β-环糊精包合物、凝胶制剂及其制备方法与应用

本发明属于药物制剂技术，特别是涉及一种β-环糊精包合物、凝胶制剂及其制备方法与应用。

背景技术：

薄荷挥发油是从薄荷的新鲜茎和叶中经过水蒸馏或者亚临界低温萃取出来的有效成分，其主要有效成分为薄荷醇，热时可起到清凉作用，不仅具有清凉镇痛的功效，同时还能收缩微血管，减轻头痛，偏头痛等症状。川芎挥发油指中药材川芎经水蒸馏或亚临界低温萃取出来的有效成分，其主要成分为藁本内酯、川芎嗪，它不仅能扩张头部毛细血管，促进血液循环，同时还具有解痉、平喘、镇静效果，能够有效的改善微循环，提高身体免疫力。薄荷、川芎都具有解热、镇痛、抗炎作用，且薄荷挥发油与川芎挥发油具有良好的透皮吸收效果。

β-环糊精(β-cd)是淀粉中产生的环状低聚糖，环糊精衍生物有“内疏水外亲水”的特点因而易形成包合物。其包合物是一种药物分子被包嵌于环糊精分子的空穴结构中所形成的包合体。环糊精种类中β-环糊精(β-cd)包封率高，并且成本较低，在医药行业和化妆品行业得到广泛应用。化学促渗剂能可逆性改变皮肤角质层结构，促进药物透过皮肤被毛细血管吸收。β-cd是一种新型的化学促渗剂，可以通过提取脂质，增加细胞间隙，从而促进药物渗透。挥发油类促渗剂可以使细胞间隙变大，降低皮肤对外来药物的阻碍，有利于药物在经皮细胞间隙的透皮扩散。

本申请将两种无配伍禁忌的挥发油联合使用，两种挥发油在作为有效成分的同时，还互为透皮吸收促进剂，可以提高透皮吸收效率，从而达到更好的药物吸收效果。目前未见含薄荷挥发油、川芎挥发油的环糊精包合物相关报道。

技术实现要素：

发明目的：针对上述现有技术存在的技术问题，本申请提供了一种β-环糊精包合物、凝胶制剂及其制备方法与应用。

技术方案：本申请所述的一种β-环糊精包合物，包合的药物成分为薄荷挥发油和川芎挥发油，其中，所述薄荷挥发油和川芎挥发油总体积(ml)与β-环糊精的质量(g)比为1:6～10，所述薄荷挥发油和川芎挥发油的体积比为3:1～10。

作为优选的技术方案，薄荷挥发油和川芎挥发油总体积与β-环糊精的质量比为1:8；所述薄荷挥发油和川芎挥发油的体积比为3:2。

所述β-环糊精包合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取配方量的β-环糊精，加蒸馏水搅拌溶解至饱和溶液；

(2)称取配方量的薄荷挥发油、川芎挥发油混合均匀，用无水乙醇充分溶解；

(3)在40-60℃水浴条件将步骤(2)的薄荷挥发油、川芎挥发油的混合溶液滴入到β-环糊精饱和溶液中；

(4)滴入后继续搅拌反应，反应完毕后继续搅拌至室温，冷藏；

(5)冷藏让包合物充分沉降后，抽滤，用石油醚洗涤三次，洗去表面残留的挥发油，干燥即得。

步骤(1)中，优选温度为40-60℃。

步骤(2)中，优选的加入与薄荷挥发油、川芎挥发油总体积等体积的无水乙醇。

步骤(3)中，优选的水浴条件为50℃，所述薄荷挥发油、川芎挥发油的混合溶液按照3μl/s的速率滴入β-环糊精饱和溶液中，边加边搅饱和溶液。

步骤(4)中，优选搅拌反应30min；反应完后继续搅拌至室温后，于4℃冰箱冷藏24h。

步骤(5)中，在45℃烘箱中干燥8h，即得。

一种含所述β-环糊精包合物的凝胶制剂，以100份计，包括以下各个组分：海藻酸钠4份～10份、壳寡糖0.5份～5份、透明质酸钠0.2份～1份、β-环糊精包合物0.5份～5份、甘油3份～20份、柠檬酸三钠0.2份～1份、水溶性霍霍巴油0.1份～1份、乙二胺四乙酸0.2份～1份、氯化钙0.005份～0.5份、防腐剂0.1份～1份、芳香剂0.01～0.03份，去离子水加至全量。

所述防腐剂选自苯氧乙醇、羟苯乙酯、苯甲酸钠；所述芳香剂选自薄荷挥发油、玫瑰纯露。

所述凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)取配方量的海藻酸钠溶解于去离子水中；

(2)取配方量的壳寡糖溶于去离子水中，将得到的澄清透明状溶液加入步骤(1)溶液中，得到混合物1；

(3)取配方量的透明质酸钠溶解于去离子水中，并加入混合物1中，得混合物2；

(4)称取配方量甘油加入混合物2中，并于60～80℃水浴条件下，搅拌均匀，得混合物3；

(5)称取配方量的β-环糊精包合物、柠檬酸三钠、水溶性霍霍巴油、乙二酸四乙胺、防腐剂溶解在去离子水中，在60～80℃水浴条件下搅拌使其充分溶解，得混合物4；

(6)将混合物3与混合物4于60～80℃水浴条件下搅拌，直至混合均匀形成黄色透明均匀细腻状凝胶；

(7)向凝胶中加入处方量的浓度为0.01g/ml的cacl2溶液调节至规定粘稠度；

(8)滴加处方量芳香剂调节凝胶气味；

(9)于2000～4000rap/min条件下于高速分散均质机下均质3～5分钟，即得含β-环糊精包合物的凝胶。

所述凝胶可均匀涂抹于太阳穴，通过经穴给药达到缓解由感冒发热、劳累以及其他环境因素引起的头痛、头昏、脑胀等症状。

本申请凝胶制剂成分中，海藻酸钠(sodiumalginate,简称al-na)是由β-1,4-d-甘露糖醛酸(m)和a-1,4-d-古洛糖醛酸(g)组成的杂多糖，其来源丰富、价格低廉、可作为优良基质形成黄色透明凝胶。其具有优良的组织相容性和生物降解性，并不受温度影响，具有良好的热稳定性。壳寡糖，又叫壳聚寡糖、低聚壳聚糖，是将壳聚糖经特殊的生物酶技术降解得到的一种聚合度在2～20之间寡糖产品，分子量≤3200da。具有水溶性好、功能作用大、生物活性高、容易被生物体吸收利用等诸多独特的优势。透明质酸钠化学式为(c14h20no11na)n，有很强的吸湿性，能溶于水。水溶液带负电，高浓度时有很高的粘弹性和渗透压，易形成性状优良的凝胶。同时也是一种良好的保湿剂，能够适应皮肤在不同季节下的保湿要求，因此可以广泛的应用于医药领域中。水溶性霍霍巴油来源于植物荷荷巴(jojoba)，具有良好的渗透性，含丰富维生素d及蛋白质，具有很好的滋润保湿效果，可以维护并调节皮肤水分，有效舒缓，起到软化皮肤的作用。柠檬酸三钠，又名枸橼酸钠，来源于粮食，安全可靠，可进行生物降解，不会对人体健康造成危害。可用作酸度调节剂、缓冲剂及稳定剂，具有良好的ph调节及缓冲性能。

有益效果：相比较于现有技术，本申请具有以下优势：提供了一种含有薄荷挥发油及川芎挥发油的包合物及其制备方法，所述包合物增加了药物的稳定性、溶解度，提高了薄荷、川芎挥发油涂抹于皮肤上的利用率，减少了刺激性气味而且起到了促透作用。另外，还提供了包含所述包合物的凝胶制剂，所述凝胶制剂能够掩盖药物刺激性气味，减少刺激性，降低毒副作用；减少药物的挥发损失量，提高药物的利用率；可调节释药速度，提高生物利用度；保护药物分子，避免挥发油长期储存时变质，提高药物的稳定性；并且降低了用药成本并能实现缓慢释放的效果。所述凝胶制剂制备方法简单易行，可应用于大规模生产。

附图说明

图1是薄荷、川芎挥发油浓度标准曲线；

图2是薄荷、川芎挥发油β-cd包合物tlc图；其中，1是薄荷川芎挥发油样品，2是超声后薄荷、川芎挥发油β-cd包合物上清，3是空白β-cd样品，4是未超声薄荷、川芎挥发油β-cd包合物上清；

图3是挥发油、超声后薄荷/川芎挥发油β-cd包合物上清、空白β-cd、未超声薄荷/川芎挥发油β-cd包合物上清uv全波长扫描图；

图4是β-cd及其薄荷、川芎挥发油β-cd包合物的透射电镜图；

图5是薄荷、川芎挥发油累积透皮渗透量；

图6是透皮后样品uv扫描图；

图7是含薄荷、川芎挥发油β-环糊精包合物的凝胶显微电镜图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本申请作出详细说明。

实施例中的β-环糊精购于国药集团化学试剂有限公司；透明质酸钠购于东辰集团；海藻酸钠、乙二酸四乙胺、霍霍巴油、柠檬酸三钠、氯化钙、壳寡糖均购于上海麦克林生化科技有限公司；芳香剂购于北京爱诺玛亚科技有限公司。

实施例1

β-环糊精包合物的制备，包括以下步骤：

(1)称取4g的β-环糊精于100ml烧杯中，加入蒸馏水在60℃水浴下搅拌溶解至饱和溶液；

(2)取薄荷挥发油300μl，川芎挥发油200μl混合均匀，用500μl无水乙醇充分溶解；

(3)在50℃的水浴条件缓慢的将薄荷、川芎挥发油以20μl/s的速度滴加入到β-环糊精饱和溶液中；

(4)搅拌30min反应完毕后，继续搅拌至室温，于4℃冰箱冷藏24h；

(5)在4℃冷藏条件下让包合物充分沉降后，抽滤，用适量石油醚洗涤，然后将所得固体在45℃烘箱中干燥8h，即得固体型含薄荷、川芎挥发油的β-环糊精包合物。

实施例2

含实施例1制备所得β-环糊精包合物的凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)取4g海藻酸钠溶解于去离子水中，于功率为250w的条件下超声10分钟，使其充分溶解；

(2)取0.5g的壳寡糖，溶于去离子水中，将得到的澄清透明状溶液加入1)中，得到混合物1；

(3)取0.2g的透明质酸钠于功率为250w的超声条件下溶解5分钟，并加入混合物1中，得混合物2；

(4)称取3g甘油加入混合物2中，并于80℃水浴条件下，搅拌均匀，得混合物3；

(5)称取实施例1制备所得含薄荷、川芎挥发油的β-环糊精包合物(0.5g)、柠檬酸三钠(0.2g)、水溶性霍霍巴油(0.1g)、乙二酸四乙胺(0.2g)、防腐剂(0.1g)溶解在适量去离子水中，在80℃水浴条件下搅拌使其充分溶解，得混合物4；

(6)将混合物3与混合物4于80℃水浴条件下搅拌15分钟，直至混合均匀形成黄色透明均匀细腻状凝胶；

(7)向凝胶中加入0.5ml浓度为0.01g/ml的cacl2溶液调节至规定粘稠度；

(8)滴加芳香剂(50μl)调节凝胶气味；

(9)于2000rap/min条件下于高速分散均质机下均质3分钟，即得含薄荷、川芎挥发油的β-环糊精包合物凝胶。

实施例3

含实施例1制备所得β-环糊精包合物的凝胶制剂，制备方法同实施例2，凝胶制剂组分为：海藻酸钠10g、壳寡糖5g、透明质酸钠0.6g、β-环糊精包合物5g、甘油20g、柠檬酸三钠1g、水溶性霍霍巴油1g、乙二胺四乙酸1g、浓度为0.01g/ml的cacl2溶液5ml、防腐剂1g、芳香剂300μl、去离子水加至全量(100g)。

实施例4

含实施例1制备所得β-环糊精包合物的凝胶制剂，制备方法同实施例2，凝胶制剂组分为：海藻酸钠8g、壳寡糖4g、透明质酸钠0.6g、β-环糊精包合物3g、甘油15g、柠檬酸三钠0.6g、水溶性霍霍巴油0.6g、乙二胺四乙酸0.6g、浓度为0.01g/ml的cacl2溶液3ml、防腐剂0.8g、芳香剂150μl、去离子水加至全量(100g)。

薄荷、川芎挥发油包合工艺的筛选

挥发油标准曲线的建立：

按照薄荷挥发油：川芎挥发油体积比＝3:2量取挥发油500μl，按照以下浓度梯度用无水乙醇稀释，分别测定不同浓度下的吸光度，并绘制标准曲线，实验结果如表1所示。

表1不同浓度的挥发油乙醇溶液吸光度值测定结果

建立标准曲线如图1所示。

挥发油空白回收率测定如下：

取体积比为薄荷挥发油：川芎挥发油＝3:2共1ml；取1ml无水乙醇，充分溶解挥发油；取5gβ-cd置于装有沸石的圆底烧瓶中，加入100ml蒸馏水，加热使其充分溶解；逐滴将挥发油混合溶液加至圆底烧瓶中，连接挥发油测定器，采用水蒸气提取法提取挥发油，直至挥发油测定器中油量不增加为止；静置一段时间，记下回收挥发油量；回收的挥发油体积为0.92ml。

挥发油空白回收率计算公式如下：

测定挥发油利用率及β-cd包合率：

取0.04g包合物与4ml无水乙醇混合；混合均匀后用超声清洗仪在25℃，40khz的条件下超声处理20min；超声后样品过0.22mm有机膜；过膜后的样品用紫外分光光度计在λ＝264nm条件下测得吸光度，求得挥发油含量。

挥发油利用率计算公式如下：

环糊精包合率计算公式如下：

β-cd包合试验设计

试验采用正交试验法，确定包合时间、包合温度、壁材与芯材比例为主要影响的三个因素，并选择三个水平进行考察试验，以环糊精包合率、挥发油利用率的综合评分为评价指标，筛选确定包合工艺。

综合评分＝β-环糊精包合率×20％+挥发油利用率×80％。

正交试验因素水平表见表2。

表2为正交试验水平表

按照l9(3^4)正交表安排试验1-9，具体实验方法如下：

称量处方量的β-cd，加入10倍量的去离子水搅拌溶解至饱和溶液；将挥发油用无水乙醇按照1:1的稀释；然后在设定温度水浴条件下逐滴加入到β-环糊精饱和溶液中；搅拌至设定的时间后，继续搅拌至室温；于4℃冰箱冷藏24h；待包合物完全析出后，抽滤。用适量石油醚洗三次，洗去表面残留的挥发油；在45℃烘箱中干燥8h，即得到包合物产物。分别测定其挥发油量、挥发油利用率、环糊精包合率。

试验1-9方案如下：

试验1为包合时间30min，包合温度40℃；β-环糊精3g；

试验2为包合时间30min，包合温度50℃；β-环糊精4g；

试验3为包合时间30min，包合温度60℃；β-环糊精5g；

试验4为包合时间60min，包合温度40℃；β-环糊精4g；

试验5为包合时间60min，包合温度50℃；β-环糊精5g；

试验6为包合时间60min，包合温度60℃；β-环糊精3g；

试验7为包合时间90min，包合温度40℃；β-环糊精5g；

试验8为包合时间90min，包合温度50℃；β-环糊精3g；

试验9为包合时间90min，包合温度60℃；β-环糊精4g。

试验1-9所得数据结果如表3。

表3正交试验数据表

根据实验数据得正交试验表,如表4所示。

表4正交试验表

用spss23.0软件分析对正交试验结果进行方差分析，结果如表5所示。

表5正交试验方差分析表

对实验结果进行方差分析和直观分析可得，包合温度对实验结果具有显著性差异(p<0.05)，包合时间、芯材与壁材质量体积的比例对实验无显著性差异(p>0.05)，因此选取b2因素，因为挥发油利用率是主要影响因素，故根据综合选取a1、c2两个因素。由此最终确定β-cd包合工艺为a1b2c2，即包合温度50℃，包合时间30min，芯材与壁材质量体积的比例为1：8。

实施例中挥发油包合工艺验证

tlc法包合物定性分析

挥发油样品溶液供试品制备。精密量取薄荷挥发油：川芎挥发油＝3:2共100ul,置于10ml容量瓶中用乙醇稀释并定容至刻度，即得。

超声后含薄荷、川芎挥发油的β-环糊精包合物的上清溶液供试品制备。称取β-cd包合物0.1g，加入10ml的无水乙醇，超声20min后，过0.22μm的有机膜，即得。

空白β-cd样品溶液供试品制备。称取空白β-cd0.1g，加入10ml无水乙醇，充分混合并静置20min，过0.22μm的有机膜，即得。

未超声含薄荷、川芎挥发油的β-环糊精包合物上清溶液供试品制备。称取包合物0.1g，加入10ml无水乙醇，充分混合并静置20min，过0.22μm的有机膜，即得。

将以上4个样品溶液分别点在硅胶板上，以体积比为10:1的石油醚(60～90℃)与乙酸乙酯为展开剂，展开。

展开完毕取出，晾干，在紫外灯下检视，结果如图2所示。

结论：由图2可知，以挥发油样品溶液为对照，超声后含薄荷、川芎挥发油的β-环糊精包合物上清溶液在相同位置有相同的斑点，说明在包合后挥发油性质未发生变化；空白β-cd样品溶液、未超声的含薄荷、川芎挥发油的β-环糊精包合物的上清溶液无斑点，表明挥发油已被完全包合。

uv全波长扫描法包合物定性分析：

取挥发油样品溶液供试品，按照一定比例用无水乙醇进行稀释后即得。

取超声后含薄荷、川芎挥发油的β-环糊精包合物上清溶液供试品，按照一定比例用无水乙醇进行稀释后即得。

取空白β-cd样品溶液供试品溶液。

取未超声的含薄荷、川芎挥发油的β-环糊精包合物包合物上清溶液。

将以上四种供试品溶液分别于紫外分光光度仪下进行波长范围为190-400nm的全波长扫描，结果如图3所示。

结论：以挥发油样品溶液为对照，超声后包合物上清溶液在相同波长处有峰，且峰型基本一致，说明包合后的挥发油性质并未发生改变；空白β-cd样品溶液、未超声包合物上清溶液无特征峰，表明挥发油被完全包合。

扫描电镜(tem)实验法薄荷川芎挥发油β-环糊精包合物定性分析:

分别取β环糊精与包合物适量观察其形态学特征。

扫描电镜结果如图4所示。

电镜结果显示，包合物中有黑色圆形点状物，不为空白结构，表明已经形成包合物。

薄荷、川芎挥发油β-环糊精包合物的含量均匀度验证试验：

分别取四份不同批次的含薄荷、川芎挥发油β-环糊精的包合物0.04g与4ml无水乙醇混合；混合均匀后用超声清洗仪在25℃，40khz的条件下超声20min；过0.22mm有机膜，过膜后在λ＝264nm条件下测三次吸光度，求得四批挥发油含量,验证结果见表6：

表6薄荷、川芎挥发油β-环糊精包合物含量均匀度的实验验证结果

结论：经验证各组别之间无显著性差异(p>0.05)，表明不同批次样品含量均一，无显著性差异。

实施例2制备所得含薄荷、川芎挥发油β-环糊精包合物的凝胶制剂的验证

实施例中的凝胶皮肤累积渗透量测定:

取健康小白鼠，体重为18±1g。剃掉毛发，剥去皮肤，得到离体皮肤。去除皮下脂肪和粘液组织，用pbs反复冲洗，用滤纸吸干皮肤表面水分，备用。称取0.5g实施例中制备的凝胶样品。

试验条件：采用franz扩散池设定条件为t＝32℃；渗透面积2.2mm²；搅拌速率为300rpm/min接收池介质为6.5ml的20％乙醇生理盐水溶液。

试验步骤：将离体鼠皮在扩散池和接受池之间固定，扩散池一侧皮肤上加入0.5g实施例中制备的凝胶样品。接受池液面恰与皮肤下层接触。开动磁力搅拌器和恒温水浴。分别在实验开始后15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、24h取样2ml，取样后补加等体积等温度的20％的乙醇pbs溶液。取出的样品用0.45μm的微孔膜过滤，用紫外分光光度剂测定药物浓度，按照公式计算药物累计渗透量。

皮肤积累渗透数量q计算公式如下：

cn为第n次取样药物浓度(ml/ml)

ci为第i次取样药物浓度(ml/ml)

v为接受池液体体积(ml)

v'为取样体积(ml)

a为渗透面积(cm²)

药物累计皮肤渗透量随时间变化图如图5所示

由图5的曲线斜率可知，药物在2～4h渗透速率最快，24h累计渗透量为1.2301μl，药物渗透率为20.82％。

透皮后药物紫外全波长扫描分析：

将透皮后的样品溶液适当稀释，于紫外分光光度仪下进行波长范围为190-400nm的全波长扫描，结果如图6所示。

结论：以挥发油样品溶液为对照，透皮后的药物溶液在相同波长处有峰，且峰型基本一致，说明透皮后的挥发油性质并未发生改变。

凝胶的质量控制：

外观：黄色透明、细腻均匀、带有淡淡芳香气味；在常温下保持胶状，不干涸或液化。

含薄荷、川芎挥发油β-环糊精包合物的凝胶的ph测定:

称取实施例中制备的凝胶0.5g,加入10～15倍蒸馏水水稀释使其溶解，用ph计测定其ph。

经测定实施例中制备的含薄荷、川芎挥发油β-环糊精包合物的凝胶ph为6.8，对人体皮肤刺激性较小，亲和度高。

含薄荷、川芎挥发油β-环糊精包合物的凝胶显微电镜粒度检测:

取少许实施例中制备的凝胶于洁净的载玻片上，用盖玻片轻轻按压使其薄而透明，薄层面积相当于盖玻片面积，共涂3片，立即在50～100倍显微镜下检视盖玻片下的全部视野，不得有凝聚现象，不得检出大于180μm的粒子。

显微电镜图如图7所示。

结论：经检验实施例中制备的含薄荷、川芎挥发油β-环糊精包合物的凝胶粒子分布均匀，无大于180μm的粒子出现。

含薄荷、川芎挥发油β-环糊精包合物的凝胶稳定性试验：

试验对象：实施例所制得的含薄荷、川芎挥发油β-环糊精包合物的凝胶。

试验原理：试验前测试凝胶的ph值、粘度值，确定产品合格时对应的参数范围，观察产品外观及性状。测试稳定性试验后的各组样品参数，并观察样品外观是否发生变化，由此判断产品稳定性良好与否。

试验方法：

1)离心稳定性试验：取3组样品20g于离心机中，保持2500r/min的转速离心10min，取出，测试样品ph值、粘度值有无变化，观察凝胶是否分层，同时对比样品外观即颜色、气味有无变化。

2)高温稳定性实验：取3组20g样品置于40℃烘箱中过夜后取出，于室温下放置24h恢复至常温后，测试检测样品理化性质及外观是否发生变化。

3)低温稳定性实验：取3组20g样品置于4℃冰箱中冷冻过夜后取出，于室温下放置24h恢复至常温后，检测样品理化性质及外观是否发生变化。

试验结果:

1)离心稳定性试验：样品未发生分层且状态良好，理化性质未发生改变。

2)高温稳定性试验：样品理化性质未发生改变且状态良好。

3)低温稳定性试验：样品理化性质未发生改变且状态良好。

结论：经试验验证，实施例中制备的含薄荷、川芎挥发油β-环糊精包合物的凝胶稳定性较好。