一种猫用眼睛凝胶及其制备方法与流程

本发明生物医药
技术领域：
，具体地说，涉及一种猫用眼睛凝胶及其制备方法。
背景技术：
：近年来，随着我国经济的快速发展，我国出现养殖宠物热潮，我国现有养殖宠物3亿只以上，其中犬猫占宠物总量的60～70％，大陆地区猫的数量在0.5-0.8亿只以上。随着猫养殖数量的增多，患病也随之增多，各种疾病的发病率和死亡率增高，且一年四季均有发生，严重威胁猫的健康，给养猫业带来极大的经济损失。目前猫临床疾病的防控多使用抗生素及抗菌药物，实际生产中存在抗生素使用不科学和滥用等问题，从而导致细菌耐药性和宠物体内药物残留超标等问题日益突出，引起世界各国政府及业内人士的高度重视。decb眼用凝胶最先由瑞士solco制药研发生产，商品名素高捷疗(solcoseryl)，于欧洲市场率先上市。素高捷疗眼膏是一种凝胶状的滴眼液，呈透明状，适用于眼干燥症及结膜、角膜溃疡或损伤。该滴眼凝胶是由小牛血提取物、凝胶基质及防腐剂组成。小牛血提取物含有小分子肽、氨基酸和无机盐。该眼药能促进眼部创伤愈合，对中轻度眼干燥症患者，能起到润湿、润滑和营养的作用。素高捷疗眼用凝胶自80年代进入我国，在临床上广泛应用。宠物眼科疾病近年激增，临床眼用制剂销量一直占据宠物用药前几位，需求很大，我国尚无宠物厂家生产此类眼膏，并且受欧洲疯牛病的影响，此类产品进口困难，价格昂贵。现在常见的生产眼用凝胶的主要原料为小牛血去蛋白提取物。小牛血去蛋白提取物，是一种从小牛血中分离提取得到的小分子生物活性物质，具有组织细胞修复及增殖作用，可广泛用于各种原因造成的皮肤、角膜溃疡、褥疮、烧伤、皮肤移植、伤口糜烂的愈合。但是由于牛血清提取物中存在很多牛源的蛋白、多糖、糖肽等成分，在具体宠物的应用时，会造成宠物的过敏反应，严重的甚至会造成休克或者死亡，严重影响了上述药物在宠物治疗中的应用。而且由于牛可能携带疯牛病、口蹄疫等多种病毒，会给后续的宠物治疗带来临床应用的安全隐患。在临床实践中，在宠物医疗界有句非常通俗的话“猫不是小体型的犬”，对于不同的宠物如果不加区别的使用同一种药物往往会出现效果差异明显的现象，这已经成为宠物临床研究的热点和重点。例如，布洛芬是一种具有强镇痛、抗炎和解热作用的取代苯基烷酸，常用在犬只的关节炎和肌肉骨骼疼痛的治疗当中，但是却不适用于猫的治疗中，这是因为它们生成葡糖醛酸苷的能力有限，会导致肝、肾功能衰竭和胃肠道溃疡或穿孔。因此开发适用于特定宠物种类的药物，尤其是专用药物更是现阶段期待解决的技术问题。因此，本领域亟需一种专门适用于宠物猫的眼部疾病治疗用凝胶来代替昂贵的decb眼用凝胶，从而获得适合中国国情的宠物眼用凝胶，使之广泛的应用在宠物的治疗过程中。技术实现要素：本发明提供一种宠物猫专用眼睛凝胶，所述凝胶按重量计，包括：犬血清去蛋白提取物5-10％，羧甲基纤维素钠0.1％-0.5％，透明质酸0.1％-3％，甘油0.1％-3％，尼泊金甲酯0.1-1％、尼泊金乙酯0.1-1％、冷结胶0.1-0.5％、黄原胶0.1～0.5％，小分子硫酸软骨素5-10％，卵磷脂3-5％、胆固醇1-1.5％、维生素d0.1-0.5％、维生素e0.1-0.5％、α-硫辛酸0.1-0.6％，注射用水，调ph值为6.4-7.4。进一步的，本发明提供一种宠物猫专用眼睛凝胶的制备方法，其具体制作步骤如下：7)按照比例分别称取卵磷脂、胆固醇、维生素d、维生素e、α-硫辛酸，置于悬蒸瓶，混合均匀将其溶于甘油溶液中；待其充分溶解后，加入少量注射用水，搅拌均匀，水化1h，超声3min，紫外灭菌后完成后放至室温备用；8)取1l容器，加入羧甲基纤维素钠搅拌分散均匀；9)注射用水加热后溶解尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、透明质酸、冷结胶、黄原胶、小分子硫酸软骨素；10)将步骤3与步骤2的溶液混合搅拌，待羧甲基纤维素钠完全溶解后，过滤不溶物，置密封容器内，100℃30min流通蒸汽灭菌，完成后放至室温备用；11)取犬血清去蛋白提取物，0.22um微孔过滤器除菌过滤，无菌条件下与步骤4所得溶液混合，均质搅拌均匀；12)无菌条件下将步骤1与步骤5所得溶液混合，均质搅拌均匀，无菌分装，既得。本发明所获得的凝胶有机溶剂残留量低(经检测，乙醇残留量≤30ppm或更低)、且凝胶强度大于或等于1000g/cm2。而且本发明所制备的为离子敏感即型凝胶，该制剂以溶液形态给药，在眼部生理条件下发生相变。在水溶液中，它分子中的羰基能与阳离子(na+、k+、ca2+、mg2+等)结合，从无规则线团结构转变为双螺旋结构，然后双螺旋结构发生逆向聚集，从而形成三维网状凝胶结构，由溶液转变为半固体凝胶，从而延长药物眼部保留时间，减少给药次数，提高治疗效果；同时减少吸收进入循环系统的药量，减轻药物不良反应。本发明的凝胶中，羧甲基纤维素钠表面活性高，制成凝胶滴入眼后形成一层保护膜，并且与透明质酸联用可增大表面粘性，能使所含修复成分犬血清去蛋白提取物更好的附着在眼球上，修复伤口和溃疡面。而且羟丙基甲基纤维素溶于冷水中形成一定粘度的溶液，性质与泪液的粘弹性物质(粘蛋白)接近，可作为人工泪液使用。羟丙基甲基纤维素在滴眼剂中使用，能降低滴眼剂的表面张力，增加对角膜的通透性，增加药物的吸收，提高生物利用度。甘油有润滑保湿作用，可减轻眼睑闭合摩擦患处带来的疼痛，改善眼部炎症带来的干燥，从而防止眼部继发性损伤。透明质酸钠通过促进表皮细胞的增殖和分化，以及清除氧自由基的作用，可促进受伤部位皮肤的再生，协助修复角膜问题。尼泊金甲酯、乙酯作为抑菌剂使用，其中尼泊金甲酯对各类霉菌、酵母菌、细菌有效；尼泊金乙酯对于真菌抑制作用较强，少量使用可用于治疗真菌性角膜溃疡；两者混合使用，有良好的协同和加成。硫酸软骨素是一种大分子酸性粘多糖类，其钠盐、钾盐、钙盐、锌盐等广泛应用于医药、保健产品、食品、化妆品、饲料中，可以用于治疗多种疾病，治疗骨关节炎、关节疼痛、高血脂症、高胆固醇、冠心病、动脉硬化、心绞痛、心肌缺血、心肌梗死、肿瘤、神经损伤、神经性头痛、神经痛、角膜炎、角膜溃疡、角膜损伤等疾病；还可以和氨基葡萄糖、抗坏血酸锰等药物联用，起到良好的防治关节炎的作用。本申请中的小分子硫酸软骨素的平均分子量为3000-5000d，克服了普通的硫酸软骨素制剂存在分子量波动大、口服吸收差、生物利用度低、疗效不稳定等缺点。通过实验发现，本申请中的特定分子量的小分子硫酸软骨素的药理活性最强，对防治动脉粥样硬化、风湿性炎症和伤口愈合等方面具有更好的疗效，具有更好的临床疗效。本产品中的卵磷脂、胆固醇、维生素d、维生素e可抗氧化，活化神经、促进细胞代谢，而α-硫辛酸除了本身就具有较强的抗氧化能力外，还可以有效的促进维生素正在体内的再循环，因此可以维持体内的维生素浓度，让维生素发挥适当的抗氧化功能，已有研究证实，当宠物猫体内缺乏上述维生素时，眼睛的微血管会充血并使眼睑有所缩小，眼肌不柔润，容易出现各种眼睛症状。本发明的眼用凝胶加速6个月内能持久稳定，未见新增杂质产生，安全有效、质量可控。进一步的，本发明提供上述凝胶在宠物治疗中的应用，所述应用为宠物猫眼部各种病因引起的角膜、结膜的创伤、炎症及溃疡。有益效果本发明提供的宠物猫专用眼用凝胶是专门针对患猫使用的眼用凝胶，由于其主要成分为犬血清去蛋白提取物，因此不会产生排斥性或者其他的过敏反应，提高治疗效果。眼用凝胶的疗效与进口产品类似，可以替代进口，能够解决患宠痛苦、减轻宠主经济压力，同时提高研制能力和公司形象，影响深远。本产品中针对患病猫所添加的小分子硫酸软骨素、卵磷脂、胆固醇、维生素d、维生素e和α-硫辛酸的特定比例都是针对与患病猫的特定生理状态，由于猫的体型较常见的犬要小，体重和体表面积都有差别，因此这种特定的用量更适合较为轻盈和小巧的猫咪使用，不会出现由于使用量大而产生副作用。附图说明图1患病猫使用本申请的凝胶前的临床图片图2患病猫使用本申请的凝胶后的临床图片具体实施方式实施例1犬血清去蛋白提取物的制备所述方法具体为：①原料处理：在无菌条件下采3-5个月龄的清洁级beagle犬的静脉血，用搅拌器进行搅拌，搅拌速度15～100转/分钟，搅拌时间1～5分钟，尽量消除纤维蛋白原对血液凝固和后续操作中的影响，放于4℃冰箱中过夜，使其自然分离出血清i；剩余部分在无菌条件下，1000rpm，4℃离心10-30分钟，分离出血清ii。将血清i和血清ii混合后利用-20℃-40℃反复冻融2次后，利用纱布粗滤，收集滤过液；②离心：将初滤后的犬血清以8000rpm离心20min，收集上清液，初步去除血清中残留的脂类、免疫球蛋白、内毒素、血红蛋白等杂质。③预过滤：离心后的上清液用500kd超滤柱过滤加压过滤，得澄清滤液。用北京旭邦膜设备有限责任公司clw-003型中空纤维超滤膜组件，美国spectrum公司截留分子量500kd超滤柱，充分透析。血清粘度很大，超滤柱过滤面积应不小于50m2。④亲和过滤：利用cona亲和柱纯化去除内毒素。cona填料采用conasepharose4b(gehealthcare公司生产)。平衡缓冲液：20mmtris-hcl，0.5mnacl，ph7.4。洗脱缓冲液：硼酸-硼砂缓冲液，0.1m，ph6.5。具体方法：将步骤③的样品上样到平衡好的cona填料柱上，样品流速1ml/min，收集流穿液。按照上面缓冲液进行冲洗和洗脱，与cona填料结合的是多糖和内毒素，洗脱下来，弃掉。cona填料的清洗和恢复(cip)按照生产厂家说明书进行。⑤超滤、分装：将滤液用截留分子量为10kd的北京旭邦膜设备有限责任公司005w型中空纤维超滤膜组件中空纤维柱超滤收集活性多肽精制液，取样测定含量和呼吸活性。⑥经检验合格，用注射用水配成所需浓度除菌过滤、分装，即为注射用犬血清去蛋白提取物。实施例2宠物猫专用眼用凝胶的制备1、按照比例分别称取卵磷脂3份、胆固醇1份、维生素d0.2份、维生素e0.2份、α-硫辛酸0.5份，置于悬蒸瓶，混合均匀将其溶于5份甘油溶液中；待其充分溶解后，加入20份注射用水，搅拌均匀，水化1h，超声3min，紫外灭菌后完成后放至室温备用；2、取1l容器，加入0.5份羧甲基纤维素钠搅拌分散均匀；3、再取20份注射用水加热后溶解1份尼泊金甲酯、1份尼泊金乙酯、3份透明质酸、0.5份冷结胶、0.5份黄原胶、10份小分子硫酸软骨素；4、将步骤3与步骤2的溶液混合搅拌，待羧甲基纤维素钠完全溶解后，过滤不溶物，置密封容器内，100℃30min流通蒸汽灭菌，完成后放至室温备用；5、取10份犬血清去蛋白提取物，0.22um微孔过滤器除菌过滤，无菌条件下与步骤4所得溶液混合，均质搅拌均匀；6、无菌条件下将步骤1与步骤5所得溶液混合，用注射用水定容到100份，均质搅拌均匀，无菌分装，既得。实施例3宠物猫专用眼用凝胶的抑菌效果检测：菌种选择：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、绿脓杆菌将大肠杆菌、金色葡萄球菌分别接种肉汤培养液中，37℃培养18h；白色念珠菌、绿脓杆菌接种沙氏葡萄糖液体培养基，将大肠杆菌、金色葡萄球菌、绿脓杆菌调整至106cfu/ml，白色念珠菌调整至105cfu/ml。将配制好的菌悬液各取0.1ml分别加入4份，每份10g重量无抑菌剂的凝胶中，混合均匀，在6h，24h、72h、7d涂布平板，计数。结果如表1所示。表1微生物在不含抑菌剂的凝胶中生长情况(103cfu)时间大肠杆菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌绿脓杆菌6h7232437662524h8825824227662772h110232634624120537d562314503200830245将配制好的菌悬液各取0.1ml分别加入4份，每份10g重量仅添加尼泊金甲酯的无菌凝胶中，混合均匀，在6h、24h、72h、7d涂布平板，计数。结果如表2所示。表2微生物在含尼泊金甲酯的凝胶中生长情况(103cfu)时间大肠杆菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌绿脓杆菌6h198501929524h581018772h0061317d00490将配制好的菌悬液各取0.1ml分别加入4份，每份10g重量仅添加尼泊金乙酯的无菌凝胶中，混合均匀，在6h、24h、72h、7d涂布平板，计数。结果如表3所示。表3微生物在含尼泊金甲酯的凝胶中生长情况(103cfu)时间大肠杆菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌绿脓杆菌6h20948930124h11024172h0001397d00040将配制好的菌悬液各取0.1ml分别加入4份，每份10g重量添加尼泊金甲酯、乙酯的无菌凝胶中，混合均匀，在6h、24h、72h、7d涂布平板，计数。结果如表4所示。表4微生物在含尼泊金甲酯乙酯的凝胶中生长情况(103cfu)时间大肠杆菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌绿脓杆菌6h108310410924h0013472h00087d0000由上面的数据可以看出，尼泊金甲酯、乙酯作为抑菌剂使用，其中尼泊金甲酯对各类霉菌、酵母菌、细菌有效；尼泊金乙酯对于真菌抑制作用较强，少量使用可用于治疗真菌性角膜溃疡；两者混合使用，有良好的协同和加成，具有1+1远大于2的效果，两者在抑菌效果上缺一不可。实施例4宠物猫专用眼用凝胶的质量检测(1)生物活性测定：测定去蛋白提取物的有效方法就是计算其呼吸活力(qo2)及刺激指数(si)，本品利用skw-3微量呼吸检压仪计算两种产品的耗氧量，计算呼吸活力及刺激指数，用来对比两者生物活性及质量，结果如下表6。5.1仪器skw-3微量呼吸检压仪(上海大学)；电子天平；加样器；秒表；手术器械5.2试剂氢氧化钠溶液(10％),soerensen缓冲液:(ph7.40.0667mol·l-1):称取磷酸氢二钠(na2hpo4.2h2o)9.72g和磷酸二氢钾(kh2po4)1.65g,用去离子水1000ml溶解。参照标准品(奥地利),供试品(奥地利)。brodie测压液:取氯化钠23g,牛胆酸钠5g伊文氏兰100mg,加水溶解成500ml。5.3肝匀浆制备体重250-350g雄性豚鼠一只，禁食24h以上，引颈处死，在冰浴上快速取出肝脏，称重，用冷磷酸盐缓冲液冲洗去掉血液后移置玻璃匀浆器内，按1：9(w/v)加入磷酸盐缓冲液，在冰浴中研磨，制成肝匀浆液。5.4试验准备用瓦氏微量呼吸检压仪测定豚鼠肝匀浆的呼吸活力，测得耗氧量，计算出呼吸活力qo2(μlo2/mg·h)和刺激指数si。具体操作步骤如下：①先将测压液装到橡胶管中，再将测压管插入橡胶管中，确保没有任何细小气泡，最后将测压管固定到架子上，调节测压管的液面至150mm。②加10％氢氧化钾溶液0.2ml于反应瓶小杯中(为了增加氢氧化钠对二氧化碳的吸收面积，在氢氧化钾溶液中插入一小片滤纸)。③反应瓶中先加入磷酸盐缓冲液1.1ml，肝匀浆液1.0ml，然后加供试品0.2ml于反应瓶中。④空白瓶中先加入磷酸盐缓冲液1.1ml，肝匀浆液1.0ml，然后加磷酸缓冲液0.2ml于反应瓶中。(因为肝匀浆本身具有耗氧作用)。⑤校正瓶中先加入磷酸盐缓冲液1.1ml，磷酸缓冲液1.0ml，然后再加磷酸缓冲液0.2ml于反应瓶中。稳压测试管使其在与试验管完全相同的条件下，观察压力的变化(△c)，以消除由于温度及大气压影响而引起的误差。⑥将反应瓶按标号与检压管一一对应连接相连(注意密闭，勿使漏气)，置于37℃恒温水浴的振荡器中。⑦开动振荡器振摇10min(120次/分)，目的使反应瓶内外温度一致，震荡时保证检压管的三通活塞是开放状态，10min后，将检压管右侧液面调至150mm，记下左侧液面读数(a)，关闭三向活塞，计时反应30min后，将测压计右侧液面调至150mm，记下左侧液面读数(b)。重复二次，记下读数(c)和(d)。⑧精确量取1.0ml肝匀浆，置恒重的装有海砂的称量瓶中，105℃干燥至恒重，计算两次的重量差δw(mg)5.5计算方法：qo2(μlo2/mg·h)＝〔(a-b+c-d)×k1-△c×k2〕/(g·t)式中，k1为供试品或对照品的反应瓶常数；k2为校正管组反应瓶常数；△c为校正管组压力变化之和；g为每毫升肝匀浆的干重；g＝δw-9.3(mg)；g为每毫升肝匀浆的干重；g＝δw-9.3(mg)；9.3为1ml肝匀浆中磷酸盐缓冲液的干重(mg)；t为反应时间(h)；刺激指数(si)＝供试品qo2/空白qo2。表5本品与素高捷疗眼用凝胶生物活性及质量对比(2)稳定性检测取制备好的犬眼用凝胶，在温度35℃±2℃，湿度75％±5％条件下放置6个月。试验期内分别于0月、1个月、2个月、3个月、6个月各取样一次进行测定。结果如表7所示。结果证实本申请所制备的眼用凝胶加速6个月内能持久稳定。表6眼用凝胶加速稳定性检测(3)临床效果检测实验选用健康猫15只，2-3月龄，体重0.3-0.8kg。分为3组，对照组、素高捷疗组、犬血眼用凝胶组。实验前一日，双眼用0.5％的普鲁卡因局部麻醉，用手术刀均匀刮除角膜上皮，滴加硫酸新霉素滴眼液。滴加2％荧光素钠着色，观察损伤面积，待损伤达到100％后，开始给药。每日给药三次，连用5日，同时双眼滴加硫酸新霉素滴眼液防止细菌感染。每日滴2％荧光素钠着色，观察角膜愈合情况。按照角膜损伤范围的如下标准进行打分，结果如表8所示：无损伤：0损伤在25％以内：1损伤在26-50％之间：2损伤在51-75％之间：3损伤大于75％：4表7临床效果检测打分表结果显示，给药第一天，对照组角膜损伤面积在75％以上，素高捷疗组和凝胶组损伤面积多在51-75％；给药第二天，对照组角膜损伤面积在51-75％之间，素高捷疗组和用凝胶组损伤面积多在26-50％；给药第三天，对照组角膜损伤面积在51-75％之间，素高捷疗组和凝胶组损伤面积半数在26-50％之间，半数在25％以内；给药第四天，对照组角膜损伤面积在26-50％之间，素高捷疗组损伤面积多数在25％以内，个别已愈合，凝胶组少数损伤面积在25％以内，多数已愈合；给药第五天，对照组角膜损伤面积多数在26-50％之间，少数恢复到25％以内，素高捷疗组角膜损伤多数愈合，少数损伤面积在25％以内，凝胶组角膜损伤基本已愈合。以上已经对本发明创造的较佳实施例进行详细阐述，但本发明创造不限定于上述实施例，凡在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。当前第1页12