二烯丙基三硫醚在食物过敏中的应用

本发明涉及二烯丙基三硫醚在食物过敏中的应用，属于医药技术领域。

背景技术：

食物过敏是由于相关不良免疫反应引起的一种过敏性疾病。研究表明，这种疾病主要是由免疫球蛋白e介导的，表现出胃肠道症状。ige型食物过敏主要是由食物特异性ige抗体激活肥大细胞引起。食物过敏患病率的估测值随年龄，地理位置和研究方法的不同而变化，但总体结论是该病很普遍，并且患病率一直在增加，尤其是在西方国家的某些地区患病率高达10％。1995年，世界卫生组织(worldhealthorganization，who)和联合国粮食与农业组织(foodandagricultureorganizationoftheunitednations，fao)公布了八大类常见过敏食物，包括花生、大豆、鸡蛋、牛奶、甲壳类、鱼类、坚果和小麦，90％以上的食物过敏反应都是由这8类食物引起的。

由于食物过敏的发病原因复杂、过敏原众多等特点，至今尚未研究明确食物过敏的发病机制以及治疗手段，目前最有效的方法仍是避免接触过敏原。

技术实现要素：

本发明通过大量的探索，提供了一种新的应对食物过敏的方法，将二烯丙基三硫醚(diallyltrisulfide,dats)用于缓解或治疗食物过敏。

本发明的第一个目的是提供的目的是提供二烯丙基三硫醚在制备缓解和治疗食物过敏的产品方面的应用。

在一种实施方式中，所述产品包括但不限于功能性食品、特殊医学用途配方食品、保健品或药物。

在一种实施方式中，所述二烯丙基三硫醚的使用剂量为1～100mg/kg。

在一种实施方式中，所述二烯丙基三硫醚的使用剂量为10mg/kg。

在一种实施方式中，所述缓解和治疗食物过敏包括如下至少一种作用：

(1)降低哺乳动物腹泻发生率、减少腹泻发生的可能性；

(2)缓解哺乳动物直肠温度的下降；

(3)降低哺乳动物血清ova特异性ige的水平；

(4)降低哺乳动物血清肥大细胞蛋白酶1的水平；

(5)减轻或缓解哺乳动物空肠组织损伤。

在一种实施方式中，所述食物过敏是由含蛋白质的食物诱发的过敏症状。

在一种实施方式中，所述食物包括但不限于花生、大豆、鸡蛋、牛奶、甲壳类、鱼类、坚果、小麦或以其中任一种或多种为原料的食品。

在一种实施方式中，所述药物为可引入胃、肠道的功能食品或药物。

在一种实施方式中，所述药物含有所述二烯丙基三硫醚和药学上可接受的载体。

在一种实施方式中，所述药学上可接受的载体包括药物载体或药物辅料。

在一种实施方式中，所述药物辅料包含赋形剂以及附加剂。

在一种实施方式中，所述药物辅料包含抗黏合剂、渗透促进剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、吸收剂、保湿剂、溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、ph值调节剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、整合剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、发泡剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。

在一种实施方式中，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素以及精制卵磷脂。

在一种实施方式中，所述药品的剂型包含颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。在一种实施方式中，所述填充剂为微晶纤维素、乳糖、甘露醇、淀粉或糊精中的一种或多种；所述润湿剂为乙醇或甘油中的一种或多种；所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、交联羧甲基淀粉钠、交联聚维酮或低取代羟丙基纤维素中的一种或多种；所述粘合剂为淀粉糊、糖浆、饴糖、炼蜜或液状葡萄糖中的一种或多种；所述润滑剂为硬脂酸镁、硬脂酸富马酸钠、滑石粉或二氧化硅中的一种或多种。

本发明还要求保护所述二烯丙基三硫醚在与其他药物联合用于制备缓解和/或治疗食物过敏方面的应用。

本发明的有益效果为：

本发明提供了dats在卵清蛋白引起的食物过敏中的作用，本发明通过动物实验，验证了dats可降低食物过敏小鼠腹泻发生率，缓解直肠温度的下降，降低血清ova特异性ige水平和肥大细胞蛋白酶水平，以及对空肠组织损伤的缓解作用。本发明提供的dats可以用于制备治疗卵清蛋白引起的食物过敏的药物、功能性食品或特殊医学用途配方食品。

附图说明

图1为不同组小鼠小鼠腹泻发生率、体温变化、血清ova特异性ige水平以及血清小鼠肥大细胞蛋白酶-1水平，小鼠空肠组织形态学变化；其中，control表示对照组，食物过敏(foodallergy,fa)表示食物过敏模型组，fa+dats表示dats处理组。*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001。

图2为不同组小鼠小鼠空肠组织中il-4，il-5和il-13水平；其中，control表示对照组，食物过敏(foodallergy,fa)表示食物过敏模型组，fa+dats表示dats处理组。*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001。

图3为不同组小鼠小鼠空肠组织中il-25，il-33和tslp水平；其中，control表示对照组，食物过敏(foodallergy,fa)表示食物过敏模型组，fa+dats表示dats处理组。*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001。

图4为不同组小鼠肠道屏障的变化；其中，control表示对照组，食物过敏(foodallergy,fa)表示食物过敏模型组，fa+dats表示dats处理组。*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

试剂信息：dats购买自bocsciences公司，产品名称：二烯丙基三硫醚。

表1rt-qpcr使用的特异性引物

实施例1食物过敏模型的建立

全部动物实验均由江南大学动物伦理委员会批准，并遵循国家、国际动物实验伦理原则开展。将5周龄左右的雌性balb/c小鼠随机分为正常对照组(control)、食物过敏组(fa)和dats组(fa+dats)。每组6-8只，由江南大学提供饲养条件。实验组分别在实验的第0天和第14天向小鼠体内腹腔注射50μg的卵清蛋白和1mg氢氧化铝佐剂，从第28天开始，每隔一天灌胃50mg卵清蛋白(ovalbumin，ova)激发，连续6次，对照组给予等体积的生理盐水。fa+dats组每天口服灌胃10mg/kgdats溶液。

在最后一次50mgova口服灌胃1h内，每隔20min测量小鼠直肠温度并记录各组小鼠的体温变化，1h后，向小鼠体内注射致死剂量的戊巴比妥钠并快速收集新鲜的血液，空肠组织等样品，并保存于-80℃冰箱。

实施例2dats缓解ova引起的食物过敏症状

ige介导的实验性食物过敏的症状特征，包括过敏性腹泻、直肠温度的降低、血清中ova特异性ige和小鼠肥大细胞蛋白酶1的水平。动物模型的建立方法同实施例1，通过分析口服灌胃激发阶段腹泻情况和体温下降的变化情况分析食物过敏症状的严重程度，结果显示，在6次胃内ova攻击后，补充dats组的小鼠表现出腹泻发生率下降和体温下降幅度减小如图1(a)所示，补充dats组的小鼠腹泻率下降25％，体温变化幅度相比模型组的2.4℃降低为1.2℃。

血清中ova特异性ige和小鼠肥大细胞蛋白酶1的水平也是食物过敏发生的指标，卵清蛋白诱导的食物过敏依赖于ige的产生，从而激活下游的肥大细胞，而mmcp-1是由肥大细胞脱颗粒产生。收集实施例1获得的新鲜血液，离心后得到血清样品，ova特异性ige和小鼠肥大细胞蛋白酶1的检测分别按照elisa试剂盒(南京森贝伽公司)说明书操作。如图1(c)、1(d)所示，dats的添加可以显著降低血清中ova特异性ige和mmcp-1在血清中的水平，ova特异性ige水平相比于模型组的14.2μg/ml，降低到11.3μg/ml，mmcp-1水平相比于模型组的173.0ng/ml降低为90.0ng/ml。表明dats对食物过敏中可能发挥着抑制作用。

利用h&e染色观察空肠组织的形态，收集新鲜的空肠组织，经4％多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋后，制成5μm厚的组织切片并进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosinstaining，h&e)染色。经过烤片后，依次将切片放入二甲苯，70％，80％，90％，95％和100％的乙醇溶液中后，置于苏木精中染色30s，流水冲洗15min后置于分化液中7s，流水冲洗20min后伊红中染色2s，将切片依次置于70％，80％，95％，95％，100％的乙醇溶液及二甲苯中。使用中性树胶封片后，于显微镜下观察小鼠空肠组织病理学变化，根据肠绒毛受损情况，上皮屏障破损和免疫细胞浸润等指标对空肠组织进行评价。

结果如图1(e)所示，对照组小鼠中空肠组织形态完整，绒毛未出现脱落，固有层也未有肿胀，在食物过敏小鼠中空肠组织绒毛破碎脱落，而dats的添加可以缓解空肠组织形态的破坏，绒毛脱落得到缓解。以上结果表明dats可以缓解食物过敏的症状。

实施例3dats缓解ova引起的th2型细胞因子释放

食物过敏发生时，th2型细胞因子il-4，il-5和il-13的水平会显著增加，利用定量逆转录聚合酶链式反应对空肠组织中il-4，il-5和il-13的mrna水平进行检测，总rna提取利用trizol法根据说明书操作进行提取。空肠组织样品先在高通量组织研磨器中进行破碎，再使用氯仿进行抽提，离心后吸取上清，加入等体积的异丙醇沉淀rna，离心后弃去上清，用75％乙醇洗涤两次后，溶于depc水中。使用superscriptⅱ逆转录酶进行逆转录。

采用sybrgreensupermix染料和待测基因的特异性引物(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)pcr分析，反应体系为：1μl的正向序列引物，1μl的反向序列引物，10μl的sybrgreensupermix染料，2μl的cdna，6μl的水。rt-qpcr反应设置的扩增程序为：95℃预热5min，95℃持续15s，60℃持续60s，反应40个循环。按照基因相对表达水平＝2-^δδct来计算目的基因(il-4，il-5，il-13，il-25，il-33，tslp，tjp1，tjp2，ocln，cldn1)相对管家基因的表达变化。

结果显示食物过敏小鼠中th2细胞因子il-4，il-5，il-13的mrna水平相对于对照组分别增加至3.4倍，5.7倍，3.6倍，在dats处理组小鼠中显著下调至1.9倍，2.1倍，1.6倍。

实施例4dats降低ova引起肠道来源的il-25表达

在食物过敏发生时，肠道上皮来源的il-25，il-33和胸腺基质淋巴细胞生成素，在实验型食物过敏的早期表达增加，可以促进th2型细胞和ilc2细胞产生th2型细胞因子il-4，il-5和il-13。由于之前检测到当补充dats后，th2型细胞因子表达下降，因此检测了小鼠空肠组织中il-25，il-33和tslp的基因水平的变化。mrna检测方法同实施例3，结果显示，dats组和fa组小鼠相比，il-33和tslp的基因水平变化无显著差异，而il-25的基因水平可以由相对于fa组的4.1倍降低至1.2倍，接近于对照组的水平，这提示我们，dats可能通过抑制il-25的产生缓解fa。

实施例5dats缓解ova引起的肠道屏障损伤

肠道屏障功能对维持体内平衡非常重要；屏障功能的破坏会导致肠道疾病，如肠漏综合征、炎症性肠病和食物过敏。以往的研究已经表明，食物过敏小鼠的肠道屏障会受损，肠道通透性增加。通过灌胃fitc-dextran检测小鼠空肠粘膜通透性。小鼠模型的建立方法同实施例1，区别在于，最后一次口服灌胃ova后，将小鼠禁食4h后灌胃500mg/kg的荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖(fluoresceinisothiocyanate-dextran，fitc-dextran)，4h后处死小鼠，将血液离心后收集血清。利用infinitem200仪器(激发波长492nm，发射波长525nm)检测血清中fitc-dextran浓度。

结果显示，dats组小鼠的肠道受损得到缓解，血清中fitc-dextran浓度相对于fa组的1344.3ng/ml降低至929.9ng/ml，与对照组的783.0ng/ml处于相当的水平。此外，通过检测肠上皮中紧密连接蛋白claudin-1(cldn1)、occludin(ocln)、zo-1(tjp1)和zo-2(tjp2)的表达，探究dats是否能调节小鼠食物过敏模型中的肠屏障功能。和预期的一样，这些紧密连接蛋白在卵清蛋白诱导的食物过敏小鼠中的表达不同程度地降低了，而dats可在不同程度上恢复ococludin、zo-1和zo-2的表达，分别相对于模型组的0.5倍，0.5倍，0.5倍上调至1.0倍，0.9倍，0.8倍，恢复至正常水平。此外，dats处理后紧密连接蛋白的基因水平的表达与食物过敏组相比也显著上调，这些结果表明紧密连接蛋白的增强可能有助于减轻食物过敏，dats可能通过提高紧密连接蛋白水平来抑制食物过敏原如卵清蛋白在肠道屏障中的渗透。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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