性慢性炎细胞浸润。中药阳性药组和西药阳性药组肾小管上皮细胞肿胀较轻，远端小管管腔扩张不明显，肾小管腔内仅见少许透明管型，间质轻度充血水肿，未见明显炎症细胞浸润。升降散组体积增大明显，暗红色，有少量红色小点散布在肾脏表面，切面皮髓质分界较正常欠清，髓质色浅淡。高剂量组肾小管腔内仅见少许透明管型，间质轻度充血水肿，未见明显炎症细胞浸润，中剂量组和低剂量组皮细胞肿胀、毛细血管充血、肾小管内蛋白管型，少许肾小管上皮细胞坏死，可见灶状淋巴细胞、浆细胞浸润。pas染色、iga和tgf-β1表达结果：由图2结果显示，pas染色后，空白组镜下肾小球系膜、基膜无增生，肾小球未见硬化。模型组可见肾小球系膜明显增生，肾小管肿胀，伴见节段性肾小球硬化，肾小球血管襻坍陷，血管周围有炎性细胞浸润。阳性药组较模型组比较，肾小球系膜增生和阶段性肾小球硬化明显改善，血管周围基本无炎性细胞浸润。升降散组特别是高剂量组较模型组，肾小球系膜增厚显著改善，无明显炎症细胞浸润。由图3a结果显示，与模型组相比，阳性药组和升降散组的iga水平均显著降低，但升降散低中高剂量组无明显差异。由图3b免疫荧光染色显示，模型组的系膜iga明显积聚，而阳性药组和升降散组iga积聚显著降低。由图4和表6结果可得，空白组大鼠胞浆有散在黄色物质，呈弱阳性改变；模型组tgf-β1表达呈强阳性反应，有明显的棕黄色颗粒物质；与模型组比较，中药阳性组和西药阳性组tgf-β1表达明显下降；升降散组tgf-β1表达较模型组明显下降，且高剂量组和西药阳性药组的治疗效果无显著性差异。表6不同组别tgf-β1表达结果表mcp-1,iga和tlr4表达结果：由图5结果可得，模型组和空白组比较，iga、tlr-4、mcp-1均显著上调，说明造模成功；阳性药组和模型组比较，iga、tlr-4、mcp-1均下调，升降散低中高剂量组特别是高剂量组iga、tlr-4、mcp-1均显著下调，说明高剂量组的治疗效果优于阳性药组，且低中高剂量存在剂量依赖性。实施例3治疗慢性肾炎实验实验动物分组、给药方案：选取健康清洁型wistar雄性大鼠大鼠130只，体重为200g，放入动物房适应环境1-2天后，将大鼠按随机数字表法分为空白组、模型组，中药阳性药，西药阳性药和中药提组合物组，共计7组，空白组10只，其他每组各20只造模后分组。(手术动物死亡率较高，因此造模时按照每组20只造模)。给药方式为灌胃给药，给药频率为每天一次，连续给药4周(28天)；给药方案如表7所示。表7给药方案慢性肾炎(ckd)动物模型的建立：ckd大鼠制备：购入wistar雄性大鼠(200g)，放入动物房适应环境1-2天后，在0.2％戊巴比妥钠溶液麻醉下，摘除2/3左肾后，缝合。待7天，伤口愈合后，麻醉下摘除整个右肾，从而制成慢性肾病大鼠模型。标本的采集：尿样本的收集：实验结束(第4周末)用代谢笼收集所有实验大鼠24h尿液,记录24h尿量，分装后新鲜尿液送检测定。血样本收集：实验结束(第4周末)，眼底静脉取血，用普通管收集(一般每只老鼠能收集2管7～8ml血)，4000r/min离心15min，取上清液血清放在-20℃，供测血生化指标。3.实验结果尿液指标检测结果：表8尿生化结果(n＝8,mean±sd)注：与模型组比：**p<0.01,*p<0.05.由表8结果可得，阳性药组和模型组相比，尿液中bun，scr含量显著降低，升降散组和模型组比较，尿液中tp，bun，scr含量也显著降低，说明阳性药组和升降散组治疗效果显著，且升降散中剂量组和中药阳性药组治疗效果基本相同，升降散高剂量组治疗效果和西药阳性药基本相同。血清指标检测结果：检测alt(谷丙转氨酶)、ast(谷草转氨酶)、总蛋白(tp)、bun(尿素氮)、scr(血肌酐)的含量。表9血清指标结果(n＝8,mean±sd)注：与模型组比：**p<0.01,*p<0.05由表9可得，阳性药组和模型组相比，alt、ast、tp、bun、scr含量均显著降低，且西药阳性药的效果优于中药阳性药；升降散组和模型组比较，alt、ast、tp、bun、scr含量也均显著降低，且剂量越高，治疗效果越好。另外，升降散组中剂量和中药阳性药治疗效果基本一致，高剂量组的治疗效果优于西药阳性药。实施例5中药提取物的含量测定供试品溶液的制备精密称取中药提取物样品粉末约20mg(其它提取物根据含量折算称量的重量)，置具塞三角瓶中，精密加入70％甲醇5ml，精密称定质量，室温下超声处理0.5h，取出冷却至室温，用70％甲醇补足减少的质量，摇匀后静置，取上清液离心，离心后取上清液1ml至10ml容量瓶中，水定容至刻度，摇匀，取10ml上到经预处理的ods-spe小柱，先用水洗10ml弃去，继用50％meoh洗脱约5ml至5ml容量瓶，50％meoh定容至刻度，摇匀后，过0.22μm滤膜，即为供试品溶液。对照品溶液制备：精密称取化合物1、2、3对照品适量，用50％甲醇配制成质量浓度分别为化合物1(4.167μg·ml-1)，化合物2(3.27μg·ml-1)，化合物3(2.69μg·ml-1)的混标溶液。uplc色谱条件色谱柱：acquityuplcbehc18(1.7μm，2.1mm×5.0mm)；柱温：30；流动相：乙腈-水梯度洗脱，洗脱过程(％乙腈)0～2min12％～12％，2～8min12％～15％，8～8.5min15％～100％，8.5～10.5min100％～100％，10.5～11.0min100～12.0％，11.0～13min12％～12％；流速：0.2ml/min；记录时间13min；进样量：1μl；检测波长选择在280nm处测定。在此条件下蝉蜕供试品中对照品化合物1(1.(2r,3s)-2-(3',4'-dihydroxyphenyl)-3-acetylamino-7-(n-acetyl-2"-aminoethyl)-1,4-benzodioxane[3])、2(2.(2r,3s)-2-(3',4'-dihydroxyphenyl)-3-acetylamino-6-(n-acetyl-2"-aminoethyl)-1,4-benzodioxane[3])、3(3.(2r,3s)-2-(3',4'-dihydroxyphenyl)-3-acetylamino-7-(n-acetyl-2"-aminoethylene)-1,4-benzodioxane[4])与其他组分能达到基线分离，分离色谱图见图6。中药提取物的含量测定取实施例1的提取物样品a和实施例2的提取物样品b、提取物样品c，按供试品溶液制备方法，按色谱条件测定，计算含量，结果见表7。表7组合物中3种成分的含量测定结果样品化合物1(mg/g)化合物2(mg/g)化合物3(mg/g)提取物a57.849.653.2提取物b0.090.070.04提取物c384.2289.5323.5当前第1页12