一种利用山奈酚抑制FabG基因表达并抑制胃幽门螺旋杆菌生长的方法

一种利用山奈酚抑制fabg基因表达并抑制胃幽门螺旋杆菌生长的方法
技术领域
1.本发明属于微生物学领域，具体涉及一种利用山奈酚(kaempferol)抑制fabg基因表达并抑制胃幽门螺旋杆菌生长的方法。


背景技术：

2.胃幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori，hp)是一种革兰氏阴性杆菌，主要分布在人和动物的胃粘膜组织中，是胃溃疡和十二指肠溃疡发病的主要原因。目前，临床对于胃幽门螺旋杆菌的抑制和消除主要是通过服用抗生素如克拉霉素和阿莫西林。但是，过多服用抗生素会引起许多副作用，不利于人体健康。且部分过敏体质人群无法服用相关抗生素。
3.因此有必要寻求非抗生素类药物用于抑制胃幽门螺旋杆菌，进而实现胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤等胃病的有效治疗，目前现有技术中少有报道。
4.有鉴于此，提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的目的是寻求一种非抗生素类药物用于抑制胃幽门螺旋杆菌。为实现上述目的，本发明通过转录组筛到了一个响应山奈酚但不响应克拉霉素和阿莫西林的参与胃幽门螺旋杆菌细菌膜脂合成的关键基因fabg(基因编号：hpatcc43504_00757)，明确了山奈酚的抑菌作用，以及通过电镜观察进一步明析了山奈酚对幽门螺旋杆菌的破坏途径。通过对比山奈酚和其他常见抗生素(阿莫西林、克拉霉素)在体外对胃幽门螺旋杆菌抑菌率，筛选出了山奈酚在体外对于抑制胃幽门螺旋杆菌的最适浓度。
6.具体的，本发明首先提供一种山奈酚(kaempferol)在调节胃幽门螺旋杆菌fabg基因表达中的用途；
7.进一步的，所述调节为上调或下调，优选的为下调或抑制。
8.本发明还提供一种山奈酚(kaempferol)在制备抑制胃幽门螺旋杆菌fabg基因表达的试剂或药物中的用途。
9.本发明进一步提供一种抑制胃幽门螺旋杆菌fabg基因表达的方法，其特征在于，通过施加一定剂量的山奈酚(kaempferol)。
10.进一步的，所述抑制可以在人体内或体外进行抑制。
11.进一步的，所述一定剂量为0.05
‑
0.15mm；优选的为0.1mm。
12.本发明还提供了一种低浓度山奈酚(kaempferol)在抑制胃幽门螺旋杆菌生长中的用途，其特征在于，所述抑制是通过抑制胃幽门螺旋杆菌fabg基因的表达。
13.本发明还提供了一种低浓度山奈酚(kaempferol)在制备抑制胃幽门螺旋杆菌生长的试剂或药物中的用途，或在制备治疗由胃幽门螺旋杆菌引起的胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤等胃病的药物组合物中的用途，其特征在于，所述抑制是通过抑制胃幽门螺旋杆菌fabg基因的表达。
14.进一步的，所述低浓度为0.05
‑
0.15mm，优选为0.1mm。
15.本发明还提供了一种抑制胃幽门螺旋杆菌生长的方法，其特征在于，在体内或体外(优选的为体外)通过施加低浓度的山奈酚；
16.在一些实施方式中，所述方法具体包括：将活化后的胃幽门螺旋杆菌以微氧条件下、37℃振荡培养至对数期后，低温离心5
‑
10min,弃上清，pbs漂洗菌体和重悬菌体至od＝0.8
‑
1.0，用终浓度为0.05
‑
0.15mm(优选为0.1mm)的山奈酚在微氧条件下37℃继续培养36
‑
48h；所述微氧条件为3
‑
5％o2、10％co2。
17.本发明最后提供了一种用于抑制胃幽门螺旋杆菌生长，或治疗由胃幽门螺旋杆菌引起的胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括终浓度为0.05
‑
0.15mm的山奈酚，优选为0.1mm的山奈酚。
18.与现有技术相比，本发明至少具有如下优势：
19.1)本发明利用高通量测序，从转录水平发现山奈酚能够特异抑制脂肪酸合成必须酶fabg编码基因的表达。
20.2)本发明证实天然类黄酮化合物山奈酚(kaempferol)能够抑制胃幽门螺旋杆菌生长等，且发现跟克拉霉素和阿莫西林不影响胃幽门螺旋杆菌膜脂合成的关键基因fabg的表达不同，山奈酚对胃幽门螺旋杆菌膜脂合成的关键基因fabg的表达有明显的抑制作用，抑制率达到80％。
21.3)本发明证实，0.05mm、0.1mm、0.15mm的山奈酚溶液对于胃幽门螺旋杆菌生长的抑制率分别达到39％、54％、58％，效果与等计量(摩尔浓度)的克拉霉素相当，较等计量(摩尔浓度)的阿莫西林分别提高3％、12％、10％。由于山奈酚(kaempferol)普遍存在于植物中，来源广泛。因此，日常食用部分富含山奈酚的植物源食物，或通过人工添加得到的富含山奈酚的食物，可直接抑制胃幽门螺旋杆菌的生长，达到治疗由该菌引起的相关胃病。或提纯的该化合物，或基于该化合物的化学结构设计生产的新化合物，可直接作为药品在临床使用，用来治疗胃幽门螺旋杆菌引起的胃病。因此，该化合物在抑制胃幽门螺旋杆菌生长繁殖，治疗由胃幽门螺旋杆菌引起的相关胃病方面，具有较好的应用前景和商业价值。
22.4)本发明筛选到非抗生素类物质用于抑制胃幽门螺旋杆菌生长繁殖，明确天然产物山奈酚是其他抗生素(阿莫西林、克拉霉素)的有效替代品，为治疗由胃幽门螺旋杆菌引起的胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤等胃病提供了一种新的天然化合物或基于该化合物结构的新药合成的新思路。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1山奈酚及克拉霉素、阿莫西林处理胃幽门螺旋杆菌的转录组分析图；
25.图2不同处理方式下，扫描电镜(sem)观察结果图，其中，a:对照；b：0.1mm山奈酚处理；c:0.1mm克拉霉素处理；d:0.1mm阿莫西林处理；
26.图3不同处理方式下，透射电镜观察细菌细胞内部超微结构变化图，其中，a:对照；
b：0.1mm山奈酚处理；c:0.1mm克拉霉素处理；d:0.1mm阿莫西林处理；
27.图4不同处理方式下，活/死细胞(live\dead)荧光显微镜观察结果图，其中a：热灭活细胞；b：对照；c：0.1mm山奈酚处理；d：0.1mm克拉霉素处理；e：0.1mm阿莫西林处理；
28.图5山奈酚及两种抗生素(克拉霉素、阿莫西林)对胃幽门螺旋杆菌的抑菌率。
具体实施方式
29.下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
31.除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
32.如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由
…
组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
33.在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
34.本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的
±
10％，优选
±
5％。
35.此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
36.本发明所述的山奈酚(kaempferol)在调节胃幽门螺旋杆菌fabg基因表达中的用途，本领域可以清楚，这种调节即可以是上调也可以是下调，优选的为下调或抑制，当增加山奈酚时，会下调或抑制胃幽门螺旋杆菌fabg基因表达。
37.比如，本发明实例1中利用高通量测序，从转录水平检测了幽门螺杆菌中响应山奈酚、克拉霉素和阿莫西林的靶基因。发现山奈酚特异抑制了幽门螺旋杆菌脂肪酸合成必须酶fabg的编码基因的表达。
38.本发明所述的山奈酚(kaempferol)在制备抑制胃幽门螺旋杆菌fabg基因表达的试剂或药物中的用途，在已知上述调剂用途，本领域可以据此将山奈酚制备成对应试剂或药物，进而利用该试剂或药物实现下调或抑制胃幽门螺旋杆菌fabg基因表达的作用。
39.本发明所述的抑制胃幽门螺旋杆菌fabg基因表达的方法，可以时通过施加一定剂量的山奈酚(kaempferol)；优选的的，这种施加可以可以在人体内或体外进行；在于写实施方式中个，所述一定剂量为0.05
‑
0.15mm；优选的方式为0.1mm。在一些实施方式中，所述低浓度为0.05
‑
0.15mm，优选为0.1mm。
40.本发明所述的低浓度山奈酚(kaempferol)在抑制胃幽门螺旋杆菌生长中的用途，这种抑制是通过抑制胃幽门螺旋杆菌fabg基因的表达而实现。在一些实施方式中，所述低浓度为0.05
‑
0.15mm，优选为0.1mm。而在已知上述低浓度山奈酚(kaempferol)能够抑制胃幽门螺旋杆菌生长的情况下，本领域容易将其制备成对应的试剂或药物。比如本发明所述的低浓度山奈酚(kaempferol)在制备抑制胃幽门螺旋杆菌生长的试剂或药物中的用途，或在制备治疗由胃幽门螺旋杆菌引起的胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤等胃病的药物组合物中的用途。在一些实施方式中，所述低浓度为0.05
‑
0.15mm，优选为0.1mm。
41.本发明所述的抑制胃幽门螺旋杆菌生长的方法，是在体内或体外(优选的为体外)通过施加低浓度的山奈酚；在一些实施方式中，所述方法具体包括：将活化后的胃幽门螺旋杆菌以微氧条件下、37℃振荡培养至对数期后，低温离心5
‑
10min,弃上清，pbs漂洗菌体和重悬菌体至od＝0.8
‑
1.0，用终浓度为0.05
‑
0.15mm(优选为0.1mm)的山奈酚在微氧条件下37℃继续培养36
‑
48h；所述微氧条件为3
‑
5％o2、10％co2。
42.比如，本发明实例2中通过扫描电镜(sem)观察到胃幽门螺旋杆菌在0.1mm的山奈酚以及等浓度的两种抗生素处理下，菌体的外部形态变化，以及菌外膜的受损情况，因此可以直观的比较菌体的破坏程度，山奈酚对菌破坏程度是介于两种抗生素之间的，比阿莫西林的破坏程度要强，稍弱于克拉霉素，并观察到浓度为0.1mm的山奈酚使菌体裂解，菌壁以及菌膜破裂卷曲，致菌死亡。本发明实例3中利用透射电镜(tem)观察到胃幽门螺旋杆菌在0.1mm的山奈酚以及等浓度的两种抗生素处理下，菌体内部的超微结构变化，包括菌外膜的受损情况，以及菌体内部内含物有无渗出，菌体内部空洞的严重程度，相比两种抗生素对菌的破坏效果，浓度为0.1mm山奈酚对菌破坏程度是介于两种抗生素之间的，0.1mm山奈酚破坏细菌壁且使菌细胞膜通透性变大，使得山奈酚更易穿过细胞膜而导致菌外膜被破坏，菌体内含物渗出，菌体裂解严重，致菌死亡。本发明实例4中通过活\死细胞(live\dead)染色可以看出，浓度为0.1mm的山奈酚对胃幽门螺旋杆菌的抑制率相当于等浓度的克拉霉素，强于等浓度的阿莫西林。本发明实例3利用依本实验改进后的微量肉汤稀释法，测定了0.05mm,0.1mm,0.15mm浓度下山奈酚与抗生素的抑菌率，发现山奈酚在0.1mm时具有良好的抑菌效果，与相同浓度的克拉霉素的抑菌效果相当甚至强于同浓度的阿莫西林(0.1mm下，山奈酚抑菌率54％，克拉霉素抑菌率59％，阿莫西林抑菌率42％)。
43.本发明最后提供了一种用于抑制胃幽门螺旋杆菌生长，或治疗由胃幽门螺旋杆菌引起的胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括终浓度为0.05
‑
0.15mm的山奈酚，优选为0.1mm的山奈酚。
44.下面为具体的实施方法。
45.本发明胃幽门螺旋杆菌(atcc number：43504
tm
)购自bncc公司，胃幽门螺旋杆菌是一种螺旋形、微需氧、对生长条件要求十分苛刻的细菌。单极、多鞭毛、末端钝圆、细长弧形、s形和螺旋状g
—
弯曲杆菌。
46.山奈酚(kaempferol)购自北京百灵威科技有限公司，纯度98％。
47.阿莫西林(amoxicillin)购于哈药集团制药总厂。
48.克拉霉素(clarithromycin capsules)购于开封制药集团有限公司。
49.本发明实施例所用液体培养基为mh液体培养基、胰酪大豆胨液体培养基(tsb)，血平板双相培养基。(上述培养基均要加入液体培养基体积6％的牛血清作为胃幽门螺旋杆菌
的特殊补给)。山奈酚、阿莫西林、克拉霉素用dmso溶剂溶解成200mm的母液，用液体培养基稀释母液，4℃冷藏备用。
50.本发明实例为避免溶解药物的dmso对胃幽门螺旋杆菌的影响，对工作液配制方法进行改良：工作液制备：称取山奈酚以及上述两种抗生素粉末(阿莫西林、克拉霉素)于1.5ml离心管中，用dmso溶解，使其终浓度为200mm。用无菌mh液体培养基(不加牛血清)稀释母液使其稀释后的工作液分别为：15mm、10mm、5mm。加入96孔板的体系200μl,分别为：98μl上述mh液体培养基+2μl上述稀释的不同浓度的工作液(使其终浓度分别为0.15mm、0.1mm、0.5mm)+100μl菌液，这样可以极大的降低体系中dmso的含量，降低对本实验的干扰。
51.具体培养基及工作液的制备如下：
52.配制mh液体培养基，胰酪大豆胨液体培养基(tsb)，调ph为7.2，高压高温灭菌20min，待培养基冷却到50℃左右，加入液体培养基体积6％的牛血清，置4℃冷藏待用。
53.工作液制备：称取山奈酚以及上述两种抗生素粉末于1.5ml离心管中，用dmso溶解，使其终浓度为200mm。用液体培养基(不含牛血清)稀释母液使其稀释后的工作液分别为：15mm、10mm、5mm。
54.具体胃幽门螺旋杆菌的培养如下：
55.胃幽门螺旋杆菌(atcc number：43504
tm
)经双相血平板培养基(下层是含2％的琼脂的tsa培养基，上层是上述tsb液体培养基，比例大约是1：1)活化后，吸取100μl活化后的菌液加入到20ml上述配制的tsb液体培养基中，在3
‑
5％o2、10％co2、37℃的环境下，150rpm振荡培养72h。
56.如下为具体的实施例。
57.实例1：山奈酚及两种抗生素(克拉霉素、阿莫西林)处理胃幽门螺旋杆菌的转录组分析
58.实验处理：将活化后的胃幽门螺旋杆菌以3
‑
5％o2、10％co2、37℃的环境下，150rpm振荡培养至对数期后，5000g,4℃离心10min,弃掉上清，再用0.1m的pbs漂洗一遍菌体，接着用0.1m的pbs将菌体重悬至od＝0.8，用终浓度为0.1mm的山奈酚、克拉霉素、阿莫西林在微氧条件下(3
‑
5％o2,10％co2)37℃，150rpm摇床中培养48h，将处理好的菌样离心弃上清，菌体于
‑
20℃条件下送于北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行转录组测序。
59.由于脂肪酸及其衍生物是革兰氏阴性细胞壁和细胞膜的重要组成部分，对细菌的增殖和生存至关重要，并且脂肪酸生物合成是所有生物中必须存在的基本通路，具有不可替代的重要作用，因此禁止脂肪酸合成途径是开发新抗生素的机制之一。
60.细菌脂肪酸的生物合成依赖于脂肪酸合成ⅱ型(fasⅱ)体系，该体系由一系列独立的酶组成，是进行延伸周期的连续步骤。fas
‑
ii则广泛分布在细菌、植物及线粒体中，通过一系列由单一基因编码的可溶性酶依次相互配合来完成脂肪酸合成。而fabg(β
‑
酮酰基
‑
acp
‑
还原酶)作为一个合成fas
‑
ii的标志性基因，属于短链脱氢酶/还原酶超家族(sdr)的成员，且是高度保守的酶。在自然界中，fabg的同工酶(催化作用相同而分子结构不同的酶)只有一种，且是细菌的必需酶，也是细菌脂肪酸合成途径中的关键酶，是开发新型抗菌药物的理想靶点。因此可以通过这个关键性靶点来筛选出对胃幽门螺旋杆菌强效且低毒的靶向抑制剂。
61.本发明做了相关转录组分析发现，由图1可见，等浓度下(0.1mm)的山奈酚、克拉霉
2.5％的戊二醛于离心管中，并于4℃冰箱过夜固定。样品取出后进行漂洗：先将戊二醛吸到废戊二醛瓶，尽量吸的干净，然后吸取1.5ml 0.1m的pbs冲洗一下样品，上下轻摇后吸去pbs，再加入1.5ml 0.1m的pbs漂洗样品，10min，漂洗5次。锇酸固定2.5h，每个样品加入0.5ml锇酸，然后pbs漂洗5次，每次10min。脱水：加入1.5ml 30％、50％、70％、80％、90％乙醇10min，之后加入1.5ml 100％乙醇漂洗3次，每次20min。渗透：分批次加入1.5ml渗透液，比例为乙醇：胶水3:1 3h，乙醇：胶水1:1 6h，乙醇：胶水1:3 12h，再用纯胶渗透24h，之后换新的纯胶渗透24h。包埋:放进包埋胶囊，55℃，48h烘干。先切半薄切片进行定位，之后切超薄切片，先进行铀染再进行铅染，最后将超薄切片放到铜网上以备后期观察。
73.(2)观察与拍照：在透射电镜下观察细菌细胞内部的超微结构变化并进行照相。各个处理均在同一倍数下进行观察。
74.实验结果如图3，透射电镜观察细菌细胞内部超微结构变化，可以看出相比两种抗生素对菌的破坏效果，浓度为0.1mm山奈酚对菌破坏程度是介于两种抗生素之间的，山奈酚使菌体裂解，菌外壁以及菌膜被破坏，菌体内含物渗出，致菌死亡。
75.实例4：活/死细胞(live\dead)染色分析
76.(1)菌体处理：将胃幽门螺旋杆菌培养至对数期,方法同实例1，离心收集后用0.1m的pbs缓冲液重悬至菌液浓度为od
600
＝0.8。
77.(2)配置药液：称取山奈酚以及上述两种抗生素粉末于1.5ml离心管中，用dmso溶解，使其终浓度为200mm。用无菌tsb培养基稀释母液使其稀释后的工作液50mm。fda用dmso溶解为2mg/ml,终浓度为20μg/ml，pi用ddh2o溶解2mg/ml,终浓度为10μl/ml。
78.实验处理：采用山奈酚及两种抗生素以及阴性对照组、阳性对照组(100℃热处理10min)分别处理胃幽门螺旋杆菌：取三毫升上述菌液于10ml离心管中，加入6μl的50mm上述稀释的工作液，使其终浓度为0.1mm，共5个处理(山奈酚、阿莫西林、克拉霉素、阴性对照、阳性对照)，每个处理三个重复。在条件为3
‑
5％o2,10％co2,37℃，150rpm摇床中培养48h。
79.取1ml上述处理好的菌液先加20μl fda染料于菌液中，避光5min处理，再加入10μl pi染料，避光10min处理。吸取20μl的染色过后的菌液于载玻片上，盖玻片从一端接触含有菌液的载玻片缓慢滑落，避免出现气泡干扰。将制好的片子置于荧光显微镜下观察，滤光片为蓝光，调整相关显微镜基本参数后进行荧光观察，各个处理均在同一倍数下进行观察。
80.实验结果如图4，红色是死菌，绿色的是活菌，由图示的死活细胞染色比率可看出，浓度为0.1的山奈酚对胃幽门螺旋杆菌的抑制率相当于克拉霉素，强于阿莫西林。证明山奈酚可以破坏胃幽门螺旋杆菌的细胞膜以及细胞壁，致使pi染料进入细胞内进而发红光。
81.实例5：山奈酚及两种抗生素(克拉霉素、阿莫西林)对胃幽门螺旋杆菌抑菌率的测定
82.依据美国临床检验标准委员会(clsi)制定的微量肉汤稀释法，根据本实验的实际操作情况对该方法进行改良，具体操作步骤如下。在紫外分光光度计下测量od600为0.8之后，使用离心机在4500g，5min条件下离心菌液，用质量分数为0.85％的生理盐水重悬菌体，对比表1的1号麦氏比浊管(3x108cfu/ml)，目测并调整菌液与1号麦氏比浊管浑浊度呈一致，再用上述mh液体培养基稀释三百倍，为避免边缘效应，加样位置应从第二排第二行开始，并在96孔板边缘一圈加200μl无菌水。在第一孔中加入98μl上述稀释的mh液体培养基之后顺次加入2μl不同浓度(工作液浓度为：15mm、10mm、5mm)的化合物溶液以及阴性对照组，
使其终浓度为0.15mm、0.1mm、0.05mm、0mm，之后再在每个孔中加入100μl上述菌液，使其菌浓度最终为5x105cfu/孔(表1)。然后将96孔板放置于条件为3
‑
5％o2,10％co2,转速为150rpm的摇床37℃培养48h。用酶标仪检测每孔od
600
值，每孔测得值减去空白对照。计算抑菌率。
83.抑菌率＝(od
600
对照
‑
od
600
处理)/od
600
对照
×
100％。
84.表1、麦氏比浊管配制
[0085][0086]
由图5可以看出，在浓度均为0.05mm时，山奈酚、克拉霉素和阿莫西林的抑菌率分别为：39％，41％，36％，抑菌效果没有显著性的差异，且抑菌率均未超过50％。0.15mm的山奈酚、克拉霉素和阿莫西林的抑菌率分别为58％，64％，48％。
[0087]
在0.1mm浓度处理下，山奈酚、克拉霉素、阿莫西林抑菌率分别为：54％、59％、42％。山奈酚与阿莫西林处理相比，山奈酚对胃幽门螺旋杆菌的抑制效果更好。也就是说，山奈酚与阿莫西林相比，要达到抑菌率为50％时，山奈酚需要的浓度更低。在同等浓度0.1mm下，山奈酚与克拉霉素抑制胃幽门螺旋杆菌的表现相当，因此可以把山奈酚当作抗生素(克拉霉素、阿莫西林)的有效替代品。
[0088]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。