一种用于减少动物运输应激危害的中药微生态制剂及制备方法

1.本发明涉及兽药技术领域，具体说是一种用于减少动物运输应激危害的中药微生态制剂及制备方法。


背景技术：

2.畜禽运输是畜牧业生产过程中必不可少的一个重要环节,运输过程中的拥挤、颠簸、震动、噪音、温度变化和禁食禁水等复合应激源均可造成动物机体生理紊乱、发病甚至死亡,同时降低肉品质量和动物福利,给畜牧业带来巨大的经济损失。
3.畜禽发生运输应激后，由于机体长期处于应激状态，导致内分泌系统和神经系统功能发生紊乱，从而使机体需要消耗大量的营养物质，机体体质消瘦，且出现贫血和免疫力降低现象，从而容易发生各种疾病，到达新的饲养环境时疾病感染率和发生率明显增加。
4.运输应激是指畜禽机体在运输过程中，由于受到颠簸、环境变化、限饲或禁食以及心理压力等各种应激因素的综合影响，导致机体产生的防御性和适应性反应，从而严重影响畜禽生产。应激原是指能够导致机体发生应激反应的所有刺激性因素，如其属性一般可分成机械性，如创伤；化学性，如毒物；物理性，如噪音、过热、过冷；生物性，如急性感染；心理性，如精神紧张、忧伤、惊恐等。目前，随着畜禽养殖不断朝向集约化发展，主要采取高密度饲养和阶段性饲养方式，生产实践中无法避免运输应激的发生。运输应激能够导致畜禽生产性能降低，引发疾病或者死亡，给养殖者带来巨大的经济损失。
5.正常情况下，畜禽自身具有一定的抵抗应激损害的能力，但由于这种能力非常有限，当应激因子或者应激的累加超过自身的承受范围时，就会从生理过程发展成病理过程，从而在以下几个方面产生危害：
6.生产性能降低。畜禽发生应激时，机体增强对脂肪、碳水化合物、蛋白质等的分解代谢，即需要产生更多的能量用于抵抗应激，如热散发、心跳加快、呼吸加速、不停跑动等，但是这些营养物质原本主要供机体用于生长发育、增重、免疫完善等，从而间接使畜禽的生产性能受到影响，表现出发育不良，成活率降低，导致畜禽增重速度减慢，饲料报酬低，肉品质较差，产量减少，畜产品品质降低。
7.引起应激综合症。导致机体精神萎靡，食欲减退，发生肾皮质肥大，血压升高，心跳加速，生长速度缓慢，使今后的性机能减弱，严重时甚至会由于过度惊恐而发生死亡。免疫抵抗力降低。畜禽发生运输应激时，由于体内分泌的肾上腺素明显增加，导致血中淋巴细胞数量减少。同时，由于机体增强蛋白质分解代谢，导致进行免疫球蛋白生产使用的原料相对减少，从而导致在进行疫苗免疫时，减少抗体生成，降低体内抗体水平，进而造成无法达到预期的免疫效果。
8.诱发多种疾病。运输应激不仅使畜禽的特异性免疫力减弱，还会导致非特异性抗病能力也随之减弱，从而容易引发多种疾病，如慢性呼吸道病、蓝冠病、传染性鼻炎、溃疡性肠炎、滑囊炎、曲霉菌病、禽霍乱等。
9.而目前缓解畜禽应激反应的方式有以下几种：
10.应对措施加强运输管理。畜禽运输前，要对圈舍里面、周围以及运输工具等进行彻底消毒，同时对待运畜禽健康状况进行检查，禁止运输患病畜禽，避免在运输途中导致患病畜禽与健康畜禽之间发生交叉感染。如运输数量选择适合的运输工具，并确保装载密度适宜。运输过程中，要保持较低车速行驶，尽可能减少启动和刹车造成的震动，尽量创造舒适的环境，且要注意缩短运输时间。
11.运输前后，在畜禽饲料或者饮水中添加适量的抗应激添加剂，改善生理机能，使抗应激能力增强。但目前所使用的药物主要是镇静剂，如安定等；参与三羧酸循环的物质，如琥珀酸、苹果酸类；维生素类，如维生素c；缓解酸中毒的药物，如小苏打等；激素类，如肾上腺皮质激素。上述药物多是从单一方面进行调理，药物治疗效果有限，且药物的有效血药浓度持续时间短，在用药过程中需要连续用药，长时间多次给药，容易引起病体耐药，也无法提高畜禽免疫力；因此，如何份服上述存在的技术问题和缺陷成为重点需要解决的问题。


技术实现要素：

12.本发明的发明目的在于克服背景技术中所描述的缺陷，从而提供一种用于减少动物运输应激危害的中药微生态制剂及制备方法。
13.为实现上述发明目的，本发明的技术方案是：一种用于减少动物运输应激危害的中药微生态制剂，所述中药微生态制剂包括复合微生物和中药组合物，其中所述中药组合物包括以下重量份数的组分：党参10-20份、茯苓8-16份、炒白术10-20份、炙甘草3-9份、炒山药10-20份、炒白扁豆10-20份、黄芪10-20份、桂枝8-16份、熟地10-20份、当归8-16份、川芎5-13份、白芍8-16份，仙鹤草10-20份；所述复合微生物包括产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌，活菌数量比为0.5～2.0:0.3～2.0:0.4～2.0，总活菌数≥1
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14.进一步地，所述中药微生态制剂包括复合微生物和中药组合物，其中所述中药组合物包括以下重量份数的组分：党参12-18份、茯苓10-14份、炒白术12-18份、炙甘草5-7份、炒山药12-18份、炒白扁豆12-18份、黄芪12-18份、桂枝10-14份、熟地12-18份、当归10-14份、川芎8-10份、白芍10-14份，仙鹤草12-18份；所述复合微生物包括产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌，活菌数量比为0.7～1.3:0.8～1.2:0.6～1.8，总活菌数≥1
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15.进一步地，所述中药微生态制剂包括复合微生物和中药组合物，其中所述中药组合物包括以下重量份数的组分：党参15份、茯苓12份、炒白术15份、炙甘草6份、炒山药15份、炒白扁豆15份、黄芪15份、桂枝12份、熟地15份、当归12份、川芎9份、白芍12份，仙鹤草15份；所述复合微生物包括产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌，活菌数量比为1～1.5:0.5～1.5:0.8～1.6，总活菌数≥1
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16.制备用于减少动物运输应激危害的中药微生态制剂的方法，所述制备方法按照以下步骤：
17.(1)将保存的产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌的菌液分别以1％的接种量接种于各自的液体培养基中，在38℃下摇动培养过夜，转速为200rpm；
18.(2)按照权利要求1-3任一项所述重量份数称取各中药原料，党参、茯苓、炒白术、炙甘草、炒山药、炒白扁豆、黄芪、桂枝、熟地、当归、川芎、白芍，仙鹤草，并将各中药原料分别进行粉碎过100目筛后均匀混合，作为固体基料；
19.(3)按照每100g固体基料添加20ml培养液的比例，将步骤(2)中的固体基料和步骤(1)得到的产朊假丝酵母培养液、枯草芽孢杆菌培养液、粪肠球菌培养液分别混合，并搅拌均匀，得到各菌种培养液和固体基料的混合物；
20.(4)将步骤(3)得到的混合物分别在38℃条件下密闭培养24小时以上，并测定各菌种培养物的活菌数量，保证各菌种培养物的活菌数量≥1
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21.(5)将步骤(4)的各菌种培养物分别在45℃下干燥48小时，粉碎分装，分别制成各菌种的制剂；
22.(6)将步骤(5)中得到的各菌种的制剂按照活菌数量产朊假丝酵母：枯草芽孢杆菌：粪肠球菌为1～1.5:0.5～1.5:0.8～1.6的数量比进行混合并搅拌均匀，即得中药微生态制剂，所得中药微生态制剂的活菌总数≥1
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23.本发明的用于减少动物运输应激危害的中药微生态制剂及制备方法的有益效果：
24.本发明的用于减少动物运输应激危害的中药微生态制剂及制备方法，本发明中药微生态制剂能够促进减少运输应激造成的生理生化指标波动，能显著提高热应激性、抗疲劳性、耐缺氧性；有利于提高免疫力，降低腹泻率，减少死亡率，提高养殖效益。
具体实施方式
25.实施例1
26.中药微生态制剂包括复合微生物和中药组合物，其中所述中药组合物包括以下重量份数的组分：党参10份、茯苓9份、炒白术19份、炙甘草7份、炒山药12份、炒白扁豆15份、黄芪17份、桂枝13份、熟地10份、当归12份、川芎11份、白芍14份，仙鹤草19份；所述复合微生物包括产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌，活菌数量比为1.3:1.1:1.0，总活菌数≥1
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27.制备用于减少动物运输应激危害的中药微生态制剂的方法，所述制备方法按照以下步骤：
28.(1)将保存的产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌和粪肠球菌的菌液分别以1％的接种量接种于各自的液体培养基中，在38℃下摇动培养过夜，转速为200rpm；
29.(2)按照上方重量份数称取各中药原料，党参、茯苓、炒白术、炙甘草、炒山药、炒白扁豆、黄芪、桂枝、熟地、当归、川芎、白芍、仙鹤草，并将各中药原料分别进行粉碎过100目筛后均匀混合，作为固体基料；
30.(3)按照每100g固体基料添加20ml培养液的比例，将步骤(2)中的固体基料和步骤(1)得到的产朊假丝酵母培养液、枯草芽孢杆菌培养液、粪肠球菌培养液分别混合，并搅拌均匀，得到各菌种培养液和固体基料的混合物；
31.(4)将步骤(3)得到的混合物分别在38℃条件下密闭培养24小时以上，并测定各菌种培养物的活菌数量，保证各菌种培养物的活菌数量≥1
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32.(5)将步骤(4)的各菌种培养物分别在45℃下干燥48小时，粉碎分装，分别制成各菌种的制剂；
33.(6)将步骤(5)中得到的各菌种的制剂按照活菌数量产朊假丝酵母：枯草芽孢杆菌：粪肠球菌为活菌数量比按上方的数量比进行混合并搅拌均匀，即得中药微生态制剂，所得中药微生态制剂的活菌总数≥1
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34.实施例2
35.中药微生态制剂包括复合微生物和中药组合物，其中所述中药组合物包括以下重量份数的组分：党参14份、茯苓15份、炒白术17份、炙甘草3份、炒山药16份、炒白扁豆15份、黄芪13份、桂枝16份、熟地12份、当归12份、川芎10份、白芍8份，仙鹤草17份；所述复合微生物包括产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌，活菌数量比为1.0:1:1.4，总活菌数≥1
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36.制备方法同实施例1。
37.实施例3
38.中药微生态制剂包括复合微生物和中药组合物，其中所述中药组合物包括以下重量份数的组分：党参18份、茯苓9份、炒白术13份、炙甘草8份、炒山药20份、炒白扁豆10份、黄芪19份、桂枝8份、熟地10份、当归11份、川芎13份、白芍15份，仙鹤草14份；所述复合微生物包括产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌，活菌数量比为1.1:0.9:1.4，总活菌数≥1
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39.制备方法同实施例1。
40.实施例4
41.中药微生态制剂包括复合微生物和中药组合物，其中所述中药组合物包括以下重量份数的组分：党参12份、茯苓8份、炒白术11份、炙甘草8份、炒山药13份、炒白扁豆17份、黄芪15份、桂枝12份、熟地19份、当归16份、川芎12份、白芍12份，仙鹤草13份；所述复合微生物包括产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌，活菌数量比为1.2:0.9:1.3，总活菌数≥1
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42.制备方法同实施例1。
43.实施例5
44.中药微生态制剂包括复合微生物和中药组合物，其中所述中药组合物包括以下重量份数的组分：党参13份、茯苓9份、炒白术14份、炙甘草7份、炒山药17份、炒白扁豆12份、黄芪18份、桂枝14份、熟地17份、当归12份、川芎12份、白芍9份，仙鹤草14份；所述复合微生物包括产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌，活菌数量比为1.3:1:1.1，总活菌数≥1
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45.制备方法同实施例1。
46.实施例6
47.中药微生态制剂包括复合微生物和中药组合物，其中所述中药组合物包括以下重量份数的组分：党参13份、茯苓13份、炒白术14份、炙甘草6份、炒山药13份、炒白扁豆14份、黄芪16份、桂枝13份、熟地15份、当归10份、川芎10份、白芍15份，仙鹤草16份；所述复合微生物包括产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌，活菌数量比为1.4:0.9:1.1，总活菌数≥1
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48.制备方法同实施例1。
49.实施例7
50.中药微生态制剂包括复合微生物和中药组合物，其中所述中药组合物包括以下重量份数的组分：党参15份、茯苓12份、炒白术15份、炙甘草6份、炒山药15份、炒白扁豆15份、黄芪15份、桂枝12份、熟地15份、当归12份、川芎9份、白芍12份、仙鹤草15份；所述复合微生
物包括产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌，活菌数量比为1.2:1:1.2，总活菌数≥1
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51.制备方法同实施例1。
52.实施例8
53.本发明根据中药理论以及结合小白鼠的生长特点对配方进行筛选。本发明中由于实验数据较多、对配方进行多次调整并进行实验、在此仅列出多组疗效较高组方并与本发明配方进行对比。
54.配方1：党参15份、茯苓12份、炒白术15份、炙甘草6份、炒山药15份、炒白扁豆15份、黄芪15份、桂枝12份、熟地15份、当归12份、川芎9份。
55.配方2：党参15份、茯苓12份、炒白术15份、炙甘草6份、炒山药15份、炒白扁豆15份、黄芪15份、桂枝12份、熟地15份、白芍12份、仙鹤草15份。
56.配方3：党参15份、茯苓12份、炒白术15份、炙甘草6份、炒山药15份、炒白扁豆15份、黄芪15份、当归12份、川芎9份、白芍12份、仙鹤草15份。
57.配方4：党参15份、茯苓12份、炒白术15份、炙甘草6份、炒山药15份、桂枝12份、熟地15份、当归12份、川芎9份、白芍12份、仙鹤草15份。
58.配方5：党参15份、茯苓12份、炒白术15份、炒白扁豆15份、黄芪15份、桂枝12份、熟地15份、当归12份、川芎9份、白芍12份、仙鹤草15份。
59.配方6：党参15份、炙甘草6份、炒山药15份、炒白扁豆15份、黄芪15份、桂枝12份、熟地15份、当归12份、川芎9份、白芍12份、仙鹤草15份。
60.配方7：茯苓12份、炒白术15份、炙甘草6份、炒山药15份、炒白扁豆15份、黄芪15份、桂枝12份、熟地15份、当归12份、川芎9份、白芍12份、仙鹤草15份；采用产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌，二者活菌数量比为1.2:1，总活菌数≥1
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61.配方8：茯苓12份、炒白术15份、炙甘草6份、炒山药15份、炒白扁豆15份、黄芪15份、桂枝12份、熟地15份、当归12份、川芎9份、白芍12份、仙鹤草15份；采用产朊假丝酵母、粪肠球菌，二者活菌数量比为1:1，总活菌数≥1
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62.配方9：茯苓12份、炒白术15份、炙甘草6份、炒山药15份、炒白扁豆15份、黄芪15份、桂枝12份、熟地15份、当归12份、川芎9份、白芍12份、仙鹤草15份；采用产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌，三者活菌数量比为1.2:1:1.2，总活菌数≥1
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63.配方10：党参15份、茯苓12份、炒白术15份、炙甘草6份、炒山药15份、炒白扁豆15份、黄芪15份、桂枝12份、熟地15份、当归12份、川芎9份、白芍12份；采用产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌，三者活菌数量比为1.2:1，总活菌数≥1
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64.配方11：党参15份、茯苓12份、炒白术15份、炙甘草6份、炒山药15份、炒白扁豆15份、黄芪15份、桂枝12份、熟地15份、当归12份、川芎9份、白芍12份；采用产朊假丝酵母、粪肠球菌，三者活菌数量比为1:1，总活菌数≥1
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65.配方12：党参15份、茯苓12份、炒白术15份、炙甘草6份、炒山药15份、炒白扁豆15份、黄芪15份、桂枝12份、熟地15份、当归12份、川芎9份、白芍12份；采用产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌，三者活菌数量比为1.2:1:1.2，总活菌数≥1
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66.配方13：党参15份、茯苓12份、炒白术15份、炙甘草6份、炒山药15份、炒白扁豆15份、黄芪15份、桂枝12份、熟地15份、当归12份、川芎9份、白芍12份、仙鹤草15份。
67.配方14：党参15份、茯苓12份、炒白术15份、炙甘草6份、炒山药15份、炒白扁豆15份、黄芪15份、桂枝12份、熟地15份、当归12份、川芎9份、白芍12份、仙鹤草15份；采用产朊假丝酵母、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌，三者活菌数量比为1.2:1:1.2，总活菌数≥1
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68.对比组1：使用等计量的抗应激添加剂，本实验采用维生素c。
69.对比组2：使用等计量的生理盐水。
70.实验方法：
71.实验选择昆明小鼠160只，体重35
‑‑
40g，由武汉鼠贝利生物科技有限公司提供的，饲养观察3
‑‑
5d确定健康后用于实验。按照“胎次一致、品种相同、体重相近”的原则、随机均分成16组、分别使用上述1-14配方中的添加剂以及两组对比组、每组10只。试验在小白鼠养殖基地进行。饲养管理一致，试验小鼠全部饲养在河南中医药大学动物实验中心，一天喂食2次、记量不限量、自由饮水。预饲期为7d。
72.试验期：预饲期为7d、正式试验5d、对小白鼠进行编号、早饲前空腹逐只过电子秤称个体重，将小鼠放置运输小车上，以时速30km/h，每天运输1小时，运输5d，同时灌胃5d，在运输前灌胃，试验组与对照组均于早饲前空腹分别用电子秤称始重和末重。
73.1、效果与适口性
74.据观察，试验组在整个试验期内，其每天消耗食物量较多，也未出现精神萎靡状态；对照组在整个每天消耗食物量减少，且出现精神萎靡状态；这表明中药添加剂和中药微生态制剂对运输中的动物应激反应是有减轻作用的；在采食速度和日采食量上、试验组比对照组采食速度稍快，这表明添加中药添加剂和中药微生态剂的适口性好，可增进小白鼠食欲。
75.2、增重效果
76.试验小白鼠增重效果详见表1。配方14即本发明配方的微生态制剂，可见、试验全期日增重试验中、日增重达2g/d、差异显著。
77.表1试验小白鼠增重情况
78.组别始重(g)末重(g)日增重(g/d)配方137.339+1.7配方235.237.1+1.9配方331.833.8+2配方438.240.2+2配方535.437.3+1.9配方639.140.8+1.7配方739.842+2.2配方832.835.1+2.3配方930.833.4+2.6配方1032.234.3+2.1配方113840.3+2.3配方1236.839.5+2.7配方1335.738.2+2.5配方1437.940.9+3
对比组139.541.3+1.8对比组236.435.7-0.7
79.由表1可知，配方14，即本发明中药完整组方，复配三种菌发酵的微生态添加剂对试验小白鼠的日增重改善明显，能显著的提高日增重，当缺少本发明中的任一原料时、或者缺少本发明的任一菌种时，日增重虽然也有所提高，但是效果不明显。
80.实施例9
81.为进一步说明本发明中药微生态制剂对运输应激模型小鼠促生长和预防腹泻的影响，以下提供动物试验作为说明。以下所涉及本发明中药微生态制剂皆按照实施例7所制备。
82.1材料
83.1.1实验动物
84.健康昆明小鼠150只，体重35
‑‑
40g,由武汉鼠贝利生物科技有限公司提供的，饲养观察1周后，正式实验5d。
85.1.2饲料
86.全价营养颗粒饲料,由武汉鼠贝利生物科技有限公司提供。
87.1.3药品
88.项目组自行研制的配方1-14中药微生态制剂，主要成分为党参、茯苓、炒白术、炒白扁豆等。
89.1.4主要仪器
90.超净工作台(型号为bbs-ddc型),山东博科生物产业有限公司；电热恒温水浴锅，苏州威尔实验用品有限公司生产；立式压力蒸汽灭菌器(型号为bkq-b120ii),爱来宝(济南)生物技术有限公司生产；真空干燥箱(型号为dzf-6050)，上海一恒科技有限公司生产。
91.2测定项目及方法
92.(1)小白鼠抗热应激实验：选取昆明小白鼠50只，雌雄各半随机分为5组，每组10只，即中药微生态制剂高、中、低剂量组、标准量的维生素c和生理盐水对照组,每组分别灌服0.4％、0.2％、0.1％本添加剂的水溶液、0.2％的维生素c和生理盐水。日灌服1次，每次灌服剂量为0.2ml/10g，连续给药3d。给药结束后，将小白鼠逐个放入53℃恒温鼓风干燥箱中，观察并记录小白鼠死亡时间。
93.(2)小白鼠负荷游泳实验：选取雄性昆明小白鼠50只，随机分为5个实验组，每组10只，即中药微生态制剂高、中、低剂量组、标准量的维生素c和生理盐水对照组，每组分别灌服0.4％、0.2％、0.1％本添加剂的水溶液、0.2％的维生素c和生理盐水。每日灌胃1次，每次灌药体积为0.1ml/10kg连续灌药5d。于末次灌胃30min后，将小白鼠尾根部负荷3％体重的铅块，然后将其放入水深30cm、水温25℃的游泳箱中,观察并记录小白鼠开始游泳至死亡的时间。
94.(3)小白鼠常压耐缺氧实验:选取雄性昆明种小白鼠50只，随机分为5个实验组，每组10只，即中草药饲料添加剂高、中、低剂量组、标准量的维生素c和生理盐水对照组每组分别灌服0.4％、0.2％、0.1％本添加剂的水溶液、0.2％的维生素c和生理盐水。每日灌胃1次，每次灌药体积为0.1ml/10kg，连续灌药5d。末次灌胃1h后，取250ml广口瓶，加入碳酸钙30g，每瓶放入1只小白鼠将其盖用凡士林密封，观察并记录每只小白鼠的死亡时间。
95.3统计分析：试验数据采用spss 22.0统计软件录入，数据采用平均数
±
标准差形式，对各组数据进行单因素方差分析，各组间数据的多重比较采用lsd法，以p《0.05作为显著性判断标准。
96.5结果与分析
97.4.1中药微生态制剂对运输应激模型小鼠抗运输应激的影响
98.表1为小白鼠在53℃的环境中存活的时间。由表1可以看出，高剂量组和中剂量组的2组小白鼠存活时间很长，与生理盐水组相比，均超过1100s，低剂量组的和0.2％的维生素c组的2组小白鼠存活时间较长，与生理盐水组相比，均超过1000s，生理盐水组的1组小白鼠存活时间较短，低于1000s。
99.表1小白鼠抗运输应激实验结果(s)
100.分组剂量(g/ml)53℃时小鼠存活时间(s)生理盐水组0％986.40
±
43.55维生素c组0.2％1057.21
±
37.53低剂量组0.1％1062.17
±
47.35中剂量组0.2％1106.42
±
40.07高剂量组0.4％1148.51
±
32.13
101.注:与生理盐水组对比，其显著性差异为*p《0.05，**p《0.01。
102.由表1可见，与生理盐水对照组相比较，中药微生态制剂高、中剂量组的2组小白鼠存活时间很长，与生理盐水组相比，均超过1100s，低剂量组的和0.2％的维生素c组的2组小白鼠存活时间较长，与生理盐水组相比，均超过1000s，生理盐水组的1组小白鼠存活时间较短，低于1000s，说明本项目所研制的中药微生态制剂具有显著的抗运输应激作用。
103.5.2中药微生态制剂对运输应激模型小鼠体抗疲劳作用的影响
104.表2为小白鼠在尾根部负荷3％体重的铅块的情况下，在水深30cm、水温25℃的游泳箱中存活的时间。由表2可以看出，高剂量组的小白鼠存活时间很长，与对照组相比，差异明显(p＜0.01)，中剂量组的1组小白鼠存活时间较长，显著高于对照组(p＜0.05)，0.2％的维生素c组和低剂量组的2组小白鼠存活时间较短，但差异不显著(p》0.05)。
105.表2小白鼠负荷游泳实验结果(cm)
106.分组剂量(g/ml)游泳时间(s)生理盐水组0％345.44
±
59.23维生素c组0.2％361.27
±
57.87低剂量组0.1％368.12
±
54.76中剂量组0.2％395.7
±
56.22*高剂量组0.4％438.00
±
46.69**
107.注:与生理盐水组对比，其显著性差异为*p《0.05，**p《0.01。
108.由表2可见，与生理盐水对照组相比较，中药微生态制剂高剂量组差异极显著(p《0.01)，中药微生态制剂中剂量组差异显著(p《0.05)，中药微生态制剂低剂量组和维生素c组存活时间较短，但差异不显著(p》0.05)，中草药高、中剂量组都能延长小鼠负重游泳时间，说明本项目所研制的中药微生态制剂具有抗疲劳作用。
109.5.3中药微生态制剂对运输应激模型小鼠耐缺氧能力的影响
110.表3为小白鼠在密闭的环境中存活的时间。由表3可以看出，高剂量组的小白鼠存活时间很长，与生理盐水组相比，均超过150s，中剂量组、低剂量组和维生素c组的3组小白鼠存活时间较短，与生理盐水组相比，略高于生理盐水组。
111.表3小白鼠常压耐缺氧实验
112.分组剂量(g/ml)53℃时小鼠存活时间(s)生理盐水组0％140.29.
±
15.13维生素c组0.2％143.18
±
19.56低剂量组0.1％145.21
±
13.31中剂量组0.2％146.34
±
12.04高剂量组0.4％151.45
±
12.06
113.由表3可见，与生理盐水对照组相比较，中药微生态制剂高剂量组的小白鼠存活时间很长，与生理盐水组相比，均超过150s，中剂量组、低剂量组和维生素c组的3组小白鼠存活时间较短，与生理盐水组相比，存活时间略高于生理盐水组，中药微生态制剂高剂量组能延长小鼠负重游泳时间，说明本项目所研制的中草药饲料添加剂具有良好的耐缺氧能力。
114.本实验研究表明本发明所研制的中药微生态制剂能够显著提高小白鼠抗应激能力，在畜禽动物饮食中添加本发明所研制的中草药，可显著提高畜禽动物的抗应激能力，抗运输应激、抗疲劳和耐缺氧，减少畜禽动物运输途中产生的应激反应，且能提高畜禽动物的免疫力。
115.实施例10
116.1、实验动物及处理
117.选用30头体重相近2月龄健康荷斯坦奶公犊作为研究对象，试验地点在河南农业大学试验牛场。试验分为空白组、运输应激组和中药微生态制剂组，每组随机均分10头试验牛，其中中药微生态制剂组在预试期开始至正式试验结束每天在日粮中添加配方13的中药微生态制剂10g/头天，运输应激组试验牛的饲料中不添加中药微生态制剂。
118.对各组试验牛进行统一饲养管理，预试期7天，观察试验牛只的健康状况，统计发病率等相关指标。正式试验第1天，除空白组外，其他两组试验牛每天用运输车在公路(包括红绿灯停车和颠簸路段)上进行4h的60km/h公路运输，第7d采集尾静脉acd抗凝血10ml检测。
119.本试验奶公犊饲料采用农标普瑞纳公司1112犊牛颗粒饲料，营养成分含量如下：干物质：86.4％、粗脂肪：2.5％、粗蛋白：16.5％、粗纤维：12.0％、磷:0.40％、钙磷比:1.85:1、赖氨酸:0.55％、食盐：0.49％。试验牛只均在同一栋牛舍，分3个圈进行散栏饲喂，采用日饲喂3次、自由饮水的饲养方案，试验期间，观察犊牛的采食情况，保证中药微生态制剂犊牛按量采食，并根据需要随时补充颗粒饲料，提供优质苜蓿草供犊牛自由采食。
120.2方法
121.2.1直肠温度的测定
122.在运前2h、运输10h、运达2h、运达后24h、运达后7d和运达后14d采用兽用体温计测定全部奶公犊的直肠温度。
123.2.2体重和平均日增重的测定
124.在运达24h、运达7d、运达14d和运达30d早上六点，于空腹状态下用电子磅秤测定
试验奶公犊的体重，并计算平均日增重，其中平均日增重＝(试验期末体重-试验期初体重)/试验期天数，
125.2.3直肠ph和肠道微生物区系的测定
126.运输后第7天，采用直插式精密ph计插进奶公犊直肠进行ph值检测。同时，用无菌玻璃棒采集犊牛直肠中适量的肠道内容物，称取0.5g后置于10ml无菌ep管，采用无菌生理盐水倍比稀释，根据预试验确定的最终稀释比例为1
×
10-6
，最后吸取上层0.1ml稀释液分别均匀涂布于总细菌、大肠杆菌和乳酸杆菌的分离培养基，采用37℃恒温有氧培养，总细菌和大肠杆菌培养基培养24h，乳酸杆菌培育36h，之后计数。每克肠道微生物菌落数＝lg[(菌落平均数
×
稀释倍数
×
10ml/0.1ml)/0.5g]。
[0127]
2.4血液免疫学指标的测定
[0128]
对采集的acd抗凝血，2000r/min离心15min后，分离血浆。抗凝血和血浆样品均送至河南中医药大学第一附属医院检验科，检测白细胞数、红细胞数、igg和甲状腺素t3和t4指标。
[0129]
2.5腹泻和其他发病率
[0130]
试验期间每日观察犊牛排粪情况,记录发病个体及持续时间,以试验组别为单位计算腹泻率和腹泻指数，如下：
[0131]
腹泻率＝奶公犊腹泻头数/(头数
×
天数)
×
100％。
[0132]
腹泻指数＝奶公犊粪便评分之和/供试牛的总头数，
[0133]
腹泻程度评分标准为：粪便成形稀软，评分为1分；粪便不成形较稀，评分为2分；水样稀粪，评分为3分。腹泻指数评分与腹泻情况成正比。
[0134]
此外，在试验期间，统计奶公犊发烧及呼吸道等其他疾病的发病率，其他发病率＝发病头数/(总头数
×
天数)
×
100％。
[0135]
2.6数据分析
[0136]
数据用平均数
±
标准差记录，采用spss 22.0软件单因素方差分析方法对各组数据进行比较,显著性判定标准为，p《0.05为差异显著，检查方差齐性后，对各组数据采用lsd法多重比较。
[0137]
3结果与分析
[0138]
3.1中药微生态制剂对运输应激奶公犊直肠温度的影响
[0139]
由表1可以看出，运输应激组和中药微生态制剂组平均直肠温度在运输10h、运达2h和运达后24h与空白组均差异显著(p《0.05)，但是在运达后7d和14d，中药微生态制剂组与空白组差异不显著(p》0.05)，运达后7d，运输应激平均直肠温度仍显著高于空白组和中药微生态制剂组(p《0.05)。
[0140]
表1中药微生态制剂对运输应激奶公犊直肠温度的影响
[0141][0142]
注：组间比较小写字母不同表示p《0.05，大写字母不同表示p《0.01。下表同。
[0143]
3.2中药微生态制剂对运输应激奶公犊平均日增重的影响
[0144]
由表2可以看出，运达后24h，三个组别的体重无显著差异(p》0.05)，但运输应激组在运达1-7d、7-14d和14-30d的平均日增重显著低于空白组和中药微生态制剂组(p《0.05)。
[0145]
表2中药微生态制剂对运输应激奶公犊平均日增重的影响
[0146]
组别运达24h体重运达1-7d平均日增重运达7-14d平均日增重运达14-30d平均日增重空白组178.32
±
9.580.76
±
0.09a0.92
±
0.11a0.94
±
0.12a运输应激组179.32
±
10.510.46
±
0.07b0.62
±
0.06b0.75
±
0.11b中药微生态制剂组175.76
±
11.340.65
±
0.11a0.89
±
0.13a0.92
±
0.14a[0147]
3.3中药微生态制剂对运输应激奶公犊直肠ph值和肠道微生物区系的影响
[0148]
表3奶公犊直肠ph值和肠道微生物菌落数的检测结果
[0149][0150]
注：同列数字各个指标数值肩标不同小写字母表示差异显著(p《0.05)，肩标相同小写字母表示差异不显著(p》0.05)。
[0151]
表3可以看出，与空白组相比，空白组、运输应激组和中药微生态制剂组肠道ph值、总细菌、大肠杆菌及乳酸杆菌数未出现显著差异(p》0.05)，但中药微生态制剂组与运输应激组比较，总细菌和大肠杆菌数明显低于运输应激组，乳酸杆菌数稍高于运输应激组。
[0152]
3.4中药微生态制剂对运输应激奶公犊免疫学指标影响
[0153]
表4奶公犊免疫学指标的检测结果
[0154][0155]
注：同列数字各个指标数值肩标不同小写字母表示差异显著(p《0.05)，肩标相同小写字母表示差异不显著(p》0.05)。
[0156]
见表4，可以看出，空白组、运输应激组、中药微生态制剂组试验牛的白细胞数和红细胞数均差异不显著(p》0.05)，但运输应激组试验牛的白细胞数相对较高。中药微生态制剂组igg含量显著高于运输应激组和空白组(p《0.05)。运输应激组甲状腺素t3和t4均显著高于空白组和中药微生态制剂组(p《0.05)，中药微生态制剂组和空白组差异不显著(p》0.05)。
[0157]
3.5中药微生态制剂对运输应激奶公犊发病率的影响
[0158]
表5奶公犊发病率的统计结果(％)
[0159]
组别空白组运输应激组中药微生态制剂组腹泻率4.2820.008.57腹泻指数4.2824.2912.86
其他发病率07.430
[0160]
见表5，可以看出，运输应激组的腹泻率、腹泻指数和其他发病率最高，中药微生态制剂组腹泻率和腹泻指数稍高于空白组。
[0161]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。