Retapamulin化合物在制备抗EV71病毒药物中的应用

本发明抗病毒药物技术领域，具体涉及一种retapamulin化合物在制备抗ev71病毒药物中的应用。

背景技术：

肠道病毒71型(ev71)是小rna病毒科(picornaviridae)肠道病毒属(enterovirus)成员，是引起婴幼儿手足口病的最主要病原体之一，有时伴有严重的中枢神经系统并发症，包括无菌性脑膜炎，脑炎，脊髓灰质炎样麻痹，神经性心肺衰竭等，甚至导致死亡。自1974年首次报道以来，ev71感染性疾病已在世界范围内多次爆发与流行，在亚太地区尤其是我国形势严峻。鉴于手足口病的传播流行给我国人民生命和健康带来的极大危害，我国政府已于2008年将手足口病列为丙类传染病纳入管理，并制定一系列相关法律法规，严控手足口病的流行传播。目前对于由ev71感染的疾病治疗没有特效药物，相关的疫苗于2015年才上市，其预防效果还有待进一步调查。因此开发特异有效的抗ev71药物势在必行。

retapamulin是一种细菌蛋白质合成抑制剂，属于一类外用抗生素。这种药物通常具有抑菌作用，但在高浓度下可能会成为杀菌剂(当mbc比mic高1000倍时)。retapamulin能与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等细菌的核糖体50s亚单位(23srrna的v域)上的特定位点来抑制蛋白质合成的起始。这个结合位点涉及核糖体蛋白l3，位于核糖体p位点和肽基转移酶中心区域。通过与这个位点的结合，胸膜多糖抑制肽基转移，阻断p-位点相互作用，阻止活性50s核糖体亚单位的正常形成。其kd为3nm，ic50值为3nm(kd，大肠杆菌)。对人肝微粒体的体外研究表明，retapamulin被广泛代谢为多种代谢物，其中主要的代谢途径是单氧合和n-去甲基化，代谢的主要酶是细胞色素p4503a4(cyp3a4)。retapamulin常用于治疗细菌性皮肤感染，效果很不错。但是，用于抗病毒治疗却无报道。

技术实现要素：

针对上述现状，本发明的目的是对retapamulin关于ev71病毒的抑制活性进行了评估，旨在提供retapamulin(c30h47no4s)作为抗ev71病毒筛选化合物。

为实现上述目的，本发明提供一种retapamulin化合物在制备抗ev71病毒药物中的应用，其特征在于：所述retapamulin化合物具有抗ev71活性，其化学结构式如下所示：

作为优选方案，所述retapamulin化合物在50μm时，最大抑制率为84％左右。

进一步地，所述应用是指retapamulin化合物添加药剂学能接受的辅料和载体，用于制备抗ev71病毒的制剂。

更进一步地，所述制剂为颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂中任一种。

本发明目的的实现方式为，retapamulin通过标准的病毒活性测试方法来对其进行活性测试。

本发明的优点及有益效果如下：

本发明通过大量的生物学实验，发现retapamulin具有抗ev71病毒的活性。具体表现为可以抑制ev71病毒引起的细胞病变效应，增强感染细胞的存活率，抑制ev71病毒在细胞内的复制增殖，降低子代病毒产量。由此表明这种化合物有潜力制备抗ev71感染的特异治疗药物，具有大的临床应用前景。

附图说明

图1是retapamulin对于ev71作用的rd细胞存活率的影响。

图2是retapamulin对于ev71引起的rd细胞cpe的抑制效应。

图3是retapamulin对于ev71子代病毒产量的抑制作用。

图4是retapamulin的化学结构式图。

具体实施方式

以下结合具体实施例及附图对本发明的技术方案作进一步地详细阐述。

本发明所用的retapamulin自试剂公司。

本发明涉及retapamulin在制备抗ev71病毒药物中的应用。

应用是指retapamulin添加药剂学可接受的辅料和载体，用于制备抗ev71病毒的制剂。

制剂是颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂。

本发明的retapamulin有以下的化学结构式。

本发明retapamulin作为抗ev71病毒的应用，发现retapamulin抗ev71病毒效果明显。由此表明这种化合物有潜力制备抗ev71感染的特异治疗药物，具有广泛的临床应用前景。

实施例1

本实施例对上述化合物进行了抗ev71活性研究实验，实验情况如下：在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

1、试验内容：

化合物抗ev71活性分析：本发明将结合细胞病变效应分析和mtt测定细胞存活率检测方法，对retapamulin抗ev71活性进行评估。

2、试验方法：

2.1.1化合物对于宿主rd细胞的毒性

将rd细胞铺板96孔板，在37℃，5％co2培养箱培养长满单层后，弃去细胞培养液，分别加含不同浓度测试化合物的细胞维持液继续培养，48h后显微镜目测并分别记录其细胞毒性，mtt法测定细胞存活率。spss11.5软件计算药物对于细胞的半数中毒浓度(mediancyctoxicconcentration，cc50)。细胞存活率＝(药物组平均od492值/细胞对照组平均od492值)×100％。

2.1.2化合物对于ev71的抑制活性

将rd细胞铺板96孔板，在37℃，5％co2培养箱培养长满单层后，弃去培养液，100tcid50的ev71病毒液感染细胞1.5h，加入不同浓度的测试化合物(利巴韦林作为阳性对照药物)孵育细胞。待继续培养约48h，病毒对照孔出现90％左右的cpe病变时，显微镜下观察细胞病变效应(cpe)。cpe的观察记录方法：无细胞病变记做-，25％以下细胞病变记做+，25％-50％细胞病变记做++，50％-75％细胞病变记做+++，75％以上细胞病变记为++++。

cpe观察完毕后，利用mtt方法检测药物对ev71的抑制率。具体步骤为：每孔加入mtt50μl(5mg·ml^-1)，孵育3-4h后去掉上清液，加入等体积的dmso溶解沉淀。用酶标仪在492nm处读取所对应的吸光度(od492值)。利用如下公式计算药物对ev71的抑制率。用spss11.5软件计算药物的半数有效浓度(concentrationfor50％ofmaximaleffect，ec50)。

2.1.3药物的治疗指数(ti)

ti＝cc50/ec50。治疗指数越高，说明抗病毒潜力越大。

3、实验结果

表1retapamulin细胞毒性及抗ev71活性

化合物细胞毒性及抗ev71活性测试结果如表1所示。浓度依赖的化合物(retapamulin)对于ev71作用的rd细胞存活率的影响如图1所示，浓度依赖的化合物(retapamulin)对于ev71引起的rd细胞cpe的抑制效应如图2所示。发现retapamulin在50μm时，最大抑制率为84％左右。

实施例2

本实施例对retapamulin进行了抗ev71活性的深入研究，实施了化合物对于ev71子代病毒产量的抑制作用试验，试验情况如下：

1、试验内容

检测在ev71感染rd细胞后，化合物对于ev71子代病毒产量的抑制作用。

2、试验方法

对数生长期的rd细胞铺板24孔板，长满单层后100tcid50ev71感染细胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，pbs洗涤三次，加入含3.125μm浓度的细胞维持液。48h后收集细胞和上清培养液，-20℃和37℃三次冻融裂解后，tcid50方法测定ev71病毒滴度。

3、试验结果

如图3所示，化合物处理的rd细胞相对于病毒对照组，其病毒滴度都有明显下降，相对于病毒对照下降2.6log。

综上所述，retapamulin具有较强的抑制ev71活性，能够抑制ev71病毒引起的rd细胞病变效应，能制备成临床上有效对抗ev71感染的药物。