富马酸二甲酯滴眼液及其制备方法和作为真菌性角膜炎治疗药物的应用与流程

本发明公开了一种富马酸二甲酯滴眼液及其制备方法和作为真菌性角膜炎治疗药物的应用,属于制药技术领域。

背景技术：

真菌性角膜炎是一种由真菌感染引起的角膜炎症性病变；起病缓慢、病程较长，可出现眼睛红痛、视物模糊、畏光流泪及眼睑痉挛等症状；可造成严重的视力损害。农业外伤、隐形眼镜的长期使用以及广谱抗生素和糖皮质激素的过度使用，均导致了其发病率逐年增加。曲霉菌及镰刀菌是真菌性角膜炎的主要致病菌。烟曲霉菌感染角膜后，受到烟曲霉菌刺激的角膜组织会产生强烈的免疫反应：角膜血管舒张、大量炎症细胞向炎症发生部位募集、大量免疫活性物质释放。适度的炎症反应有利于病原物质的清除，但炎症反应过度则会造成角膜组织损伤，甚至失明。目前，临床上治疗真菌性角膜炎的常见药物有两性霉素b、咪康唑及氟胞嘧啶。这三种药物在用于治疗真菌性角膜炎时，均存在食欲不振、恶心或呕吐等不良消化道反应；因此寻找新型有效且没有不良消化道反应的治疗真菌性角膜炎的药物是非常必要的。

富马酸，又称延胡索酸，是一种具有生物活性的物质，直接参与三羧酸循环。富马酸二甲酯是富马酸衍生物中生物活性最强的一种，具有抗菌、抗氧化、抗炎、免疫调节功能，已被批准用于治疗银屑病和多发性硬化症，口服到达体循环后会水解成具有活性的富马酸单酯,进入人体后很快变成正常代谢产物富马酸。目前，人们对富马酸二甲酯的认知为“富马酸二甲酯能透过皮肤接触，引致人体皮肤灼痛或过敏等严重反应。本品亦带有刺激性，应避免接触眼睛。”。也就是说，本领域技术人员存在“富马酸二甲酯不能接触眼睛”的技术偏见，所以，不会有动机将富马酸二甲酯用于眼睛的相关治疗；因此，目前还未有关于富马酸二甲酯用于眼睛不适症的报道。

技术实现要素：

发明人在富马酸二甲酯的抗菌性能实验研究过程中偶然发现，较低浓度的富马酸二甲酯溶液渐入眼睛中并没有对眼睛产生刺激作用、不良反应。由此可见，富马酸二甲酯并不是一直对眼睛有刺激性，当其浓度降低到一定值之后就不会对眼睛产生刺激作用，而且意外的对真菌性角膜炎的致病菌有杀灭作用；从而能够作为治疗真菌性角膜炎的药物。

本发明的技术方案如下：

一种富马酸二甲酯滴眼液，含有富马酸二甲酯、溶剂和注射用水；其中，富马酸二甲酯的浓度为小于等于5ug/ml；

所述溶剂为医学上能与眼睛接触的且能溶解富马酸二甲酯的溶剂；如二甲基亚砜。

所述溶剂的用量为能将富马酸二甲酯溶解的医学上可接受的用量，其用量的变化不影响其作为治疗真菌性角膜炎的药物的功效。当所述溶剂为二甲基亚砜时，其体积浓度小于等于0.1%。

本发明的富马酸二甲酯滴眼液，以富马酸二甲酯为有效成分，注射用水为载体。富马酸二甲酯的浓度小于等于5ug/ml；在此浓度条件下，能有效杀灭真菌性角膜炎的致病菌，如烟曲霉菌和镰刀菌；同时不会给眼睛带来刺激作用，不会产生不良效果。本发明的富马酸二甲酯滴眼液通过抑制真菌生长（减少7.1-29.6%的真菌数量）、削弱真菌对细胞的黏附能力发挥抗真菌功能；并且还通过降低炎症反应因子白介素-1β（il-1β）和肿瘤坏死因子-α（tnf-α），减轻角膜炎反应，将大大有益于真菌性角膜炎患者。另外，通过临床试验证明，本发明的富马酸二甲酯滴眼液作为治疗真菌性角膜炎的药物使用，不会产生任何消化道不良反应。

上述富马酸二甲酯滴眼液，富马酸二甲酯的浓度为2-5ug/ml。在此浓度条件下，富马酸二甲酯滴眼液抑制真菌的生长能力显著，能减少26.6-29.6%的真菌数量。

上述富马酸二甲酯滴眼液，具体的富马酸二甲酯的浓度为2、3、4、5ug/ml。

一种富马酸二甲酯眼膏，在保证富马酸二甲酯的浓度小于等于5ug/ml的条件下，用医学上眼用膏状药物赋形剂制备成膏状。所述医学上眼用膏状药物赋形剂可以采用现有技术中记载的任意一种或两种以上均可以；例如，液体石蜡、羊毛脂和黄凡士林。

一种上述富马酸二甲酯滴眼液的制备方法：将富马酸二甲酯充分溶解于二甲基亚砜中，获得富马酸二甲酯溶液；将富马酸二甲酯溶液加入到注射用水中，混合均匀即可。

本发明还提供了上述富马酸二甲酯滴眼液作为真菌性角膜炎治疗药物的应用。

将上述富马酸二甲酯滴眼液作为真菌性角膜炎治疗药物应用时，其用法用量：点眼，每日3-6次，每次给药量大于等于结膜囊容量即可。结膜囊的容量通常为20ul，给药量大于20ul时，多余滴眼液会从眼角溢出，不会产生副作用。

本发明所述富马酸二甲酯和二甲基亚砜均为医用级，可以通过市场购买获得。

所述注射用水为指符合中国药典注射用水项下规定的水。

有益效果

作为真菌性角膜炎治疗药物，不会对眼睛带来毒副作用，不会产生不良消化道反应；对真菌性角膜炎的治愈率高达95.7%。

原料易获得、配方简单、成本低廉，制备方法简单易控制，使用方法简单；具有巨大的市场前景。

附图说明

图1为本发明富马酸二甲酯滴眼液的细胞毒性实验结果图；

图2为本发明富马酸二甲酯滴眼液的抗真菌生长实验结果图；

图3为本发明富马酸二甲酯滴眼液的抗真菌黏附实验结果图；

图4为本发明富马酸二甲酯滴眼液的抗炎功能实验结果图；

图5为本发明富马酸二甲酯滴眼液在小鼠真菌性角膜炎的应用结果图；图5中，圆点代表感染对照组，正方形代表富马酸二甲酯滴眼液处理组。

图4图5中，一个星号对应p<0.05，说明有统计学差异，两个星号对应p<0.01，说明有显著统计学差异，三个星号对应p<0.001，说明有极其显著的统计学差异。

具体实施方式

实施例1

取2mg富马酸二甲酯充分溶解于1ml二甲基亚砜中，得富马酸二甲酯溶解液；取5ul富马酸二甲酯溶解液，向5ul富马酸二甲酯溶解液中加注射用水至5ml；混合均匀即得5ml富马酸二甲酯滴眼液。

实施例2

取3mg富马酸二甲酯充分溶解于1ml二甲基亚砜中，得富马酸二甲酯溶解液；取5ul富马酸二甲酯溶解液，向5ul富马酸二甲酯溶解液中加注射用水至5ml；混合均匀即得5ml富马酸二甲酯滴眼液。

实施例3

取4mg富马酸二甲酯充分溶解于1ml二甲基亚砜中，得富马酸二甲酯溶解液；取5ul富马酸二甲酯溶解液，向5ul富马酸二甲酯溶解液中加注射用水至5ml；混合均匀即得5ml富马酸二甲酯滴眼液。

实施例4

取5mg富马酸二甲酯充分溶解于1ml二甲基亚砜中，得富马酸二甲酯溶解液；取5ul富马酸二甲酯溶解液，向5ul富马酸二甲酯溶解液中加注射用水至5ml；混合均匀即得5ml富马酸二甲酯滴眼液。

实施例5

取5mg富马酸二甲酯粉末与1000ml液体石蜡、羊毛脂和黄凡士林充分混合，即可获得富马酸二甲酯眼膏。其中，液体石蜡、羊毛脂和黄凡士林可以按照任意比例混合，或者只取其中一种或两种。

对比例1

取1mg富马酸二甲酯充分溶解于1ml二甲基亚砜中，得富马酸二甲酯溶解液；取5ul富马酸二甲酯溶解液，向5ul富马酸二甲酯溶解液中加注射用水至5ml；混合均匀即得5ml富马酸二甲酯滴眼液。

一、细胞毒性实验

将人角膜上皮细胞接种于96孔板中，向其中32孔细胞培养液中加入二甲基亚砜，使二甲基亚砜的终浓度为0.1%（体积浓度）（对照组）；向其中64孔细胞培养液中加入富马酸二甲酯的二甲基亚砜溶液，使其中32孔的富马酸二甲酯终浓度为2ug/ml，另外32孔的富马酸二甲酯终浓度5ug/ml。将96孔板置于培养箱（37℃）孵育24小时后，向每孔加入10微升的cck8溶液。将96孔板置于培养箱（温度为37℃，co2质量浓度为5%）内孵育2小时后，用酶标仪测定96孔板每孔在450nm处的吸光度，结果如图1所示。所用，cck8溶液来自日本同仁化学研究所(dojindo)开发的检测细胞增殖、细胞毒性的试剂盒。

结果显示，2ug/ml、5ug/ml的富马酸二甲酯均不影响角膜上皮细胞存活率，对细胞无毒性。判断依据：添加富马酸二甲酯前后，角膜上皮细胞对450nm波长光的吸光度值相同。

二、抗真菌实验

（1）真菌生长分析

在96孔板中加入等量（每孔190ul）的烟曲霉菌孢子及培养基；然后，其中24孔加入10ul浓度为20ug/ml的富马酸二甲酯溶液（混合后富马酸二甲酯的终浓度1ug/ml、二甲基亚砜的体积浓度为0.1％）、其中24孔加入10ul浓度为40ug/ml富马酸二甲酯溶液（混合后富马酸二甲酯的终浓度2ug/ml、二甲基亚砜的体积浓度为0.1％）、其中24孔加入10ul浓度为100ug/ml的富马酸二甲酯溶液（混合后富马酸二甲酯的终浓度5ug/ml、二甲基亚砜的体积浓度为0.1％），另外24孔添加体积浓度为0.1％的二甲基亚砜注射用水溶液作为对照组。将96孔板置于37℃温箱，培养48小时后，用酶标仪测定在530nm处的吸光度，结果如图2所示。上述富马酸二甲酯溶液是指富马酸二甲酯、二甲基亚砜和注射用水的混合液。

结果显示，富马酸二甲酯降低吸光度值，抑制真菌的生长。与对照组相比，浓度为1ug/ml、2ug/ml、5ug/ml的富马酸二甲酯滴眼液分别减少7.1%、26.6%、29.6%的真菌数量。

（2）真菌粘附实验

将角膜上皮细胞接种于带腔室的载玻片过夜，至细胞贴壁生长。实验组将99ul烟曲霉菌孢子悬液分别与1ul浓度为2mg/ml、5mg/ml富马酸二甲酯的二甲基亚砜溶液混合，得混合液；将100ul混合液加入到900ul所培养的角膜上皮细胞培养基中，制备成1ml培养液；培养液孵育3小时；其中，培养液中孢子浓度为2×10⁵/ml，孢子浓度是细胞的十倍，富马酸二甲酯的终浓度分别为2ug/ml、5ug/ml。烟曲霉菌孢子悬液、所培养的角膜上皮细胞培养基与二甲基亚砜注射用水溶液混合（混合后至孢子浓度为2×10⁵/ml，孢子浓度是细胞的十倍；二甲基亚砜的体积浓度为0.1％）作为对照组。然后用苏木精-伊红染色法染色，通过明视野显微镜（放大600倍）观察拍摄角膜上皮细胞表面粘附的孢子的数目。结果如图3所示。

图中，细小颗粒为烟曲霉菌孢子。结果显示，2ug/ml、5ug/ml的富马酸二甲酯滴眼液均能显著减少角膜上皮细胞表面黏附的烟曲霉菌孢子数目，降低烟曲霉菌的黏附能力。

本发明还采用镰刀菌做了相应实验，结果相同：2ug/ml、5ug/ml的富马酸二甲酯滴眼液均能显著减少角膜上皮细胞表面黏附的镰刀菌孢子数目，降低镰刀菌的黏附能力。

三、抗炎功能实验。

培养角膜上皮细胞，分为空白组、对照组和实验组。空白组：对角膜上细胞进行正常培养；对照组：用灭活烟曲霉菌菌丝刺激角膜上皮细胞8小时；实验组：用灭活烟曲霉菌菌丝刺激角膜上皮细胞8小时的同时分别给予2ug/ml、5ug/ml的富马酸二甲酯滴眼液处理（每1ml的培养液中分别加入1ul的2mg/ml、5mg/ml的富马酸二甲酯滴眼液）。收集各组的角膜上皮细胞，检测细胞中白介素-1β和肿瘤坏死因子-α的mrna表达水平，结果如图4所示。

结果显示，与对照组相比，浓度为2ug/ml、5ug/ml的富马酸二甲酯滴眼液能分别抑制56%、64%的白细胞介素-1β；浓度为2ug/ml、5ug/ml的富马酸二甲酯滴眼液能分别抑制60%、64%的肿瘤坏死因子-α。说明，富马酸二甲酯滴眼液可显著下调真菌诱导细胞产生的炎症因子水平。

另外，采用同等浓度的富马酸二甲酯眼膏代替富马酸二甲酯滴眼液，进行上述抗炎功能实验。实验结果表明；相同浓度的富马酸二甲酯眼膏和富马酸二甲酯滴眼液对白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α的抑制率相当。

四、富马酸二甲酯滴眼液在小鼠真菌性角膜炎的应用实验。

取8周龄c57bl/6健康雌鼠，建立小鼠烟曲霉菌性角膜炎动物模型，后随机分为感染对照组与处理组。均以右眼为实验眼。模型建立成功后，感染对照组对小鼠不采取任何措施，处理组使用2ug/ml的富马酸二甲酯滴眼液点眼，每天点眼3次，每次3微升。根据o’day标准行角膜溃疡评分标准，感染3天后，于裂隙灯下观察并记录小鼠角膜溃疡的评分情况，结果如图5所示。

结果表明，与感染对照组相比，2ug/ml富马酸二甲酯滴眼液可显著减轻角膜溃疡，减轻角膜的炎性损伤，降低临床评分。

分别用3ug/ml、4ug/ml和5ug/ml富马酸二甲酯滴眼液代替2ug/ml的富马酸二甲酯滴眼液，重复上述实验。结果表明，3ug/ml、4ug/ml和5ug/ml富马酸二甲酯滴眼液可显著减轻角膜溃疡，减轻角膜的炎性损伤，降低临床评分；效果比2ug/ml的富马酸二甲酯滴眼液更优。

五、富马酸二甲酯滴眼液在治疗人真菌性角膜炎的应用

采集2019年1月至2021年1月接受治疗的真菌角膜炎患者94例，其中男性46例，女性48例，年龄为25-60岁，平均（34.66±4.31）岁。

其中，47例患者均接受富马酸二甲酯滴眼液（浓度为2ug/ml）点眼治疗，每天3次，每次给药量为40ul，需连续治疗3周。

其中，47例患者均接受富马酸二甲酯滴眼液（浓度为5ug/ml）点眼治疗，每天3次，每次给药量为40ul，需连续治疗3周。

按照下述标准对患者治疗后临床效果进行评价；每一项症状评分最高5分，评分越高则代表该症状程度越严重。经过统计后，评价结果见表1。47例患者接受浓度为2ug/ml的富马酸二甲酯滴眼液的治疗后，43例患者有治疗效果，其中治愈35例、显效5例、有效3例；4例患者没有治疗效果；治疗有效率为91.5%（43/47）。47例患者接受浓度为5ug/ml的富马酸二甲酯滴眼液的治疗后，45例患者有治疗效果，其中治愈36例、显效5例、有效4例；2例患者没有治疗效果；治疗有效率为95.7%（45/47）。

采用同等浓度的富马酸二甲酯眼膏代替富马酸二甲酯滴眼液，进行上述临床实验。实验结果表明；相同浓度的富马酸二甲酯眼膏和富马酸二甲酯滴眼液对真菌性角膜炎的治疗效果相当。

另外，在进行临床实验过程中，所有患者在使用本发明的富马酸二甲酯眼膏或富马酸二甲酯滴眼液后均没有出现任何消化的不良反应及其他不良反应。

评价标准：

治愈：经过治疗后，患者分泌物消失，角膜浸润及水肿情况消退，结膜充血情况消失，真菌培养呈现为阴性，角膜溃疡愈合，经过共聚焦显微镜检查后未见菌丝；

显效：经过治疗后，患者相关检测结果为阴性，各项指标得到改善，仅存在结膜充血或角膜斑翳情况；

有效：经过治疗后，患者相关检查结果呈现阴性，各项指标中仅有1-2项得到改善。

无效：治疗前后各项指标均无变化。

治疗总有效率=（治愈+显效+有效）/总例数×100%。

表1富马酸二甲酯滴眼液在治疗人真菌性角膜炎的应用效果

p值是统计学根据显著性检验方法所得到的，p<0.05为有统计学差异，p<0.01为有显著统计学差异，p<0.001为有极其显著的统计学差异。其含义是样本间的差异由抽样误差所致的概率小于0.05、0.01、0.001。