一种治疗痹症的中药组合物及其制备方法和中药制剂与流程

本发明涉及中药
技术领域：
，特别涉及一种治疗痹症的中药组合物及其制备方法和中药制剂。
背景技术：
：历经千年传承，巫医同源的图腾之物，蜘蛛被海南黎族先民视为“大力士图腾”，被赋予神秘与力量的原始崇拜。蜘蛛息风镇痉，消肿解毒，祛风除湿，通络止痛，具有极高的药用价值，入药历史悠久，治疗各类风湿痹痛效果显著。五指山蜘蛛做为海南地方道地药材，活血化瘀，消炎解毒镇痛，入药能够治疗风湿骨痛、中风口斜等多种疾病，且“山生者倍大”，各种县志及医药典籍等均有记载。海南黎族人民自古就有通过食用烤蜘蛛或蜘蛛泡酒等方式祛风除湿，强健身体；五指山当地黎医也有以蜘蛛为君药，用于治疗痛风、风湿、关节肿痛、颈腰酸痛等疾病，疗效得到了当地患者的高度认可；现代黎医黄雄，世代行医，尤擅用地老虎(五指山蜘蛛)入药泡酒治疗“关节风”(关节局部红、肿、痛、活动障碍等)，深受患者信任，尊称黄雄"黎药王"；五指山市冲山卫生院陈培坚医生以蜘蛛粉为君药，主治痈肿疔疮；中国人民解放军162医院上校军医钟捷东(海南省黎药普查小组副组长)以蜘蛛(地老虎)治疗急慢性中耳炎；我国著名中医华良才教授的外用风湿酊处方，以五指山区黎族民间验方为基础，以蜘蛛粉为君药主治痛风、风湿、类风湿及颈腰椎疾患引起的肿胀疼痛、活动不便等，是对传统黎药验方的整理与提高。目前，对于治疗风湿痹痛效果显著的蜘蛛粉中药制剂仍有需求。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种治疗痹症的中药组合物及其制备方法和中药制剂。该中药组合物可用于治疗各类痹症(风湿、痛风、骨痛等)，疗效显著。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种治疗痹症的中药组合物，以重量份计，该中药组合物由如下原料制成：蜘蛛冻干粉1～10份，独活10～30份，羌活10～30份，威灵仙10～20份，细辛1～10份，木瓜15～25份，三七5～15份，红花5～20份，川芎10～20份，当归10～20份，肉桂油1～5份，薄荷脑15～25份，冰片1～10份。目前，黎药蜘蛛资源稀缺，验方主要口口相传，散落民间不成体系，也并无科学系统的研究基础。本发明在黎药蜘蛛民间验方整理提高的基础上，运用现在研究手段，根据中药君臣佐使协同促进的原理，配伍独活、羌活等其他中药材，提供一种用于治疗各类痹症(风湿、痛风、骨痛等)的含有黎药蜘蛛的消痛制剂及其制备方法。本处方君药为蜘蛛、独活。蜘蛛动物药，行善循丝上下，从外而内，既能祛风除湿，通络止痛，又能以毒攻毒而有解毒杀虫。独活辛温香燥，性善下行，主散在里之伏风及寒湿而通痹止痛，两药相配，虽药性稍异，然功能相似，相互制约，用之十分合拍、安全，共奏祛风除湿，通络止痛之能，故为方中之君药。本处方臣药为羌活、威灵仙、细辛、木瓜。羌活辛温香燥，其性升散通行，能祛除风寒、湿邪，通利关节而止痛。威灵仙辛散温通，性猛善走，通行十二经脉，为治风湿痹痛之要药。木瓜味酸入肝，性温不燥，长于舒筋活络而缓挛急，为治风湿顽痹，筋脉拘急之要药。细辛为辛温之品，芳香走窜，通彻表里上下，散寒力强，止痛力佳。上列四药从不同角度以加强君药的作用，故为臣药。本处方佐药为三七、川芎、当归、红花。三七味甘性温，既擅止血，又善化瘀，还长止痛，药效卓著，有止血不留淤，化瘀不伤正之特点，诚为血症良药，为伤科要药。川芎辛散温通，既能活血，又能行气，还善止痛，为“血中之气药”。当归味甘而重，故专能补血，味辛走散，故能行血，具有良好的补血，活血，止痛作用，补中有动，行中有补，诚血中之气药。红花疏经活络、通经化淤、散淤开结、消肿止痛，活血养血之功效。上列四药合用其意义有三：一是风湿时久不愈，以致气血亏虚，筋脉失养，配以养血活血之品，以邪正兼顾，增强抚邪力量，二是配伍活血行气之品，是气血运行通畅，气行则血行，血活则风散，以达“治风先治血，血行风自灭”，三是达到消肿止痛之效，故共为方中之佐药。本处方使药为冰片、薄荷脑、肉桂油。冰片辛香走窜，彻上彻下，无处不达，有消散而清爽，去恶而生新的特点。肉桂油其性纯阳，芳香透散，配以少量有温运阳气，鼓舞气血生长之功。薄荷脑味辛气凉，清香走窜，通行内外，解郁滞透达三焦。三药伍用，既能通过透皮吸收，引诸药直达病所，又能用冰片，薄荷油的清凉滋润之性，缓和独活、羌活、威灵仙、细辛等的辛温香燥之性，做到用药安全，保护肌肤，并能通过透散之性，使肿消痛止，为方中之使药。作为优选，以重量份计，该中药组合物由如下原料制成：蜘蛛冻干粉1.5～6份，独活15～24份，羌活15～24份，威灵仙15～18份，细辛4～10份，木瓜20份，三七9～12份，红花8～15份，川芎15～18份，当归5～18份，肉桂油2～4份，薄荷脑20份，冰片5份。优选地，以重量份计，该中药组合物由如下原料制成：蜘蛛冻干粉3份，独活18份，羌活18份，威灵仙18份，细辛6份，木瓜20份，三七9份，红花12份，川芎18份，当归18份，肉桂油2份，薄荷脑20份，冰片5份。本发明还提供了该中药组合物的制备方法，包括如下步骤：步骤①：独活、当归、川芎、羌活、细辛混合，加入5～7倍重量的水，浸泡20-40分钟，采用水蒸气法加热提取2～4小时，得到挥发油、挥发油水液和药渣；将药渣、木瓜、威灵仙、三七、红花混合，加入8～12倍重量的50％～90％乙醇水溶液，加热回流提取1～3次，每次加热回流提取的时间为1～2小时，得到醇提液；将挥发油水液与醇提液合并，浓缩至密度1.03～1.09(60℃)，加入乙醇至含醇量为60％～80％，静止12～48小时；取上清液，加入冰片、薄荷脑，得到第一混合物；步骤②：取蜘蛛冻干粉，加入30～50倍重量的30％～70％乙醇水溶液，冷浸提取1～3次，每次冷浸提取的时间为24～120小时，得到蜘蛛提取液；步骤③：将挥发油和肉桂油溶解于4～6倍重量的乙醇，得到第二混合物；步骤④：将第一混合物、蜘蛛提取液、第二混合物混合，在0～4℃条件下放置12～48小时，过滤，得到中药组合物。作为优选，步骤①中：独活、当归、川芎、羌活、细辛混合，加入6倍重量的水，浸泡30分钟，采用水蒸气法加热提取4小时，得到挥发油、挥发油水液和药渣；将药渣、木瓜、威灵仙、三七、红花混合，加入10倍重量的70％乙醇水溶液，加热回流提取2次，每次加热回流提取的时间为1.5小时，得到醇提液；将挥发油水液与醇提液合并，浓缩至密度1.03(60℃)，加入乙醇至含醇量为70％，静止24小时。作为优选，步骤②中：取蜘蛛冻干粉，加入40倍重量的30％乙醇水溶液，冷浸提取2次，每次冷浸提取的时间为72小时。作为优选，步骤④中：将第一混合物、蜘蛛提取液、第二混合物混合，在0～4℃条件下放置12～18小时。作为优选，独活、当归、川芎的粉碎度为0～0.8cm。作为优选，羌活、细辛为饮片。本发明还提供了该中药组合物在制备治疗痹症的中药制剂中的应用。在本发明提供的实施例中，痹症为风湿、痛风或骨痛中的一种。单本发明并非限定于此，本领域技术人员认可的痹症种类均在本发明的保护范围之内。本发明还提供了一种治疗痹症的中药制剂，包括上述中药组合物。作为优选，中药制剂的醇浓度为50％～70％。优选地，中药制剂的醇浓度为55％～65％。作为优选，中药制剂的ph值为5.0～6.0。本发明提供了一种治疗痹症的中药组合物及其制备方法和中药制剂。以重量份计，该中药组合物由如下原料制成：蜘蛛冻干粉1～10份，独活10～30份，羌活10～30份，威灵仙10～20份，细辛1～10份，木瓜15～25份，三七5～15份，红花5～20份，川芎10～20份，当归10～20份，肉桂油1～5份，薄荷脑15～25份，冰片1～10份。本发明具有的技术效果为：本发明中药组合物配伍科学，可用于治疗各类痹症(风湿、痛风、骨痛等)，疗效显著；本发明中药组合物的制备方法可最大限度的提取活性成分，保证了组合物的疗效。附图说明图1示不同提取时间对羌活挥发油提取率的影响；图2示不同提取时间对细辛挥发油提取率的影响；图3示不同提取时间对独活挥发油提取率的影响；图4示不同提取时间对当归挥发油提取率的影响；图5示不同提取时间对川芎挥发油提取率的影响；图6示蜘蛛提取液经正丁醇-水-冰乙酸(8：1：1)二次展开，茚三酮显色；1：水提；2：30％乙醇提取；3：50％乙醇提取；4：70％乙醇提取；5：90％乙醇提取。具体实施方式本发明公开了一种治疗痹症的中药组合物及其制备方法和中药制剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明中所用原料或试剂、仪器均可由市场购得。药材标准：本处方蜘蛛药材仅有海南药材标准，其余药材均有2015版中国药典标准。经检测所有药材均符合标准。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1(一)处方：(二)制法：①独活、当归、川芎粉碎成最粗粉，羌活、细辛共五味药材，加入6倍水，浸泡0.5小时后，提取挥发油4小时，收集挥发油和挥发油水液，待用；药渣加入木瓜、威灵仙、三七(最粗粉)、红花，加入10倍70％乙醇溶液，加热提取2次，每次1.5小时，收集醇提液；将挥发油水液与醇提液合并，浓缩至密度约1.03g/ml(60℃)，加入乙醇至含醇量为70％，静止24小时；取上清液，加入冰片、薄荷脑，适度摇晃以完全溶解；②蜘蛛冻干粉加入40倍30％乙醇冷浸提取2次，每次72小时，合并蜘蛛提取液；③取适量乙醇将挥发油以及肉桂油溶解；④合并上述三组溶液，冷藏，过夜，过滤，滤液加水定容至1000ml，即得。试验例1、提取工艺考察(一)挥发油提取工艺1.单因素考察单味药材1.1羌活药材单因素考察1.1.1考察粉碎度将羌活饮片分别粉碎至最粗粉、粗粉、中粉。称取羌活饮片100g、羌活最粗粉100g、羌活粗粉100g、羌活中粉100g，参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，分别加入5倍水，采用水蒸气法加热提取挥发油5小时，收集挥发油，测定挥发油体积并计算出挥发油提取率，结果如下：表1药材粉碎度饮片最粗粉粗粉中粉挥发油提取率(％)2.101.801.501.20上述结果表明羌活采用饮片提取挥发油即可。1.1.2考察加水量根据上述研究结果，取羌活饮片共4组，每组100g，参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，分别加入3、5、7、9倍水，采用水蒸气法加热提取挥发油，收集挥发油并计算挥发油提取率：表2加水量(倍)3579挥发油提取率(％)-2.202.02.0上述结果表明3倍水不能完全湿润药材，提取过程会烧焦药材。5倍水提取挥发油，提取率最大。1.1.3考察浸泡时间根据上述研究结果，取羌活饮片4组，每组100g，加入5倍水，分别浸泡0小时(加水后立即加热)、0.5小时、1小时、2小时，参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，采用水蒸气法加热提取挥发油，收集挥发油并计算挥发油提取率：表3浸泡时间(h)00.512挥发油提取率(％)2.42.12.01.2上述结果表明药材不需要浸泡即可提取挥发油，并且提取率最大。1.1.4考察提取时间根据上述研究结果，参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，取羌活饮片100g，加入5倍水后立即加热提取挥发油，从沸腾开始计算，经0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h，读取挥发油体积并计算挥发油提取率：表4提取时间(h)0.51234567挥发油提取率(％)1.01.602.202.602.602.602.602.60挥发油量在3小时时基本稳定，油量不再增加。通过对提取时间与挥发油提取率影响做散点图，结果显示3小时为本实验的“拐点”，因此最佳提取时间为3小时(图1)。1.2细辛药材单因素考察1.2.1考察粉碎度将细辛饮片分别粉碎至最粗粉、粗粉、中粉。称取细辛饮片100g、最粗粉100g、粗粉100g、中粉100g，参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，分别加入5倍水，采用水蒸气法加热提取挥发油5小时，收集挥发油，测定挥发油体积并计算出挥发油提取率，结果如下：表5药材粉碎度饮片最粗粉粗粉中粉挥发油提取率(％)2.101.901.600.3上述结果表明细辛采用饮片提取挥发油即可。1.2.2考察加水量根据上述研究结果，取羌活饮片共4组，每组50g，参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，分别加入3、5、7、9倍水，采用水蒸气法加热提取挥发油，收集挥发油并计算挥发油提取率：表6加水量(倍)3579挥发油提取率(％)1.702.100.90.8上述结果表明5倍水提取挥发油，提取率最大。1.2.3考察浸泡时间根据上述研究结果，取细辛饮片4组，每组50g，加入5倍水，分别浸泡0小时(加水后立即加热)、0.5小时、1小时、2小时，参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，采用水蒸气法加热提取挥发油，收集挥发油并计算挥发油提取率：表7浸泡时间(h)00.512挥发油提取率(％)2.22.21.30.2上述结果表明药材不需要浸泡即可提取挥发油，并且提取率最大。1.2.3考察提取时间根据上述研究结果，参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，取细辛饮片50g，加入5倍水后立即加热提取挥发油，从沸腾开始计算，经0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h，，读取挥发油体积并计算挥发油提取率：表8挥发油在前1小时提取速率快，到3小时时基本稳定，挥发油量不再增加。通过对提取时间与挥发油提取率影响做散点图，结果显示3小时为本实验的“拐点”，因此最佳提取时间为3小时(图2)。1.3独活药材单因素考察1.3.1考察粉碎度将独活饮片分别粉碎至最粗粉、粗粉、中粉。称取羌活饮片100g、最粗粉100g、粗粉100g、中粉100g，参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，分别加入5倍水，采用水蒸气法加热提取挥发油5小时，收集挥发油，测定挥发油体积并计算出挥发油提取率，结果如下：表9药材粉碎度饮片最粗粉粗粉中粉挥发油提取率(％)0.250.30.20.1上述结果表明独活含挥发油量不多，饮片与最粗粉相差不大，暂定为最粗粉为最佳提取粒度。1.3.2考察加水量根据上述研究结果，取独活最粗粉共4组，每组100g，参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，分别加入3、5、7、9倍水，采用水蒸气法加热提取挥发油，收集挥发油并计算挥发油提取率：表10加水量(倍)3579挥发油提取率(％)-0.30.250.3上述结果表明3倍水不能完全湿润药材，提取过程会烧焦药材。5倍水提取挥发油，提取率最大。1.3.3考察浸泡时间根据上述研究结果，取独活最粗粉4组，每组100g，加入5倍水，分别浸泡0小时(加水后立即加热)、0.5小时、1小时、2小时，参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，采用水蒸气法加热提取挥发油，收集挥发油并计算挥发油提取率：表11浸泡时间(h)00.512挥发油提取率(％)0.30.250.250.2上述结果表明药材不需要浸泡即可提取挥发油，并且提取率最大。1.3.4考察提取时间根据上述研究结果，参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，取羌活饮片100g，加入5倍水后立即加热提取挥发油，从沸腾开始计算，经0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h，，读取挥发油体积并计算挥发油提取率：表12提取时间(h)0.51234567挥发油提取率(％)0.10.10.20.250.300.30.30.3独活含挥发油比较少，在到4小时时基本稳定，挥发油量不再增加。通过对提取时间与挥发油提取率影响做散点图，结果显示4小时为本实验的“拐点”，因此最佳提取时间为4小时(图3)。1.4当归药材单因素考察1.4.1考察粉碎度当归药材比较软，不易粉碎中粉，故将当归饮片分别粉碎至最粗粉、粗粉即可。称取当归饮片50g、最粗粉50g、粗粉50g、参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，分别加入5倍水，采用水蒸气法加热提取挥发油5小时，收集挥发油，测定挥发油体积并计算出挥发油提取率，结果如下：表13药材粉碎度饮片最粗粉粗粉挥发油提取率(％)0.50.60.6当归在煎煮过程中容易煮烂，影响下一步醇提。通过上述结果表明当归中含有挥发油量不多，因此，提取挥发油采用当归饮片即可。1.4.2考察加水量根据上述研究结果，取当归饮片共4组，每组50g，参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，分别加入3、5、7、9倍水，采用水蒸气法加热提取挥发油，收集挥发油并计算挥发油提取率：表14加水量(倍)3579挥发油提取率(％)-0.600.600.50上述结果表明3倍水不能完全湿润药材，提取过程会烧焦药材。5倍水提取挥发油，提取率最大。1.4.3考察浸泡时间根据上述研究结果，取当归饮片4组，每组50g，加入5倍水，分别浸泡0小时(加水后立即加热)、0.5小时、1小时、2小时，参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，采用水蒸气法加热提取挥发油，收集挥发油并计算挥发油提取率：表15浸泡时间(h)00.512挥发油提取率(％)0.70.40.40.4上述结果表明药材不需要浸泡即可提取挥发油，并且提取率最大。1.4.4考察提取时间根据上述研究结果，参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，取当归饮片100g，加入5倍水后立即加热提取挥发油，从沸腾开始计算，经0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h，，读取挥发油体积并计算挥发油提取率：表16提取时间(h)0.51234567挥发油提取率(％)0.40.30.450.550.600.600.600.60挥发油在提取到4小时时基本稳定，挥发油量不再增加。通过对提取时间与挥发油提取率影响做散点图，结果显示3小时为本实验的“拐点”，因此最佳提取时间为4小时(图4)。1.5川芎药材单因素考察1.5.1考察粉碎度将川芎饮片分别粉碎至最粗粉、粗粉、中粉。称取饮片100g、最粗粉100g、粗粉100g、中粉100g，参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，分别加入5倍水，采用水蒸气法加热提取挥发油5小时，收集挥发油，测定挥发油体积并计算出挥发油提取率，结果如下：表17药材粉碎度饮片最粗粉粗粉中粉挥发油提取率(％)0.150.350.350.25上述结果表明川芎药材中含挥发油量少。川芎饮片材质较硬，故需粉碎至最粗粉即可最大量提取挥发油。1.5.2考察加水量根据上述研究结果，取川芎最粗粉共4组，每组100g，参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，分别加入3、5、7、9倍水，采用水蒸气法加热提取挥发油，收集挥发油并计算挥发油提取率：表18加水量(倍)3579挥发油提取率(％)0.20.50.450.45上述结果表明3倍水不能完全湿润药材，提取过程会烧焦药材。5倍水提取挥发油，提取率最大。1.5.3考察浸泡时间根据上述研究结果，取川芎最粗粉4组，每组100g，加入5倍水，分别浸泡0小时(加水后立即加热)、0.5小时、1小时、2小时，参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，采用水蒸气法加热提取挥发油，收集挥发油并计算挥发油提取率：表19浸泡时间(h)00.512挥发油提取率(％)0.50.402.00.300.25上述结果表明药材不需要浸泡即可提取挥发油，并且提取率最大。1.5.4考察提取时间根据上述研究结果，参照中国药典附录附录2204挥发油测定法，取羌活饮片100g，加入5倍水后立即加热提取挥发油，从沸腾开始计算，经0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h，，读取挥发油体积并计算挥发油提取率：表20提取时间(h)0.51234567挥发油提取率(％)0.050.10.250.40.50.50.50.5挥发油提取到4小时时基本稳定，挥发油量不再增加。通过对提取时间与挥发油提取率影响做散点图，结果显示4小时为本实验的“拐点”，因此最佳提取时间为4小时(图5)。2.正交试验对混合药材提取挥发油2.1因素与水平基于挥发油提取影响因素存在相互影响，故对本处方含有挥发油的药材采用正交试验方法提取挥发油。根据上述单因素考察结果，混合药材提取挥发油不再考察提取粒度，参照单位药材最佳提取粒度。根据单味药材单因素考察结果，设计出以下因素水平表：表21因素水平加水量(倍)浸泡时间(h)提取时间(h)1502260.5337142.2正交试验根据上述因素水平，设计出l9(33)正交试验表，分别对试验1-9提取挥发油，并计算挥发油提取率：表22通过直观分析比较k值，k值越大，表示该水平在这因素中影响最大，因此，最佳提取工艺为a2b2c3，即加入6倍水，浸泡0.5小时，加热提取4小时。方差分析：三因素均无显著性影响。2.3验证试验为验证挥发油提取工艺稳定性，对优选出的提取工艺进行验证三次。称取处方量独活、细辛、羌活、当归、川芎，加入6倍水后，浸泡0.5小时，提取挥发油至4小时，三次挥发油体积分别为0.65ml、0.65ml、0.68ml，rsd<2％，结果表明工艺稳定可行。2.4研究挥发油与水液为了掌握挥发油提取过程中，对五味药材其他有效成分的提取情况，特对挥发油及其水液进行指标性成分含量检测，结果如下：表23指标性成分挥发油水液蛇床子素17.5％0紫花前胡苷035.4％细辛脂素00挥发油指标性成分含量检测：结果显示挥发油里含有蛇床子素，无细辛脂素及紫花前胡苷成分。挥发油水液指标性成分含量检测结果显示挥发油水液含有大量紫花前胡苷，因此水液部分不能弃。由于该处方镇痛类成分，比如紫花前胡苷、细辛脂素等属于脂溶性成分，因此需醇提进一步提取完全。(二)醇提工艺1.单因素考察1.1、考察有效成分提取方式加热回流提取：称取处方量药材按(一)挥发油提取工艺提完挥发油后，药渣加入处方量威灵仙、红花、三七(最粗粉)及木瓜，加入适量95％乙醇使含醇量70％，8倍体积溶剂提取，加热回流2次，每次2小时，收集提取溶液，回收乙醇，加挥发油油水液一并浓缩，溶液定容至100ml。渗漉提取：四组药渣(晾干)，加入威灵仙、红花、三七、木瓜，用70％乙醇溶液湿润，装柱，浸渍72小时渗漉提取，渗漉速度为1ml/min，渗漉液体积与回流提取相同。收集渗漉液，回收乙醇，溶液浓缩至100ml。采用hplc法测定两种提取方式的指标性成分含量，计算出各指标性成分转移率(％)结果如下：表24对比两组数据，结果显示采用加热回流提取指标性成分含量高，时间效率远高于渗漉提取，故采用加热回流提取本处方有效物质。1.2、考察提取醇浓度称取处方量药材按(一)挥发油提取工艺提完挥发油后，药渣加入处方量威灵仙、红花、三七(最粗粉)及木瓜，加入适量95％乙醇使分别使含醇量30％、50％、70％、90％，8倍体积溶剂提取，加热回流2次，每次2小时，收集提取溶液，回收乙醇，加入挥发油水液一并浓缩，溶液定容至100ml。采用hplc法测定两种提取方式的指标性成分含量，计算出各指标性成分转移率(％)结果如下：表25出现两组数据异常指标性成分含量检测，通过查阅文献及试验表明：羌活中异欧前胡素加热提取挥发油后，含量由1.44％降低至0.443％，是因为异欧前胡素在加热回流过程中，在酸性条件下发生了麦氏重排，转变了结构接近的其他香豆素类成分；文献报道，紫花前胡苷为香豆素成分，具有镇痛作用，因此后续提取工艺中采用紫花前胡苷转移率作为监测指标之一。细辛中细辛脂素转移率超过100％，是因为加热回流过程中，甲基丁香酚等有毒成分转换成细辛脂素，加热时间越长，转换越多，因此其转移率超出100％，此外可以解释细辛久煎可以降低其毒性原因。通过对上述指标性成分转移率综合比较分析，兼顾各指标转移率，初步选择70％乙醇为最佳提取浓度。1.3、醇提溶剂倍数考察加热回流提取：称取处方量药材按(一)挥发油提取工艺提完挥发油后，药渣加入处方量威灵仙、红花、三七(最粗粉)及木瓜，分别加入6倍、8倍、10倍、12倍的70％乙醇溶液，加热回流2次，每次2小时，收集提取溶液，回收乙醇，加挥发油油水液一并浓缩，溶液定容至100ml。采用hplc法测定两种提取方式的指标性成分含量，计算出各指标性成分转移率(％)结果如下：表26*未测挥发油油液中蛇床子素含量通过上述指标性成分数据分析，综合各个指标转移率，因此选择10倍作为提取倍数考察后续提取因素。1.4、提取时间考察加热回流提取：称取处方量药材按(一)挥发油提取工艺提完挥发油后，药渣加入处方量威灵仙、红花、三七(最粗粉)及木瓜，加10倍70％乙醇溶液，分别加热回流提取两次，每次提取1小时、2小时、3小时、4小时，收集提取溶液，回收乙醇，加挥发油油水液一并浓缩，溶液定容至100ml。采用hplc法测定两种提取方式的指标性成分含量，计算出各指标性成分转移率(％)结果如下：表27通过对提取时间进行考察，结果显示提取2-4小时指标性成分转移率无明显变化，但比1小时有明显提高，因此选2小时作为最佳提取时间。1.5、提取次数考察提取挥发油，收集油液，水液冷藏待用。药渣，加入威灵仙、红花、三七及木瓜，加入10倍为70％乙醇(药渣有230ml水，需折算)，加热回流提取2小时，分别1次、2次、3次，收集提取液，回收乙醇，合并挥发油水液，浓缩，溶液定容至200ml。表28比较分析以上研究数据，提取2次、3次的指标性成分含量明显高于提取1次的，提取2次与提取3次无明显变化，出于节能、经济因素考虑，因此提取2次作为最佳提取次数。1.6、考察三七提取粒度三七药材属于贵重药材，其质坚硬，不粉碎难以提取有效成分，因此在单因素考察过程中采用最粗粉，但提取转移率未达到80％以上，特对三七粉碎粒度进行了考察。参照上述醇提因素，以三七最粗粉、粗粉、中粉粒度考察，检测其人参皂苷rg1，结果如下：表29粉碎度人参皂苷rg1转移率最粗粉64.82粗粉64.31中粉64.49结果表明三种粉碎粒度转移率基本接近，三七粉碎度对提取转移率无明显影响。因此，在本处方提取过程中，只要将三七适度粉碎即可。2.基于正交试验的醇提工艺2.1因素与水平影响醇提工艺主要因素有醇浓度、料液比、提取时间、提取次数。根据上述单因素考察结果设计出以下因素水平表：表302.2正交试验根据上述因素水平，设计出l9(43)正交试验表，分别对试验1-9条件提取有效成分，回收乙醇，加挥发油水液一并浓缩至100ml，进行指标性成分转移率分析。表312.3醇提工艺中多指标权重为解决不同条件下指标性成分转移率“顾此失彼”的问题，采用层次分析法对各指标性成分设置权重，以“总得分”来评定工艺优劣。根据复方中的药味君臣佐使配伍规律及各成分药理作用强弱，本实验将出膏率和指标性成分溶出量作为权重指标予以量化，即将6项指标分成4个层次，并确定各指标的优先顺序：蛇床子素＞紫花前胡苷＝细辛脂素＞人参皂苷rg1＝羟基红花黄色素a＞出膏率，构建成对比较的判断优先矩阵，赋予各项指标间的相对评分，指标成分比较的优先矩阵。表32指标成对比较判断优先矩阵目标独活羌活细辛红花三七出膏率独活122334羌活1/211223细辛1/211223红花1/31/21/2112三七1/31/21/2112出膏率1/41/31/31/21/21根据以上表格评分结果，采用ahp法计算蛇床子素、紫花前胡苷、细辛脂素、人参皂苷rg1、羟基红花黄色素a、出膏率初始权重系数，并按公式进行归一化权重，并计算权重系数分别为0.3315、0.1952、0.1952、0.1074、0.1074、0.0633。cr＝ci/ri，作为衡量所得权重系数是否合理的指标。cr＝ci/ri＝0.00735/1.24＝0.00593＜0.1，符合并满足一致性要求。因此，上述各指标性成分权重合理可行。2.4基于权重分析正交试验按照正交试验l9(43)进行试验，以hplc法测定各指标的含量，并计算其转移率，以上述确认的权重分别计算出9组正交试验综合评分(总得分)，总得分(m)＝0.3315*蛇床子素转移率+0.1952*紫花前胡苷转移率+0.1952*细辛脂素转移率+0.1074*羟基红花黄色素a转移率+0.1074*人参皂苷rg1转移率+0.0633*出膏率，结果如下：表33对上述9组正交试验数据进行直观分析，结果如下:表34根据直观分析结果，取各项k值最大的作为本正交试验的最佳值，故最佳提取工艺为a2b2c2d3，即加入10倍的70％乙醇提取，提取三次，每次1.5小时。根据上述结果，以r值最小的为误差项，做方差分析，结果如下：表35因素偏差平方自由度f比f临界值显著性醇浓度195.05224.40519.0000.078料液比44.28121.00019.0000.059提取时间211.04024.76619.0000.069提取次数631.361214.25819.0000.070上述结果表明各因素无显著性影响。2.5再次确认提取次数醇提工艺正交试验结果与单因素考察结果有差异，再次确认提取次数。提取挥发油，收集油液，水液冷藏待用。药渣，加入威灵仙、红花、三七及木瓜，加入10倍为70％乙醇(药渣有230ml水，需折算)，加热回流提取1.5小时，分别1次、2次、3次、4次，收集提取液，回收乙醇，合并挥发油水液，浓缩，溶液定容至200ml。表36比较分析以上研究数据，提取2次、3次的指标性成分含量明显高于提取1次的，提取2次与提取3次无明显变化，出于节能、经济因素考虑，因此提取2次作为最佳提取次数。提取2次与提取3、4次无明显变化(rsd为1.38％)，出于日后大生产节能、生产成本因素考虑，提取次数定为2次。因此，醇提工艺定为：10倍体积的70％乙醇，加热提取两次，每次1.5小时。2.6验证试验提取挥发油，收集油液，水液冷藏待用。药渣，加入威灵仙、红花、三七及木瓜，加入10倍为70％乙醇(药渣有230ml水，需折算)，加热回流两次，提取1.5小时，收集提取液，回收乙醇，合并挥发油水液，浓缩，溶液定容至200ml。平行三组试验。表37通过三组验证试验结果显示，rsd为2.32％，表明工艺稳定可行。3浓缩与醇沉3.1浓缩方式常压浓缩：提取挥发油，收集油液，水液冷藏待用。药渣，加入威灵仙、红花、三七及木瓜，加入10倍为70％乙醇(药渣有230ml水，需折算)，加热回流两次，提取1.5小时，收集提取液，回收乙醇，合并挥发油水液，常压条件下浓缩至200ml。减压浓缩：提取挥发油，收集油液，水液冷藏待用。药渣，加入威灵仙、红花、三七及木瓜，加入10倍为70％乙醇(药渣有230ml水，需折算)，加热回流两次，提取1.5小时，收集提取液，回收乙醇，合并挥发油水液，减压(真空度接近于0.1mp)浓缩至200ml。分别对上述两种浓缩方式进行指标性成分检测，结果如下：表38上述结果显示指标性成分两者无明显差异，层次分析法总体评价得分rsd为0.65％(<2％)，故采用减压浓缩。(三)蜘蛛有效成分提取工艺根据文献资料研究，蜘蛛主要有效成分为生物蛋白或多肽，鉴于该类成分在高温高醇下易变性，因此有效成分采用冷浸提取方式。工艺过程中采用茚三酮专属反应来进行定性，并采用紫外分光光度法测定其吸光度进行定量。1.茚三酮反应在加热条件及弱酸环境下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫蓝色(与天冬酰胺则形成棕色产物。与脯氨酸或羟脯氨酸反应生成(亮)黄色)化合物及相应的醛和二氧化碳的反应。茚三酮反应具有专属性，因此通过此反应可以鉴别蜘蛛提取液提取出来的成分为氨基酸或多肽。以上tlc结果可初步得出两个结论：①蜘蛛的有效成分主要为氨基酸、小分子多肽及蛋白质。②tlc谱图中2-4斑点最多，故采用30％-70％乙醇提取成分(图6)。2.单因素考察2.1考察提取方式参照中国药典2015版附录2201法，称取1克蜘蛛冻干粉，分别采用以下三种提取方式，加入25倍50％乙醇溶液提取(加热回流1小时，超声1小时，冷浸提取24小时)，过滤，将提取液定容于100ml，含醇为60％乙醇，静置24小时，过滤，取溶液1毫升提取液，加入4ml考马斯亮蓝g-250溶液，采用外标法测定蛋白多肽含量。表39提取方式多肽类含量(％)浸出物(％)加热回流提取2.48％12.46冷浸提取1.11％9.71超声提取0.99％8.69加热回流提取液冷却后出现大量絮状沉淀，存在已破坏生活活性的可能，因此弃用加热回流提取方式。比较冷浸提取与超声提取，相同提取体积条件下，结合大生产实际情况，采用冷浸更为合适。2.2考察醇提取浓度参照中国药典2015版附录2201法。称取蜘蛛冻干粉五组，每组均1克，分别采用25倍水提、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇，冷浸提取24小时，过滤，将提取液定容于100ml，含醇为60％乙醇，静置24小时，过滤，取溶液1毫升提取液，加入4ml考马斯亮蓝g-250溶液，采用外标法测定蛋白多肽含量。表40水提有腐败气味，考虑到以后实际情况，弃用，未测相应数据。通过对提取浓度考察，结合tlc结果，最终选择30％乙醇作为最佳提取醇浓度。2.3考察醇提倍数参照中国药典2015版附录2201法。称取蜘蛛冻干粉四组，每组均1克，分别采用25倍30％乙醇溶液、50倍30％乙醇溶液、75倍30％乙醇溶液、100倍30％乙醇溶液，冷浸提取24小时，过滤，将提取液定容于100ml，含醇为60％乙醇，静置24小时，过滤，取溶液1毫升提取液，加入4ml考马斯亮蓝g-250溶液，采用外标法测定蛋白多肽含量。表41提取方式多肽类含量(％)浸出物(％)25倍1.89％12.4650倍2.47％16.6675倍2.54％17.05100倍2.49％16.70通过对提取倍数考察，综合提取成本等因素，最终选择50倍30％乙醇作为最佳提取醇浓度。2.4考察提取时间参照中国药典2015版附录2201法。称取蜘蛛冻干粉四组，每组均1克，加入50倍30％乙醇溶液，分别冷浸提取24小时、48小时、72小时、96小时，过滤，将提取液定容于100ml，含醇为60％乙醇，静置24小时，过滤，取溶液1毫升提取液，加入4ml考马斯亮蓝g-250溶液，采用外标法测定蛋白多肽含量。表42提取时间多肽类含量(％)浸出物(％)24小时2.16％11.3648小时2.34％13.4172小时2.66％15.1196小时2.60％15.23通过对提取时间考察，最终选择72小时作为最佳提取时间。3.正交试验3.1因素与水平影响蜘蛛有效成分提取工艺主要因素有醇浓度、料液比、冷浸提取时间、提取次数。根据上述单因素考察结果设计出以下因素水平表：表43因素水平醇浓度倍数时间次数130％2524小时1250％5072小时2370％75120小时33.2正交试验根据上述因素水平，设计出l9(43)正交试验表，分别对试验1-9条件提取有效成分，过滤，将提取液定容于100ml，含醇为60％乙醇，静置24小时，过滤，取溶液1毫升提取液，加入4ml考马斯亮蓝g-250溶液，采用外标法测定蛋白多肽含量。表44对蛋白多肽含量进行直观分析，结果如下：表45k12.6902.1892.2341.956k22.2202.6312.5862.730k32.4462.5272.5272.661极差0.4800.4420.3520.774对各因素进行k值分析，得出最佳提取工艺，进行方差分析显示无显著影响。对浸出物含量进行直观分析，结果如下：表46k121.93019.17319.15718.958k218.92520.63220.28520.552k318.07519.13019.49319.425极差3.8611.5021.1281.594对各因素进行k值分析，得出最佳提取工艺，进行方差分析显示无显著影响。综合上述结果，最佳提取工艺为为50倍30％乙醇，提取两次，每次72小时。方差显示无显著影响。3.3再次确认提取溶液倍数正交试验得出来的结果与单因素结果基本相同，由于本工艺蜘蛛冻干粉为体积大质量轻的粉状物质，20倍体积都不足以完全浸没。出于大生产实际情况，本实验再次对提取倍数进行确认。称取蜘蛛冻干粉三组，每组均1克，加入30倍、40倍、50倍30％乙醇溶液，分别冷浸提取两次，每次72小时，过滤，将提取液定容于100ml，含醇为60％乙醇，静置24小时，过滤，取溶液1毫升提取液，加入4ml考马斯亮蓝g-250溶液，采用外标法测定蛋白多肽含量。结果如下：表47提取方式多肽类含量(％)浸出物(％)30倍2.94％20.0240倍3.11％20.3650倍3.18％20.44三组结果显示，40倍体积与50倍体积几乎相同，达到了完全提取的目的，处于经济成本等因素考虑，40倍体积就足够完全提取蜘蛛有效成分。因此，蜘蛛有效成分的最佳提取工艺为40倍30％乙醇，提取两次，每次72小时。3.4验证试验称取蜘蛛冻干粉三组，每组均1克，加入40倍30％乙醇溶液，分别冷浸提取两次，每次72小时，过滤，将提取液定容于100ml，含醇为60％乙醇，静置24小时，过滤，取溶液1毫升提取液，加入4ml考马斯亮蓝g-250溶液，采用外标法测定蛋白多肽含量。平行三组试验，结果如下：表48提取方式多肽类含量(％)浸出物(％)验证12.93％19.390验证22.95％19.23验证32.93％19.90三组验证试验rsd<2％，结果表明工艺稳定可行。(四)制剂纯化工艺1.醇沉工艺本复方拟制成一定醇浓度的喷雾剂，在挥发油提取工程中，挥发油水液中含有极性大的成分，预试验结果表明浓缩液在一定醇浓度条件下容易析出沉淀，因此，为保证制剂稳定性以及澄清度，有必要对浓缩液进行醇沉。鉴于影响醇沉的因素有样品浓缩程度、醇浓度、醇沉时间，因此设计正交试验对本处方进行纯化。1.1因素与水平考察三种不同浓缩程度(生药材总质量/浓缩体积)，分别为0.75g/ml、1.00g/ml、1.50g/ml，并测定相应密度，分别1.034、1.054、1.089。表49因素与水平浓缩纯度(g/ml)醇浓度时间空白10.7560％12h-21.0070％24h-31.5080％48h-1.2正交试验按照上述条件进行正交试验，分别醇沉试验1-9，取上清液容至1000ml，并进行指标性成分检测，结果如下：表501.3直观分析与方差分析对上述正交试验结果进行直观分析:表51因素与水平浓缩纯度醇浓度时间空白k188.17380.35383.47785.190k1k285.37085.01781.00081.200k2k374.03382.20781.00081.187k3r114.1404.6642.4774.003r1最佳纯化工艺为a1b2c2，即浓缩至0.75g/ml(密度1.03)，加醇至70％，静置12小时。方差分析表明三因素无显著性影响。1.3验证试验按照上述纯化工艺进行三批验证试验，结果如下：表52三批验证试验结果表明，结果稳定可行(rsd＝1.67％<2％)。1.4挥发油水液单独醇沉鉴于纯化工艺沉淀部分主要来源于挥发油水液，对挥发油水液进行单独醇沉，即水液浓缩至适量，加入一定量的乙醇，使含醇量70％，过夜(12小时以上)，取上清液。将醇提液浓缩蒸干后加入70％乙醇溶解，合并以上醇沉液，过滤，定容至1000ml，测定各类指标性成分。表53将上述数据与验证试验数据比较，结果表明层次分析法总体评价总得分略小于验证试验总得分，分别比较各指标性成分，除红花差异有差异外，其他均无明显差异。除外，该工艺在溶解醇提部分浸膏时，还会出现沉淀，又将增加一步过滤。综合上述因素，本纯化工艺将采用将水提液合并醇提液，浓缩至一定密度后，进行醇沉纯化。2.制剂醇浓度2.1薄荷脑溶解性采用30％、50％、70％、95％乙醇溶解对薄荷脑溶解性、稳定性考察，结果表明薄荷脑在70％、95％乙醇溶液能够快速溶解，常温放置多日不析出结晶。2.2挥发油溶解性采用30％、50％、70％、95％乙醇溶解对挥发油和肉桂油进行溶解性，结果表明挥发油在30％乙醇中不能完全溶解，在溶液底层出现油滴，在50％乙醇中则有少量油滴，而70％、95％乙醇溶液则能完全溶解，放置多日不分层，保持澄清。通过本实验表明制剂醇浓度应在50％乙醇以上。2.3制剂醇浓度本制剂具有镇痛作用的成分主要有香豆素类、皂苷类及黄酮类成分，均具有能够易解于乙醇溶液中，因此对制剂浓度进行考察，研究出合适的制剂醇浓度以保证制剂稳定、澄清。表54醇浓度蛇床子素紫花前胡苷羟基红花黄色素a醇浓度30％12.3593.2561.64醇浓度50％47.8693.4759.00醇浓度70％61.26102.7162.83醇浓度90％56.0997.3731.22*未检测挥发油中蛇床子素含量根据以上检测的四组指标显示，醇浓度在30％对本处方中君药独活的蛇床子素有效成分含量影响较大，醇浓度在90％则对红花中水溶性成分羟基红花黄色素a影响大，综合上述指标成分情况，结合薄荷脑溶解性研究、挥发油溶解性与制剂挥发油稳定性研究结果制剂醇浓度应在50％-70％较为合适。为进一步研究醇浓度范围，比较制剂50％乙醇、55％乙醇、60％乙醇、65％乙醇、70％乙醇条件下，考察各指标性成分含量及制剂澄清度，以确认制剂浓度。表55对上述结果进行层次分析，结合各指标权重，计算各个醇浓度下总得分，结果表明五组数据无明显差异，rsd为1.81％<2％，但考虑到挥发油在50％乙醇制剂条件下不能够完全溶解，以及70％醇制剂影响皮肤舒适度，因此，醇浓度范围应在55％-65％即可。2.4冷藏放置根据提取工艺、纯化工艺配制醇浓度在60％的制剂，放置后出现絮状沉淀，分析其中原因，主要是蜘蛛大分子多肽在60％乙醇中不稳定，故将其放置冷藏条件下，最大限度的去除大分子蛋白、多肽类成分。2.4.1考察放置时间表562.5制剂ph值ph值为制剂稳定性重要影响因素，因此，考察不同ph值对本制剂稳定性。按照上述提取制备工艺，制取醇浓度在60％的制剂，测定其ph值为5.47。分别比较ph为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0条件下，分别在阴凉处放置1天、7天、30天，结果如下：表57时间5.05.56.06.57.01天澄清澄清澄清少量沉淀少量沉淀7天澄清澄清澄清有沉淀有沉淀30天澄清澄清澄清有沉淀有沉淀2.6制剂制备完整工艺综合上述研究结果，得出本处方完整制备工艺：[处方]以上十三味，独活、当归、川芎粉碎成最粗粉，羌活、细辛共五味药材，加入6倍水提取挥发油3小时，收集挥发油和挥发油水液，待用。药渣加入木瓜、威灵仙、三七(最粗粉)、红花，加入10倍70％乙醇溶液，加热提取2次，每次1.5小时，收集醇提液。将挥发油水液与醇提液合并，浓缩至密度约1.03g/ml(60℃)，加入乙醇至含醇量为70％，静止24小时，取上清液，加入冰片、薄荷脑，适度摇晃以完全溶解。蜘蛛冻干粉加入40倍30％乙醇冷浸提取2次，每次72小时，合并蜘蛛提取液。取适量乙醇将挥发油以及肉桂油溶解。合并上述三组溶液，冷藏，过夜，过滤，滤液加水定容至1000ml即得。性状：内容物为黄棕色至棕褐色的澄清液体；有特异香气，味微苦、辛辣。试验例2本方案产品在海南某中医院进行临床试验研究。选择240名痹症(风湿、类风湿、骨关节炎或长期关节疼痛)临床患者，分为12组，每组20名，男女各10名，年龄在40-65岁，进行为期15天的试验。评价标准如下：显著：病灶部位的疼痛感、肿胀感等不适明显缓解，基本消失；有效：病灶部位的疼痛感、肿胀感等不适依然存在，症状有所减轻；无效：与治疗前相同甚至加重。试验分组如下：试验组1：选用实施例1实验样品，每日适量涂抹患处3-4次后，适当按摩1-2分钟，促进药液渗透吸收。(蜘蛛冻干粉3g，独活18g，羌活18g，威灵仙18g，细辛6g，木瓜20g，三七9g，红花12g，川芎18g，当归18g，肉桂油(药用)2ml，薄荷脑(药用)20克，冰片5g)试验组2：蜘蛛冻干粉1.5g，独活15g，羌活15g，威灵仙15g，细辛4g，木瓜20g，三七9g，红花8g，川芎15g，当归5g，肉桂油(药用)2ml，薄荷脑(药用)20克，冰片5g。制法及用法同试验组1。试验组3：蜘蛛冻干粉6g，独活24g，羌活24g，威灵仙18g，细辛10g，木瓜20g，三七12g，红花15g，川芎18g，当归18g，肉桂油(药用)4ml，薄荷脑(药用)20克，冰片5g。制法及用法同试验组1。对比组1：缺少蜘蛛冻干粉，其他药材的制法同试验组1。对比组2：独活、羌活药材量分别减少至12g，其他制法同试验组1。对比组3：独活、羌活药材量分别增加至24g，其他制法同试验组1。对比组4：缺少细辛，其他药材的制法同试验组1。对比组5：缺少三七，其他药材的制法同试验组1。对比组6：红花减半至6g，其他药材的制法同试验组1。对比组7：当归减半至9g，其他药材的制法同试验组1。对照组1：选用市售的消肿止痛酊(花红)，每天擦拭3-4次，适当按摩1-2分钟，促进药液渗透吸收。对照组2：未做任何处理。具体试验的临床效果如下表：表58临床试验效果序列组别显著有效无效有效率/％1试验组17112902试验组24124803试验组31082904对比组1488605对比组2596706对比组3992907对比组4596708对比组53710509对比组64886010对比组75967011对照组131076512对照组2031715由表59临床试验效果的临床效果看出，本方法的实验效果显著，且试验组1-试验组3的效果明显由于对照组(市售的消肿止痛酊)。同时，实验组3增加药材量，临床效果没有显著性的提高，实验组2减少药材量，临床效果显著性的降低，但仍高于对照组1。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12